三代基因组编辑技术
CRISPR-Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估
Abstract: The third generation of CRISPR/Cas9-mediated genome editing technology has been successfully applied to genome modification of various species including animals, plants and microorganisms. How to improve the efficiency of CRISPR/Cas9 genome editing and reduce its off-target effects has been extensively explored in this field. Using sgRNA (Small guide RNA) with high efficiency and specificity is one of the critical factors for successful genome editing. Several software have been developed for sgRNA design and/or off-target evaluation, which have advantages and disadvantages respectively. In this review, we summarize characters of 16 kinds online and standalone software for sgRNA design and/or off-target evaluation and conduct a comparative analysis of these different kinds of software through developing 38 evaluation indexes. We also summarize 11 experimental approaches for testing genome editing efficiency and off-target effects as well as how to screen highly efficient and specific sgRNA.
基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN
基因组编辑三大技术：CRISPR、TALEN和ZFN最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。
大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。
区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。
在过去，如果你想在模式生物中进行复杂的基因组修饰，你几乎只能选择小鼠。
首先，你要设计一个打靶载体，将其引入小鼠胚胎干细胞，并将这些经过修饰的细胞注射到小鼠囊胚。
接着是孕育、出生、筛选，等待所需的幼崽成长到性成熟，交配和杂交，之后是更多孕育、更多筛选，一直下去。
复杂的项目也许需要一年或更长时间才能完成。
它几乎只对小鼠起作用。
原因还不是很清楚，也许小鼠胚胎干细胞有着特别活跃的同源重组系统。
大鼠和人类则不是这样。
不过好消息是，最近出现的新工具让研究人员能够在几乎任何物种中实现精确的修饰，有着核苷酸水平的精确度，也有着令人难以置信的速度。
大部分是在特定的位置引入双链DNA断裂，然后由细胞进行修复。
区别在于如何引入断裂，以及新序列靶定的难易程度。
锌指核酸酶（ZFN）第一个使用定制DNA核酸内切酶的基因组编辑策略就是锌指核酸酶（zinc-finger nucleases，简称ZFN）。
锌指蛋白是转录因子；每个指模块识别3-4个碱基的序列，将这些模块混合搭配，研究人员或多或少能靶定他们希望的任何序列。
Sigma-Aldrich公司将ZFN技术商业化，推出CompoZr ZFN试剂平台。
ZFN是异源二聚体，其中每个亚基含有一个锌指结构域和一个FokI核酸内切酶结构域。
FokI结构域必须二聚化才有活性，确保必须存在两个相邻的DNA结合事件才能实现双链断裂，从而增加了目标特异性。
切割事件使得大部分基因组编辑技术得以实现。
在双链断裂后，细胞试图修复它。
最简单的方法是非同源末端接合（NHEJ），其中细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，这往往产生移码。
第三代基因组测序特征
第三代基因组测序特征
第三代基因组测序是指利用先进的技术和方法，针对DNA序列进行高效、精准、快速的测序，具有以下特征：
1.速度快：第三代基因组测序速度比第二代基因组测序提高了数十倍。
2.费用低：第三代基因组测序的费用相对低廉，适用于大规模的高通量测序。
3.数据量大：第三代基因组测序能够产生更大量的测序数据，为后续的基因组学研究提供了更多样的数据资源。
4.准确性高：第三代基因组测序方法能够极大程度地提高测序准确性，降低错误率。
5.使用方便：第三代基因组测序方法使用简便，减少了操作复杂度，方便用户进行基因组测序分析。
6.适用广泛：第三代基因组测序方法不仅适用于人类基因组的测序，还可以用于其他生物体的基因组测序，如动植物、微生物等。
7.多样性：第三代基因组测序方法不同于第二代方法的“读长”，第三代方法具有更大的“读长”，能够更全面地反映基因组的复杂性。
基因组编辑方法
基因组编辑方法
基因组编辑，又称基因编辑（gene editing），是指一种通过删除、插入或替换基因组的某个片段或特定碱基使基因组发生特定变化的分子技术。
基因组编辑技术主要包括以下几种方法：
- 第三代基因编辑技术：CRISPR-Cas9，这种技术能以极其简单的方式对基因进行精准操作——编辑。
- TALEN 技术：这是一种依靠 TALEN 蛋白对基因组进行编辑的方法。
TALEN 蛋白由一对核酸酶和一对与目的 DNA 序列互补的核酸组成，可以在特定的位置切断 DNA 双链，并进行基因编辑。
- ZFN 技术：ZFN 是一种由一对锌指核酸酶和一段与目的 DNA 序列互补的寡核苷酸组成的基因编辑工具。
ZFN 可以特异性地识别并结合到目的 DNA 序列上，然后在锌指核酸酶的催化下切断 DNA 双链，实现基因编辑。
利用基因组编辑技术，可以精确地定位到基因组上的某一个位点，在这个位点上剪断目的DNA片段，插入新的DNA片段，从而使特定位点基因序列发生突变，实现对DNA序列的遗传改造操作。
三代基因组编辑技术
首先，锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的设计和合成过程较为复杂，需要较 高的技术水平和经验；其次，由于这两种技术需要将蛋白质引导至细胞核内，因此对细 胞具有毒性作用；此外，由于这两种技术需要识别和切割DNA序列，因此可能存在脱
靶效应和基因突变的风险。
03
第二代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）
总结词
胞嘧啶脱氨酶引导的编辑是一种利用胞嘧啶脱氨酶对DNA进行精准编辑的方法。
详细描述
胞嘧啶脱氨酶能够将DNA中的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），进而在随后的DNA复制过程中导致基因 突变。通过将特定的脱氨酶与CRISPR-Cas9系统结合，可以实现精准的基因组编辑。
基因组编辑的最新进展与前景
总结词
04
第三代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）的改进与优化
高效性
通过优化碱基编辑器的脱靶效应 和编辑效率，提高其在基因组中 的精准度和可靠性。
特异性
改进碱基编辑器的识别机制，降 低其在基因组中脱靶编辑的可能 性，提高编辑的特异性。
适用性
拓展碱基编辑器的应用范围，使 其适用于更多种类的基因突变和 遗传疾病的治疗。
随着技术的不断进步，基因组编辑技术 正在不断发展，未来有望在医学、农业 等领域发挥更大的作用。
VS
详细描述
近年来，基因组编辑技术取得了许多突破 性进展，例如开发出更加高效和精准的编 辑工具，以及在人类疾病治疗和农作物改 良等领域的应用。未来，基因组编辑技术 有望在更多领域发挥重要作用，为人类带 来更多的福祉。
三代基因组编辑技术
目录
• 基因组编辑技术概述 • 第一代基因组编辑技术 • 第二代基因组编辑技术 • 第三代基因组编辑技术
三代基因组组装流程
三代基因组组装流程
1. 数据质控：首先，对原始测序数据进行质量控制，包括去除低质量序列、去除接头序列和低质量碱基等。
2. 参考基因组预处理：针对亚基因组，根据参考基因组信息对原始数据进行预处理，如去除线粒体DNA序列、剔除已知的污染序列等。
3. 数据比对：将预处理后的数据与参考基因组进行比对，通常采用软件工具如BWA、Bowtie 等进行比对。
比对可以确定测序reads在参考基因组上的位置，使其能够被正确组装。
4.组装：根据比对结果，利用组装算法将比对上的reads按照相对位置进行重组，形成较长的连续序列（contigs）。
常用的组装软件包括SPAdes、Velvet、SOAPdenovo等。
5. 连接和填补：对测序reads之间存在的间隙进行连接和填补，以获得更完整的染色体序列。
这一步通常借助长读长测序技术如PacBio或Nanopore进行，可以提供跨过间隙的长的序列片段。
6. 纠错：利用测序重叠信息，对组装得到的序列进行错误校正，去除可能存在的测序错误。
7. 染色体级组装（optional）：在基因组组装的最后一步，将contigs进行再连接，形成较长的染色体级序列。
8.评估和注释：对组装得到的基因组序列进行质量评估和注释，包括检测序列完整性、基因预测、功能注释等。
通常会借助一些基因组注释工具进行。
总的来说，三代基因组组装流程由数据质控、参考基因组预处理、数据比对、组装、连接和填补、纠错、染色体级组装、评估和注释等多个步骤组成，每个步骤都有相应的软件和工具可供选择和使用。
此外，实际的流程和方法可能因具体问题和研究目的的不同而有所差异。
基因测序三代技术介绍
基因测序三代技术介绍基因测序是指对生物体的基因组进行全面、系统的测序分析，以获得个体基因组的完整信息。
在过去的几十年中，随着基因测序技术的不断发展，人们逐渐实现了从第一代到第三代基因测序技术的跨越。
本文将介绍第三代基因测序技术的原理、应用和前景。
第三代基因测序技术是指相对于第一代和第二代技术而言的新一代测序技术。
与前两代技术相比，第三代基因测序技术具有更高的测序速度、更低的成本、更高的准确性和更广泛的应用领域。
第三代技术的代表性方法有单分子测序、纳米孔测序和光学显微镜测序等。
单分子测序是第三代基因测序技术中的一种重要方法。
它利用单个DNA分子作为模板进行测序，通过监测DNA聚合酶在DNA模板上的扩增过程，实现对DNA序列的测定。
这种方法不需要PCR扩增，因此可以避免PCR引入的偏差和错误。
同时，单分子测序技术具有较高的测序速度和准确性，可以在较短的时间内完成大规模基因组的测序，为基因研究提供了强有力的工具。
纳米孔测序是另一种常用的第三代基因测序技术。
它利用具有纳米孔的膜片作为测序平台，通过控制DNA分子通过纳米孔时引起的电流变化来测定DNA序列。
纳米孔测序技术具有高通量、快速、低成本和直接测序等优点。
由于纳米孔测序技术不需要PCR扩增和荧光标记，因此可以避免PCR和荧光引入的偏差和错误，提高了测序的准确性。
光学显微镜测序是第三代基因测序技术的又一重要方法。
它利用荧光染料标记的DNA分子在显微镜下进行成像，通过观察DNA分子的运动轨迹来测定DNA序列。
光学显微镜测序技术具有高分辨率、高准确性和高通量的特点。
通过引入微流控芯片和自动化设备，光学显微镜测序技术可以实现高通量的基因测序，为基因组学研究提供了重要工具。
第三代基因测序技术在基因组学研究、医学诊断和生物工程等领域具有广泛的应用前景。
在基因组学研究方面，第三代测序技术可以帮助科学家更好地理解基因组的结构和功能，揭示基因与疾病之间的关系，为疾病的早期预测和个体化治疗提供依据。
CRISPRCas9
crispr/cas9CRISPR/Cas9 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR/Cas9 系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA 的片段整合到CRISPR 中，并利用相应的CRISPR RNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
原理此系统的工作原理是crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点剪切双链DNA。
而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA (short guide RNA )，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA 导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9( Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA ，可靶定任何dsDNA 序列，而sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。
但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。
即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。
2013 年1 月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA 将Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Plant Bacterial TAL Effector
发现：1989年，植物病原体黄担保菌属（Xanthomonas spp.）avrbs3基因 发展：2007年，发现其序列特异性核酸结合特性，avvrBs3-TA. 2009年，TAL effector 氨基酸序列与核酸靶序列的密码被破译、 应用：2011年，Nature Biotechonlogy同时发辫四篇TALEN基因敲除文章和一篇综述
Genetics, Vol. 188, 773–782
ZFN mediated genome editing
• FOK1二聚体互作 • 与非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等方法结合使用 • 同源二聚体或单一ZFN单元的结合造成非特 异性酶切，即脱靶效应（off-target）
CRISPR/Cas9系统的成功应用案例
• 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISER-Cas systems》一文 中，作者利用CRISER-Cas systems用设计好的DNA莫版替换相应基因 来达到定点修饰 • 2013年1月29日在《nature biotechnology》上发表的《efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system》一文 中，作者利用人工合成的sgRNAs能指导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚 胎基因进行修饰 • 2013年2月15日在《science》上发表的《Multiplex Genome Engineering UsingCRISPR/Cas Systems》一文中，作者利用一个包 含两个靶向不同的spacers的crRNA实现了同时对两个基因进行编辑 • 2013年4月12日在《cell stem cell》上发表的《Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs》一文中，作者利用 TALENs和CRISPRs对同一基因进行修饰，效率分别为0%-34%和51%-79%
基因组编辑技术
基因组编辑技术的介绍
基因组编辑技术是一种可以在基因组 水平上对DNA序列进行改造的遗传 操作技术。 这种技术的原理是构建一个人工内切 酶，在预定的基因组位置切断DNA， 切断的DNA在被细胞内的DNA修复 系统修复过程中会产生突变，从而达 到定点改造基因组的目的。 通过修复途径，基因组编辑技术可以 实现三种基因组改造，即基因敲除， 特异突变的引入和定点转基因 基因组编辑是研究基因功能的重要手 段之一，也可被用于人类遗传性疾病 的治疗，因此这类技术成为现代分子 生物学的研究热点
Mechanism of CRISPR/Cas9 to target DNA
蛋白质：核酸聚合物
HNH RuvC
Guide RNA: crRNA（ CRISPR-derived RNA ） 通过碱基配对与 tracrRNA （transactivating crRNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物。通过人工 设计这两种 RNA，可以改造形成具 有引导作用的sgRNA （short guide RNA ） Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 的比较
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 发挥作用的机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
Zinc Finger Nuclease(ZFN)
What is a Zinc Finger?
- 是一种常出现在DNA结合蛋白质中的一种结构基 元。锌螯合在氨基酸链中形成锌的指状结构。 - 对基因调控起重要的作用。根据其保守结构域的不 同，可将锌指蛋白主要分为C2H2型、C4型和C6型。 锌指通过与靶分子DNA、RNA、DNA－RNA的序 列特异性结合，以及与自身或其他锌指蛋白的结合 在转录和翻译水平上调控基因的表达、细胞分化以 及胚胎发育。
ZFN mediated genome editing
ZFN的限制性
已建有ZFN库，识别多种DNA序列，但不 能达到识别任意靶DNA，其应用受到限制。 细胞毒性—大量脱靶位点的出现导致基因 组的破坏
构建繁琐—识别特性决定构建难度大，时 间长
Transcription activator like effector nuclease(TALEN)
2007 年，Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR 系统抵抗噬菌体入 侵；2008 年，Marraffini 等发现细菌CRISPR 系统能阻止外源质粒的转 移，首次利用实验验证了CRISPR 系统的功能
2013 年初，MIT 的研究组首次利用CRISPR/Cas9 系统对人293T 细胞 EMX1 和PVALB 基因以及小鼠Nero2A 细胞Th 基因实现了定点突变。同 年Mali 利用CRISPR/ Cas9 在人293T 细胞和K652 细胞基因的靶位点形成 双链或单链的切口，从而激活细胞的DNA 修复机制高效介导外源基因定 点插入。
CRISPR-Cas系统的结构
CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在 guide RNA引导下对靶位点进行切割。它 与folk酶功能类似，但是它并不需要形 成二聚体才能发挥作用。
• TALEN 技术是一种崭新的分子生物学工具。利用TAL的 序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白， 从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法 不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游 序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的灵活性，使基 因操作变得更加简单方便。 • 然而，构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比 较繁杂，需要大量的测序工作。对于普通实验室的可操作 性较低。
- 结构
• 24-30 个氨基酸残基 •形成α-β-α二级结构 • 两保守的半胱氨酸和组氨酸配位一个锌原子。
Zinc finger nuclease (ZFN)
由一个 DNA 结合域（DNA-binding domain）和一个非特异性核 酸内切酶Fok1构成。DNA 结合域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白 （zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结 合一个特异的三联体碱基。
基因组编辑三大利器
介绍
• ZFN:Zinc-finger nucleases 锌指核糖核酸 酶 • TALENs:transcription activator-like effector nucleases 转录激活因子样效应 物核酸酶 • CRISPR/ Cas9 :clustered regularly interspaced short palindromic repeats 成簇的规律间隔的短回文重复序列/ CRISPR-associated 9
CRISPR/Cas9 system
CRISPR-Cas系统简介
CRISPR-Cas系统的研究历史
1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间 隔重复序列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中， 2002 年， 正式将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 2005 年发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质 高度同源，推测细菌可能通过CRISPR 系统可能以类似于真核生物的 RNACRISPR/Cas在基因改造中的应用
• CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特 异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别 靶序列上的PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer • 发现tracrRNA对靶点的识别和切割是必需的，tracrRNA的5'端与成熟 的crRNA 3'端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环结构，对维 持crRNA与靶点的配对可能十分重要 根据tracrRNA与crRNA的结构特 性，他们tracrRNA和crRNA表达为一条嵌合的向导RNA (guide RNA， gRNA)，并在体外证明gRNA可以发挥tracrRNA和crRNA的功能 • CRISPR/Cas系统有三类，其中TypeⅡ型系统的核糖核蛋白复合物相对 简单，除crRNA和tracrRNA外，只有Cas9一个蛋白 目前，产脓链球菌 (SF370)的TypeⅡ型系统（CRISPR/Cas9）是被改造的最为成功的人工 核酸内切酶，已经在人类细胞 小鼠 斑马鱼中成功实现了基因组定点 修饰。
16
The principle of TALEN-mediated gene targeting(基本原则)
Ⅰ Ⅱ.利用细胞 HR（同源重 组）修复机 制实现基因 修饰 Ⅱ Ⅲ
Ⅰ.利用TALEN在特 定位点创造DSB
Ⅲ.利用细胞NHEJ （非同源性末端接合） 修复机制实现基因修 饰
TALENs的优缺点
Functional domains of Xanthomonas TAL effectors TAL 效应蛋白的不同结构功能域