水稻转基因组织培养步骤的具体事宜
水稻转基因育种的研究进展与应用现状
水稻转基因育种的研究进展与应用现状刘志宏1 田 媛2 陈红娜1 周志豪1 郑 洁2 杨晓怀1（1深圳市农业科技促进中心，广东深圳518000；2暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）摘要：随着生物技术发展的不断深入，我国水稻种业的发展也面临着全新的机遇和挑战。
目前，改善水稻品种质量的主要方法有分子标记技术、基因编辑技术和转基因技术。
其中，转基因水稻是利用生物技术手段将外源基因转入到目标水稻的基因组中，通过外源基因的表达，获得具有抗病、抗虫、抗除草剂等优良性状的水稻品种。
近年来，国内外在采用转基因技术进行水稻育种，提升水稻产量、改善水稻品质方面具有较多的研究进展。
在阐述转基因技术工作原理的基础上，概述国内外利用转基因技术在优质水稻育种方面的研究进展，进一步探究转基因技术在我国水稻育种领域的发展前景。
关键词：转基因育种；水稻；病虫害；除草剂Research Progress and Application Status of Rice Transgenic Breeding LIU Zhihong1，TIAN Yuan2，CHEN Hongna1，ZHOU Zhihao1，ZHENG Jie2，YANG Xiaohuai1（1Shenzhen Agricultural Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，Guangdong；2Department of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632）水稻（Oryza sativa L.）作为世界上重要的粮食作物之一，为世界超过1/3的人口提供了主粮，全球种植面积约1.4亿hm2[1]。
“十二五”以来，我国水稻产量连续稳定在2亿t以上[2]。
水稻作为我国的主要粮食作物，在我国粮食生产领域占据着十分重要的地位，水稻品种改良仍是保障种业持续发展和国家粮食安全的重点。
转基因操作的基本流程
转基因操作的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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水稻转基因组织培养步骤
水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。
N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。
转基因技术的主要操作流程
转基因技术的主要操作流程
内容:
转基因技术的主要操作流程通常包括以下几个步骤:
1. 选择目的基因。
根据转基因的目的,从供体中选择想要的目的基因,这通常是编码某种有用蛋白质的基因。
2. 构建载体。
将选定的目的基因插入到载体分子中,例如质粒或病毒载体。
载体可以帮助目的基因进入目标生物的细胞。
3. 将重组载体导入宿主细胞。
使用微注射、电穿孔、基因枪等方法,将含有目的基因的重组载体导入目标生物的细胞中。
4. 筛选转基因细胞。
通过抗性筛选、荧光筛选等方法,从导入重组载体的细胞中筛选出真正导入了目的基因的转基因细胞。
5. 转基因细胞培养。
对转基因细胞进行培养、繁殖,获得足够数量的转基因细胞。
6. 转基因植株再生。
通过组织培养等手段,从转基因细胞中再生出完整的转基因植株。
7. 鉴定转基因植株。
通过、杂交等手段对转基因植株进行鉴定。
8. 转基因植株评价。
对转基因植株的表型进行评价,确定是否达到了转基因的预期目的。
这就是转基因技术的主要操作流程。
不同的转基因目的和对象,具体操作可能会有所调整。
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农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
2.MS min母液(100×)KI 0.083gH3BO30.62gMnSO4∙4H2O 2.23g 或MnSO4∙ H2O 1.69gZnSO4∙7H2O 0.86gNa2MoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025g注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。
加dH2O定容到1000ml室温保存。
3.N6max母液(10×)KNO328.3gKH2PO4 4.0g(NH4)2SO4 4.63gMgSO4∙ 7H2O 1.85gCaCl2∙ 2H2O 1.66g 或CaCl2 1.25g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
4.N6 min母液(100×)KI 0.08gH3BO30.16gMnSO4∙ 4H2O 0.44g 或MnSO4 ∙ H2O 0.3335gZnSO4∙ 7H2O 0.15g加dH2O定容到1000ml室温保存。
5.Fe2+-EDTA(100×)取一个烧杯加300ml dH2O以及FeSO4∙ 7H2O 2.78g；在另一个烧杯中也加300ml dH2O加热到70℃后加入Na2 EDTA ∙ 2H2O 3.73g；待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。
6.维生素(100×)Nicotinic acid 0.1gPyridoxine HCl (VB6) 0.1gThiamine HCl (VB1) 0.1gGlycine 0.2gInositol 10g加dH2O定容到1000ml 4℃保存。
7.AA max母液(10×)KCl 29.50gNaH2PO4 1.50g 或NaH2PO4 ∙ 2H2O 1.95gMgSO4· 7H2O 2.50gCaCl2∙ 2H2O 1.50g 或CaCl2 1.13g加dH2O定容到1000ml室温保存。
8.AA min母液(1000×)MnSO4∙ H2O 1.0gH3BO30.3gZnSO4∙ 7H2O 0.2gKI 0.075gNaMoO4∙ 2H2O 0.025gCuSO4∙ 5H2O 0.0025gCoCl2∙ 6H2O 0.0025gNa2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。
9.2,4-D母液(1mg/ml)2,4-D 100 mg先加1.0 ml 1N KOH 摇5min，然后加10ml H2O 继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100 ml室温保存。
10.6-BA母液(1mg/ml)6-BA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
11.N AA母液(1mg/ml)NAA 100mg加1.0ml 1N KOH 并搅动直到NAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
12.I AA母液(1mg/ml)IAA 100mg加1.0 ml 1N KOH摇直到IAA溶解，加水定容到100 ml室温保存。
13.100mM AS母液(1mg/ml)AS 0.196gDMSO 10ml分装到1.5 ml离心管4℃保存。
14.1N KOH母液(1mg/ml)KOH 5.6g用100ml H2O溶解后室温保存。
15.羧苄青霉素2钠(CN) （200mg/ml）CN干粉1g用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。
或者用5ml 75％酒精溶解，分装到1.5ml Tub中（无菌操作）。
16.A stock solution （继代A）:硝酸铵16.5g硝酸钾19.0g磷酸二氢钾 1.7g七水硫酸镁 3.5g二水氯化钙4g/无水氯化钙3g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存17.B stock solution （继代B）:四水硫酸锰 5.0g硼酸 1.5g七水硫酸锌 2.0g碘化钾0.75g （未完）二水钼酸钠0.25g五水硫酸铜0.0389g六水氯化钴0.025g加水依次溶解，定容1000ml，室温保存（二水钼酸钠单独称，单独溶，缓慢加入，边加边搅）三．农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程1 愈伤诱导1)成熟种子脱壳后70%酒精灭菌1min，0.15% HgCl2处理15min；2)灭菌单蒸水洗5-7次；3)将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；4)置黑暗中26±1℃处理约4-7周。
2 愈伤继代挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26±1℃处理2周，不可接太多。
3 预培养挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。
4 农杆菌准备准备浸染的农杆菌扩大培养。
在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养2－3天5 农杆菌悬浮培养准备将农杆菌转移（粳稻：用接种环刮入半环-1环菌，籼稻：3环-4环菌）到100ml悬浮培养基中28℃摇瓶培养30-60min。
6 农杆菌侵染（共培养）1)经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)调整农杆菌悬浮液的OD600值到0.8-1.0之间；3)用农杆菌悬浮液浸泡愈伤20－30min；4)倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)愈伤放在灭菌的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。
培养物19-20℃黑暗处理2天。
7 水洗和筛选1)经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；2)用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；3)用含有400ppm Cn（羧苄青霉素二钠）的灭菌水浸泡愈伤30min（封好口后，可于28度，180至200RPM摇20－30min）；4)倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；5)在灭菌的滤纸上晾干愈伤；6)转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环（每个循环约2周）8 预分化与分化1)经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7天；2)经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。
；3)26℃光照处理，约需40－60天。
9 生根1)从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；2)剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；3)将苗子转入生根培养基，28℃光照处理7至10天。
10 移栽移去生根管的封口膜，倒入约1cm深的自来水，在光照培养室炼苗3－4天，移栽至准备好的栽种处。
四．培养基注意：所有的培养基必须现配现用。
（一）粳稻的转化1.诱导培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.5ml脯氨酸0.3g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 600-700ml并用KOH调节pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。
2.继代培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 100mlN6min母液(100×) 10mlFe2-EDTA母液(100×) 10mlVitamin母液(100×) 10ml2,4-D母液 2.0ml脯氨酸0.5g水解酪蛋白0.6g蔗糖30gPhytagel 3g加H2O 900ml并用1N KOH调节pH到5.9，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中(25ml/瓶)，封口膜封口灭菌。
3.预培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.15g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并用1N KOH调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。
使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250μl AS 母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。
4.共培养培养基（用于粳稻）N6max母液(10×) 12.5mlN6min母液(100×) 1.25mlFe2-EDTA母液(100×) 2.5mlVitamin母液(100×) 2.5ml2,4-D母液0.75ml水解酪蛋白0.2g蔗糖5g琼脂粉 1.75g加H2O 250ml并调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。