肠黏膜屏障功能检测研究进展

・综述与讲座・3通讯作者,E 2mail:meiqiaomq@yahoo 肠黏膜屏障功能检测研究进展刘晓昌,梅　俏3,许建明(安徽医科大学第一附属医院,安徽合肥230022) [关键词]　肠黏膜;屏障;实验室技术和方法 [中图分类号]　R446.9 [文献标识码]　A [文章编号]　10022266X (2009)1620106202 肠黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障等多层含义。

在饥饿和营养不良、创伤、危重疾病、严重感染或炎症等情况下,肠黏膜的结构和功能可能受到损伤,导致肠黏膜屏障功能障碍、肠道细菌移位、内毒素入血,诱发或加重肠道局部或全身性炎症、免疫反应,严重者可导致多器官功能不全的发生。

在某些疾病尤其是多器官功能不全治疗的早期,采取措施保护肠黏膜屏障功能,有助于控制病情,提高疗效。

早期有效治疗的前提是对肠黏膜屏障有充分的认识,能早期对肠黏膜屏障功能进行检测并正确诊断。

因此本文主要从肠黏膜屏障的四个组成部分分别讨论肠黏膜屏障功能的检测。

1　机械屏障　机械屏障由肠道黏液层、肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成。

肠黏膜上皮细胞是肠屏障中最重要的部分,因此,目前主要针对肠黏膜上皮细胞进行一系列检测。

1.1　肠通透性检测　口服或静脉给予示踪物,然后根据示踪物通过肠黏膜上皮细胞的剂量大小反映肠黏膜的通透性。

用于检测肠黏膜通透性的示踪物主要有放射性同位素类、辣根过氧化物酶(HRP )和蛋白质类、聚乙二醇(PEGs )及糖类等四类。

放射性同位素类如51铬—乙二胺四乙酸(51Cr 2E D 2T A )、99m锝—二乙三胺五乙酸(99mTc 2DTP A )和125碘—白蛋白(125I 2albu m in ),可口服后用计数仪测量尿液中示踪剂的放射性活度。

但由于示踪剂具有放射性,不宜在同一患者身上重复使用,尤其是儿童;另外,其T 1/2短,标本不易保存,临床应用受到限制。

HRP 目前仅适用于体外肠道通透性的测定,不适合用于临床。

蛋白质示踪剂因作为异种蛋白质有可能因刺激机体免疫系统而影响肠道通透性,同时其实验操作和分析比较复杂,临床应用也受到限制[1]。

PEGs 是次乙基乙二醇多聚体的混合物,由于对测定结果的分析和计算相当复杂,结果也存在着较大的差异,并且对其渗透途径尚不明确,因此很少用于临床。

用于检测的糖类主要是单糖和双糖。

口服一种糖,其从尿中的排泄受到除黏膜通透性以外的多种因素如胃排空时间、肠蠕动强弱、肠黏膜表面积大小、心输出量、肾排出量和尿液收集的误差等影响。

因此,目前多采用同时测定一种单糖和一种双糖,使肠内外影响因素相同,结果以尿中二者比值表示可以消除以上因素的影响。

乳果糖和甘露醇在体内不代谢,受肠腔内渗透压影响较小,从肠腔吸收人血后由尿中排除,可留取一定时间内的尿液进行检测,并且尿乳果糖和甘露醇比值(L /M )与绒毛萎缩之间有较好的相关性[2]。

该试验具有操作简单、对机体无损伤以及对肠道损伤敏感等优点,因此目前临床检测肠黏膜通透性最常用L /M 。

糖类含量可通过比色法、酶学法、气相色谱法、高压液相色谱法检测。

前两种方法易受尿中其他复合物干扰,结果不够准确,但临床应用方便;气相色谱法准确性好,但样品处理过程复杂,不适于临床应用;而高压液相色谱法能快速、准确、灵敏地检测出尿中的乳果糖和甘露醇的含量,操作方便,且能同时检测几种糖类,适于临床应用[3]。

近年来国内外出现用带脉冲电流的高压液相色谱仪检测,其灵敏度和特异性更高,但对仪器和操作的要求高[4]。

1.2　肠黏膜形态学检查　肠黏膜形态学检查有一定的创伤性,但通过一般光镜等可以直接观察黏膜上皮细胞形态改变、绒毛厚度、隐窝深度等,可直接从结构上反映肠黏膜通透性的改变。

透射电镜或扫描电镜可观察肠黏膜上皮细胞的超微结构改变并可以进行半定量分析如观测微绒毛、细胞间连接、细胞内线粒体等改变情况。

免疫组织化学方法或分子生物学方法可对相关蛋白成份如结构蛋白(JAM )和调节蛋白(E 钙黏素、肌动蛋白、肌球蛋白)等进行定性或定量分析,是反映肠黏膜屏障功能可靠的指标,因此,已被广泛用于动物和细胞实验。

1.3　血液指标检测　主要包括血浆内毒素水平、D 2乳酸含量、二胺氧化酶(DAO )活性等检测。

血浆内毒素水平可在一定程度上反映肠通透性的改变。

目前多检测外周血内毒素,但因为经过门静脉循环的影响,外周血中内毒素浓度不高。

门静脉血内毒素测定方法较准确可靠,但多用于动物实验,临床应用仅限于一些接受特殊手术患者[5]。

所以建立稳定可靠、灵敏的内毒素测定方法才有意义。

D 2乳酸是细菌代601　山东医药2009年第49卷第16期　谢、裂解的产物,肠缺血等原因致肠黏膜上皮细胞损伤,细胞间紧密连接破坏,肠通透性增加,肠腔中的D2乳酸经受损黏膜入血,故测定血中D2乳酸含量可反映肠黏膜损伤程度和肠通透性变化[6]。

有报道血浆D2乳酸含量与肠黏膜损伤评分呈显著正相关[7]。

血浆DAO是肠黏膜绒毛细胞中具有高度活性的细胞内酶,以空肠、回肠活性最高。

血浆DAO活性增高提示有肠屏障破坏,可通过比色法或放射活性法测定,前者操作简单,结果稳定性好,但灵敏度低。

后者灵敏度较高,但试剂有放射性,临床应用受限[8]。

2　免疫屏障　免疫屏障主要由肠道免疫系统的细胞群构成,包括肠相关淋巴组织和弥散免疫细胞。

前者主要指分布于肠道的集合淋巴小结,是免疫应答的诱导和活化部位;后者是肠黏膜免疫的效应部位。

分泌型I g A(sI g A)则是胃肠道和黏膜表面的主要体液免疫成分和效应分子,是防御病菌在肠道黏膜黏附和定植的第一道防线。

目前免疫功能检测主要包括以下几方面:①肠上皮内淋巴细胞(I E L)计数:可反映黏膜细胞免疫功能的变化。

②固有层巨噬细胞表达水平:CD68系巨噬细胞标记性分子,用抗CD68抗体作为一抗进行免疫组化观察,可检测巨噬细胞的分布规律和数量,计算CD68+细胞的面积百分比,可作为肠黏膜巨噬细胞水平的量化指标[9]。

③sI g A表达水平:可量化反映肠道黏膜浆细胞分泌sI g A的能力[10]。

有报道可通过检测粪便中sI g A含量来反映肠道黏膜免疫功能[11],但其敏感性有待于进一步提高。

3　生物屏障　生物屏障由共同寄居在肠腔内或定植于肠黏膜表面的肠道常驻菌群形成。

正常情况下,肠黏膜表面生长着大量的厌氧菌,如双歧杆菌等可通过黏附作用与肠上皮紧密结合,形成菌膜屏障,它们能够抵御和排斥外源性致病菌的入侵,并产生短链脂肪酸、醋酸、乳酸等为肠黏膜细胞提供营养成分,降低肠道pH值,激活肠道免疫系统,对维持肠屏障功能起着重要作用。

应用粪便细菌培养、粪便球杆菌比例检查或肠杆菌基因重复一致序列PCR(ER I C2PCR)指纹图动态监测肠道菌群尤其是双歧杆菌等厌氧菌的变化,能够反映肠道黏膜生物屏障功能。

4　化学屏障　化学屏障由胃肠道分泌的胃酸、胆汁、各种消化酶、溶菌酶、黏多糖等化学物质及肠道寄生菌产生的抑菌物质组成。

胃酸能杀灭肠道的细菌,抑制细菌在胃肠道上皮的黏附和定植。

胆酸可降解内毒素分子,防止其经肠吸收,胆盐缺乏可引内毒素血症。

溶菌酶能破坏细菌的细胞壁,使细菌裂解,黏液中含有的补体成分可增加溶菌酶及免疫球蛋白的抗菌作用,因此化学屏障功能检测和机械屏障同样具有重要的临床意义,但目前相关检测研究较少。

5　反映肠道屏障功能的其他指标　肠黏膜屏障功能损伤也可用细菌移位来表示,有研究表明,肠黏膜通透性增高与细菌移位率呈正相关[12]。

而细菌移位与全身感染有关,因此早期诊断血液中的细菌感染具有重大的临床意义。

细菌移位常用的诊断方法有细菌培养、荧光或特殊质粒标记细菌示踪法、聚合酶链反应(PCR)法等。

PCR法检测到血液中肠源性细菌,可间接反映黏膜屏障功能的异常。

综上所述,肠黏膜屏障功能的实验室检测是肠黏膜功能障碍诊断的重要依据,其中又以机械屏障功能检测最为重要,方法敏感性和特异性高,操作简单,但用于诊断时必须结合临床实际情况综合考虑,如判断有无导致肠黏膜屏障功能障碍疾病的存在以及肠黏膜屏障功能改变后的临床症状变化,否则易误诊。

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