水稻转基因组织培养步骤的具体事宜
转基因操作的基本流程
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水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
水稻转基因方法 自己
转基因步骤：2-3月完成水稻幼胚愈伤组织的培养1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。
2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。
3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D （0.6% Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。
注;培养基每2周换一次。
农杆菌的准备1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。
如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。
注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。
2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul 于5ML YEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。
3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/l Kan+，50mg/l（利福平） Str+）. 28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。
注;农杆菌培养时要避光。
因为农杆菌对光敏感。
农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+ 有抗性，所以能在YEP培养基中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。
农杆菌的侵染1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。
2. 挑取农杆菌放入30ml AAM感菌液中（10-20mg/l AS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。
3．将愈伤放入无菌50ml离心管中。
（在准备一个滤膜）4．将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中，侵染90s，其中不停要摇晃。
5．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
植物转基因的操作流程
植物转基因的操作流程
1.制备基因载体：首先要确定所需转入植物的基因，然后将该基因克隆到适当的基因载体中，如农杆菌介导的转化系统中常用的质粒载体。
2. 构建转化质粒：将基因载体与其他必需的元件如启动子、终止子、选择标记等组装成转化质粒。
3. 制备植物材料：选择合适的植物作为转基因植物的母本，如经济作物或模式植物。
4. 农杆菌介导的转化：将构建好的转化质粒通过农杆菌注入到植物的叶片、茎或愈伤组织等处，利用农杆菌的生物学特性，在植物细胞中导入转化质粒。
5. 筛选转基因植物：通过在培养基中加入相应的选择标记，筛选出已经被转化的植物细胞，进而培育出转基因植物。
6. 鉴定转基因植物：通过PCR、Southern blot等分子生物学技术鉴定转基因植物是否成功，同时进行表型分析，确定转基因植物的性状和稳定性。
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水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
转基因技术的主要操作流程
转基因技术的主要操作流程
内容:
转基因技术的主要操作流程通常包括以下几个步骤:
1. 选择目的基因。
根据转基因的目的,从供体中选择想要的目的基因,这通常是编码某种有用蛋白质的基因。
2. 构建载体。
将选定的目的基因插入到载体分子中,例如质粒或病毒载体。
载体可以帮助目的基因进入目标生物的细胞。
3. 将重组载体导入宿主细胞。
使用微注射、电穿孔、基因枪等方法,将含有目的基因的重组载体导入目标生物的细胞中。
4. 筛选转基因细胞。
通过抗性筛选、荧光筛选等方法,从导入重组载体的细胞中筛选出真正导入了目的基因的转基因细胞。
5. 转基因细胞培养。
对转基因细胞进行培养、繁殖,获得足够数量的转基因细胞。
6. 转基因植株再生。
通过组织培养等手段,从转基因细胞中再生出完整的转基因植株。
7. 鉴定转基因植株。
通过、杂交等手段对转基因植株进行鉴定。
8. 转基因植株评价。
对转基因植株的表型进行评价,确定是否达到了转基因的预期目的。
这就是转基因技术的主要操作流程。
不同的转基因目的和对象,具体操作可能会有所调整。
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农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
2.MS min母液(100×)KI 0.083gH3BO30.62gMnSO4∙4H2O 2.23g 或MnSO4∙ H2O 1.69gZnSO4∙7H2O 0.86gNa2MoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025g注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。
加dH2O定容到1000ml室温保存。
3.N6max母液(10×)KNO328.3gKH2PO4 4.0g(NH4)2SO4 4.63gMgSO4∙ 7H2O 1.85gCaCl2∙ 2H2O 1.66g 或CaCl2 1.25g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
4.N6 min母液(100×)KI 0.08gH3BO30.16gMnSO4∙ 4H2O 0.44g 或MnSO4 ∙ H2O 0.3335gZnSO4∙ 7H2O 0.15g加dH2O定容到1000ml室温保存。
5.Fe2+-EDTA(100×)取一个烧杯加300ml dH2O以及FeSO4∙ 7H2O 2.78g；在另一个烧杯中也加300ml dH2O加热到70℃后加入Na2 EDTA ∙ 2H2O 3.73g；待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。
6.维生素(100×)Nicotinic acid 0.1gPyridoxine HCl (VB6) 0.1gThiamine HCl (VB1) 0.1gGlycine 0.2gInositol 10g加dH2O定容到1000ml 4℃保存。
7.AA max母液(10×)KCl 29.50gNaH2PO4 1.50g 或NaH2PO4 ∙ 2H2O 1.95gMgSO4· 7H2O 2.50gCaCl2∙ 2H2O 1.50g 或CaCl2 1.13g加dH2O定容到1000ml室温保存。
8.AA min母液(1000×)MnSO4∙ H2O 1.0gH3BO30.3gZnSO4∙ 7H2O 0.2gKI 0.075gNaMoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025gNa2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。
9.2,4-D母液(1mg/ml)2,4-D 100 mg先加1.0 ml 1N KOH 摇5min，然后加10ml H2O 继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室温保存。
10.6-BA母液(1mg/ml)6-BA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
11.N AA母液(1mg/ml)NAA 100mg加1.0ml 1N KOH 并搅动直到NAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
12.I AA母液(1mg/ml)IAA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到IAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
13.100mM AS母液(1mg/ml)AS 0.196gDMSO 10ml分装到1.5 ml离心管4℃保存。
14.1N KOH母液(1mg/ml)KOH 5.6g用100ml H2O溶解后室温保存。
15.羧苄青霉素2钠(CN) （200mg/ml）CN干粉1g用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。
或者用5ml 75％酒精溶解，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。
16.A stock solution （继代A）:硝酸铵16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾 1.7g七水硫酸镁 3.5g二水氯化钙4g/无水氯化钙3g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存17.B stock solution （继代B）:四水硫酸锰 5.0g硼酸 1.5g七水硫酸锌 2.0g碘化钾0.75g （未完）二水钼酸钠0.25g五水硫酸铜0.0389g六水氯化钴0.025g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存（二水钼酸钠单独称，单独溶，缓慢加入，边加边搅）三．农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程1 愈伤诱导1)成熟种子脱壳后70%酒精灭菌1min，0.15% HgCl2处理15min；2)灭菌单蒸水洗5-7次；3)将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；4)置黑暗中26±1℃处理约4-7周。
2 愈伤继代挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26±1℃处理2周，不可接太多。
3 预培养挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。
4 农杆菌准备准备浸染的农杆菌扩大培养。
在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养2－3天5 农杆菌悬浮培养准备将农杆菌转移（粳稻：用接种环刮入半环-1环菌，籼稻：3环-4环菌）到100ml悬浮培养基中28℃摇瓶培养30-60min。
6 农杆菌侵染（共培养）1)经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)调整农杆菌悬浮液的OD600值到0.8-1.0之间；3)用农杆菌悬浮液浸泡愈伤20－30min；4)倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)愈伤放在灭菌的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。
培养物19-20℃黑暗处理2天。
7 水洗和筛选1)经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；3)用含有400ppm Cn（羧苄青霉素二钠）的灭菌水浸泡愈伤30min（封好口后，可于28度，180至200RPM摇20－30min）；4)倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)在灭菌的滤纸上晾干愈伤；6)转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环（每个循环约2周）8 预分化与分化1)经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7天；2)经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。
；3)26℃光照处理，约需40－60天。
9 生根1)从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；2)剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；3)将苗子转入生根培养基，28℃光照处理7至10天。
10 移栽移去生根管的封口膜，倒入约1cm深的自来水，在光照培养室炼苗3－4天，移栽至准备好的栽种处。
四．培养基注意：所有的培养基必须现配现用。
（一）粳稻的转化1.诱导培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 600-700ml并用KOH调节pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。
2.继代培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 900ml并用1N KOH调节pH到5.9，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。
3.预培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.15g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并用1N KOH调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。
使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250μl AS 母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。
4.共培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.2g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。