产几丁质酶的筛选及活力测定
一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化
一株产几丁质酶菌株的筛选鉴定与产酶条件优化苗飞;孟阳;王悦;袁春营;崔青曼【摘要】几丁质酶在降解几丁质和生物防治上具有重要作用.采用平板筛选法从对虾养殖池塘底泥中筛选几丁质酶产生菌株,以培养时间、培养温度和胶体几丁质含量为自变量,响应面法优化该菌株的产酶条件,建立二次回归方程.试验结果表明,通过菌株的菌落形态、亚显微形态特征和16S rDNA序列同源性分析,确定该菌株为蜂房芽孢杆菌.3个因素对菌株产酶的影响依次为培养时间>培养温度>胶体几丁质含量.菌株的最佳产酶的条件为:培养基中胶体几丁质含量1.62%,培养温度40 ℃,培养时间72 h,在此条件下,菌株产生的几丁质酶活力为13.07 U/mL.该研究为筛选菌株的进一步利用提供科学依据.%Chitinase plays an important role in the degradation of chitin and biological control.A chitinase-producing strain was screened from prawn-farming pond sediment using plate screening method.The cul-ture temperature,culture time and the content of colloidal chitin as independent variables,the enzyme pro-duction condition of the strain was optimized using a response surface method,and quadratic regression e-quation was established.The results showed that the strain was determined as Paenibacillus alvei through colonymorphology,submicroscopic morphology and 16S rDNA sequence homology analysis.The influ-ence of three factors on the enzyme production of the strain was expressed as culture time>culture temper-ature>content of colloidal chitin.The maximal enzyme production was observed under conditions of col-loidal chitin content of 1.62% in culture medium,the temperature of 40 ℃,and the culturing time of 72 h,withchitinase activity of 13.07 U/mL.The findings provided scientific basis for further utilization of the screened strain.【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2018(037)002【总页数】6页(P221-226)【关键词】几丁质酶;蜂房芽孢杆菌;产酶条件;优化【作者】苗飞;孟阳;王悦;袁春营;崔青曼【作者单位】天津科技大学海洋与环境学院,天津市海洋资源与化学重点试验室,天津300457;天津科技大学海洋与环境学院,天津市海洋资源与化学重点试验室,天津300457;天津科技大学海洋与环境学院,天津市海洋资源与化学重点试验室,天津300457;天津科技大学海洋与环境学院,天津市海洋资源与化学重点试验室,天津300457;天津科技大学海洋与环境学院,天津市海洋资源与化学重点试验室,天津300457【正文语种】中文【中图分类】S917.1几丁质广泛存在于真菌、细菌、高等植物及甲壳动物等的外壳中，据估计自然界每年生物合成的几丁质约为1×1011t，是自然界中第二丰富的多聚糖[1-3]。
病原芽胞杆菌几丁质酶产生菌的筛选与活性鉴定
作者 简介 ：蔡亚 君 （ ９０ ，女 ，博 士 ，讲 师 ，研究 方 向：应用 微生 物遗传 改 良 １８一）
基 金项 目：武汉 纺织 大学校 基金 项 目 （０ ８ ２ ２０Ｚ ４）．
第２ ４卷 第 ３期
２ １ 年 ０ 月 ０１ ６
武
汉
纺
织
大
学
学
报
Ｖｂ ．４ Ｎ ｏ－ １２ ３ Ｊ ｕｎ． ２０１１
Ｊ０ Ｕ ＲＮ Ａ Ｌ Ｏ Ｆ Ｗ Ｕ Ｈ Ａ Ｎ Ｔ ＥＸ Ｔ Ｉ Ｅ Ｕ Ｎ Ｉ ＥＲ ＳＩ Ｙ Ｌ Ｖ Ｔ
病原 芽胞杆菌几丁质酶产 生菌 的筛选 与活性鉴定
几 丁质 （ ｈｔ ｃ ｉｎ）为 聚 Ｂ一 ，４ 乙酰葡萄 糖胺 ，是一 种广泛 存在 于 自然界 的直链状 高分 子生物 多聚体 。 ｉ １ 一
自然界 每年 生成 的几 丁质数 以百亿 吨计 ，是 储量 仅次 于纤 维 素的天 然聚合 物 。几 丁质是许 多 真菌细胞 壁 的 主要成 分 ，也 大量存 在 于 昆虫 或节 肢 动物 的 甲壳 及 昆虫 的 中肠 中。几丁 质酶 （ ｈｉａｅ ｃｉｎｓ ）可催 化水 解几 丁 ｔ 质 的 ｐ一 ， １ ４糖苷键 生成 Ｎ 乙酰 一 一 一 Ｄ 氨基 葡萄糖 （ Ａ ，广 泛存 在于微 生物 、植物 、昆虫 和脊椎 动物 中 ， Ｎ Ｇ） 在环境 保护 和农业 等方 面有着 广泛 的应用 前景 。 至今 ， 芽胞 杆菌 属 中已有环 状芽 胞杆菌 （ ａｉｕ ｃ ｅｌｎ ） Ｂ ｃｌｓ ｉ ｕ ｓ， ｌ ｒ ａ 蜡 状芽 胞杆 菌 （ ｇ ｃｓ ｒｕ，简称 Ｂ ） 云金 芽胞杆 菌 （ ｔｕｉ ｉ ｓｓ ｅ，苏 ｈｒ ｇｅ ｉ，简称 研 ）等相继 发现产 几 丁质 酶 ｎ ｎ
几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究_邓红梅
基金项目: 茂名市重点科学计划资助项目( 201173) 收稿日期: 2009- 12- 28 作者简介: 邓红梅( 1965- ) , 女, 广东 茂名人, 副教授, 从事生物技术方面的教学与研究。E- mail: dhm005@ 126. co m。
邓红梅等: 几丁质酶高产菌的筛选及其产酶条件的优化研究/ 2010 年第 5 期
of enzyme by strain X
由图 3 可知, 菌株 X 在 30~ 35 e 温度范围内产酶 活性较高, 且较稳定。最适产酶温度在 30 e , 酶活达 1. 02 U # mL - 1, 在 40 e 时菌株产酶活性最低。表明 菌株 X 较适宜在低温环境中产酶, 过高的温度会抑制 其产酶活性。 2. 4 初始 pH 值对菌株 X 产酶的影响
1 实验
1. 1 土样及试剂 5 份土样采自茂名沿海地区。 几丁质粉, 上海市生物制品有限公司; 其它试剂均
为国产分析纯。 1. 2 培养基
平板分离培养基( g # L- 1 ) : 胶体几丁质 5, K2 HPO4 0. 7, KH2 PO4 0. 3, MgSO4 # 7H2 O 0. 5, FeSO4 # 7H2 O
图 1 菌株 X 的菌落形态和透明圈( a) 、显 微镜下的形态( b) 、芽孢在显微镜下的形态( c) Fig. 1 Colony shape and clear zones of strain X( a) , strain X observed by microscope( b) , spore of strain X observed by microscope( c)
几丁质酶的活性测定
几丁质酶活性的测定⑴几丁质酶几丁质是绝大多数真菌细胞壁的主要成份，而在植物中却不存在。
但高等植物普遍存在着几丁质酶，并可通过几丁质酶催化几丁质的水解，使植物具有抵御真菌侵染的能力（Shibuya and Minami, 2001）。
在正常情况下，高等植物的几丁质酶表达水平很低，而当植物体遭受到病原真菌、细菌和病毒侵染，机械创伤或乙烯处理时，其表达活性显著增强。
特别是在β-1,3-葡聚糖酶的协同作用下，可明显抑制真菌的生长（Sela-Buurlage et al., 1993）。
几丁质酶是植物体中与防御有关的一种次生水解酶，是植物广谱防御机制的一个成分（V an Loon and Van Strien, 1999），它能催化真菌细胞壁的重要成分——几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物的抗真菌能力。
而植物体中尚未发现几丁质酶作用的底物，所以，几丁质酶在植物体中诱导与积累，对于增强植物的抗病能力有重要作用。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体β-1,4键，产生N-乙酰葡聚糖胺寡聚体，水解可以是外切作用也可以是内切作用。
⑵试剂的配制①胶状几丁质的制备称取粉末状几丁质（甲壳素，sigma）5.0 g，缓慢加入200 mL （≤4℃）预冷的浓HCl中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，待几丁质粉末均匀分散后，在水浴中轻度搅拌并缓慢加热至37 ℃混合物的粘度迅速增加，几分钟后粘度开始下降，混合物逐渐变得清亮。
当几丁质基本上溶解完毕时，用玻璃棉过滤，将滤液倒入2000 mL预冷（≤4℃）的蒸馏水中，搅拌，几分钟后几丁质沉淀，溶液变得混浊，30分钟后停止搅拌，将悬液置于冰箱(≤4℃)沉淀过夜。
倒掉上清，剩余部分用双层中性滤纸抽滤，沉淀用蒸馏水洗涤数次，待pH达到5以上时，加数滴1 N NaOH使溶液呈中性。
将上述中性沉淀物加到200 mL的蒸馏水中，剧烈搅拌重新悬浮，即为胶体几丁质溶液。
取该溶液5 mL, 105℃烘箱干燥至衡重，测定溶液几丁质的含量（胶体几丁质溶液的几丁质含量为: mg/mL），并将胶体几丁质溶液浓度稀释为1%。
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告
高产几丁质酶菌株的筛选与CK1-3菌株几丁质酶的纯化与鉴定的开题报告摘要：几丁质酶是一种特殊的酶，在海洋生态系统中具有重要的生物学功能，因此对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
本文将实验室中先前筛选出的CK1-3菌株进行体外培养，通过测定其几丁质酶的活性进行筛选，同时优化产酶条件，最终得到高产几丁质酶的菌株。
接下来对于CK1-3菌株进行几丁质酶的纯化与鉴定，使用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤纯化CK1-3菌株的几丁质酶，测定其纯化比和比活力，同时采用SDS-PAGE和质谱分析进行鉴定。
关键词：几丁质酶；菌株筛选；纯化；鉴定；CK1-31. 研究背景随着人们对生物化学及海洋生态系统的研究深入，几丁质酶作为一种具有右旋螺旋结构的酶，逐渐成为研究重点。
它是一种特殊的酶，在海洋生态系统中，它可以释放出被几丁质包裹的有机物，为微生物提供能量和营养素。
同时，几丁质酶也被广泛应用于食品工业、纺织业等领域。
因此，对于高效的几丁质酶菌株的筛选和几丁质酶的纯化与鉴定具有重要意义。
2. 研究目的本研究旨在筛选高产几丁质酶的菌株，同时对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化与鉴定。
3. 研究方法3.1 菌株的培养先前从海波中分离出的CK1-3菌株通过体外培养的方式进行増菌。
用含有几丁质的培养基进行培养，其成分为（每升）：几丁质4.0 g、柠檬酸0.5 g、胰蛋白酶1.0 g、NaCl 1.0 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4 0.25 g、FeSO4 0.002 g和微量元素液体1 mL。
3.2 几丁质酶的筛选对体外培养的CK1-3菌株进行几丁质酶的筛选，分别在不同的温度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）和培养时间（12、24、36、48、72 h）下测定几丁质酶的活性，最终确定其最佳产酶条件。
3.3 几丁质酶的纯化利用超滤、离子交换层析和凝胶过滤三个步骤对CK1-3菌株的几丁质酶进行纯化，测定纯化比和比活力。
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定
产几丁质酶菌株的筛选及酶解产物鉴定谭海刚;李静;赵祥颖【摘要】几丁质酶是一种专一性降解几丁质的水解酶.在工业上,几丁质酶可用于制备功能性甲壳低聚糖.结合平板透明圈法和摇瓶发酵测酶活力的方法,从土壤中筛选到一株产几丁质酶的菌株L012,酶活力为0.75 IU/mL;采用离子色谱法对菌株L012产几丁质酶的酶解产物进行分析,初步确定产物中有氨基葡萄糖、乙酰氨基葡萄糖以及聚合度小于10的寡糖.【期刊名称】《粮油食品科技》【年(卷),期】2013(021)002【总页数】3页(P65-67)【关键词】几丁质;几丁质酶;几丁寡糖【作者】谭海刚;李静;赵祥颖【作者单位】山东省食品发酵工程重点实验室,山东济南 250013【正文语种】中文【中图分类】TS201.3几丁质酶专一性降解几丁质，水解得到的几丁寡糖、几丁二糖或N－乙酰葡萄糖胺在食品及药物方面有广泛的用途。
几丁质酶(chitinase，EC3.4.1.14)的酶源相当丰富，自从 Benecke［1］首次报道分离到几丁质酶产生菌以来，发现微生物中细菌、放线菌、真菌、酵母及某些病毒都能够产生几丁质酶。
不同来源的微生物的酶系有所不同，酶学性质差异较大。
一般微生物产几丁质酶的酶系含有外切几丁质酶、内切几丁质酶和几丁质二糖酶等。
本文采用平板透明圈法和摇瓶发酵相结合的方法从土壤等样品中筛选到一株产几丁质酶的菌株，并用离子色谱法对该菌株酶解产物进行了分析、鉴定。
1 材料与方法1.1 土样采自山东沿海等地区的土样。
1.2 主要试剂胶体几丁质(Colloidal chitin):按 Sun Chul Kang［2］的方法制备，细粉几丁质:济南海得贝公司，DNS试剂:参照文献［3］，磷酸缓冲液:参照文献［4］，其他试剂均为分析纯。
1.3 培养基1.3.1 富集培养基细粉几丁质 2.5 g/l，MgSO4·7H2O 0.5 g/l，K2HPO40.7 g/l，KH2PO40.3 g/l，FeSO4·7H2O 0.01 g/l，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌 20 min。
产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究
产几丁质酶侧孢短芽孢杆菌的筛选及其酶学性质研究刘蒲临;程德勇;缪礼鸿【摘要】筛选并鉴定高产几丁质酶的芽孢杆菌菌株，旨在研究其酶学特性为高效利用几丁质酶资源奠定基础。
分离纯化产几丁质酶芽孢杆菌，将目的菌株的几丁质酶基因异源表达并纯化后研究其酶学参数。
考虑到菌株的生物安全性，选择侧孢短芽孢杆菌CDY64为进一步研究对象，将其几丁质酶基因表达于大肠杆菌BL21中。
酶学研究表明，纯化后的几丁质酶最适反应温度为60℃，在pH6.0-8.0范围内均表现出良好的活性；使用胶体几丁质作为底物时Km与kcat值分别为5.85μmol/L和29.27S-1。
结果表明，侧孢短芽孢杆菌CDY64所产几丁质酶在高温下具有良好的催化能力，在体外对多种植物病原真菌表现出了良好的拮抗作用。
%This study aims to screen and identify Bacillus strain producing high yield of chitinase and to study its enzymatic properties for laying groundwork in the efficient utilization of chitinase resources. Firstly,the Bacillus producing chitinase was isolated and purified,and then chitinase gene in the target strain was heterologously expressed,and enzymatic parameters of the purified chitinase were assayed at optimal conditions. Considering the bio-safety of the strain,Brevibacillus laterosporus CDY64 was selected as study object,and its chitinase(Chi72A) was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). Enzymatic studies revealed that the purifiedChi72A by Ni-NTA affinity presented solid activity at pH range 6.0-8.0,and the optimal temperature of its activity was 60℃;and the Km and kcat ofChi72A were 5.85 μmol/L and 29.27 S-1,respectively while using colloidal chitin as substrate. In conclusion,Chi72A from CDY64 had high catalyticability at high temperature and exhibited high antifungal activity against many phytopathogenic fungi in vitro.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2016(032)006【总页数】7页(P174-180)【关键词】几丁质酶;侧孢短芽孢杆菌;酶学性质【作者】刘蒲临;程德勇;缪礼鸿【作者单位】武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023;武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉430023【正文语种】中文几丁质酶可以催化几丁质的水解，广泛存在于高等动植物、微生物以及某些病毒体内［1］。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究_李静
第37卷第3期 2007年6月工业微生物Industrial M icrobiology Vol .37No .3 Jun .2007山东省科技攻关计划项目(NO .031010115)。
作者简介:李静(1982～),女,硕士研究生。
一株产几丁质酶菌株的筛选及其产酶条件的研究＊李 静1, 刘建军2,3, 赵祥颖2(1.青岛农业大学食品科学与工程学院,青岛266109;2.山东省食品发酵工程重点实验室,济南250013;3.山东轻工业学院食品与生物工程学院,济南250100)摘 要 采用平板透明圈法从土壤中分离筛选到一株产几丁质酶放线菌株L 12,用250mL 摇瓶发酵初筛和复筛,酶活力为0.63U m L 。
通过产酶条件实验,初步确定了该菌株较适产酶培养基和摇瓶发酵条件。
条件优化后,30℃、250m L 摇瓶发酵48h ,几丁质酶活力达到1.06U mL 。
关键词:几丁质; 几丁质酶; 筛选; 酶活力 几丁质(Chitin )又称甲壳素、甲壳质,是以β-1,4-N -乙酰氨基葡萄糖为基本单位的直链多聚物,其含量在天然聚合物中仅次于纤维素居第二位[1,2]。
几丁质在医药、化工、食品、化妆品、印染、造纸、农业、环保等方面具有广泛的用途。
几丁质酶(ChitinaseEC3.3.1.14)[3]是一种专一性降解几丁质的酶类,可将几丁质完全水解为几丁单糖或几丁寡糖,直接被人体吸收利用,从而使几丁质用途更加广泛。
本研究从采集的40份土样中,以几丁质为唯一碳、氮源,采用平板透明圈法初筛,共挑取428株产生明显透明圈的菌株。
然后经摇瓶初筛、复筛,最终获得一株产几丁质酶活力较高的菌株放线菌L 12,并对其产酶条件进行了初步研究,本文报道了产酶菌株放线菌L 12的筛选过程和产酶条件研究的结果。
1 材料与方法1.1 土样 采自山东沿海等地区的40份土样。
1.2 试剂 胶体几丁质:按Sun Chul Kang [5]的方法制备;细粉几丁质购于济南海得贝公司。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
产几丁质酶的筛选及活力测定
一、实验材料
1.菌种：白僵菌，或其他菌种及土壤采样等(菌种接种于PDA斜面上，28℃，80％RH 培养14 d后分别置于4℃和20℃备用。
)
2.试剂：DNS试剂:（称取3，5-二硝基水杨酸3．15 g，加水500 mL。
，搅拌5 s，水浴至45。
然后逐步加入100 mL 0．2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。
直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。
再逐步加入四水酒石酸钾钠91．0 g苯酚2．5 g和无水亚硫酸钠2．5 g。
继续45"C水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。
停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000 mL。
用烧结玻璃过滤器过滤，取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。
室温下存放7 d后可以使用。
) 几丁质酶基础培养基(g／L)：葡萄糖5．09，蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，FeS04·2H20 0．1 g，pH 7．0。
几丁质酶诱导培养基(g／L)：蛋白胨5．09，KH2P04、KCI、MgS04·7H20各0．59，ZnS04·7H202 0．01 g，胶体几丁质10 ml，pH 7．0。
（胶体几丁质固体培养基。
0.5 g K2HPO4，0.5 gKH2PO4，0.5 g MgSO4·H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，0.1 gZnSO4·7H2O 500 ml 1%胶体几丁质，500 ml蒸馏水，15 g 琼脂，pH7.2，121℃灭菌15 min，冷却至50℃左右倒平板）
马铃薯培养基(PDA)；去皮的马铃薯200 g切块，沸水煮30 min，纱布过滤，20 g蔗糖，209琼脂，加热至全部溶解，定容至1 L。
二、筛选
1.初筛采用平板透明圈法。
用0．1 mL孢子悬液(1×107／mL)滴于几丁质平板的中央(每个样品重复3次)，28℃培养7d，其菌落周围有透明圈出现。
用游标卡尺测量几丁质水解圈直径(R／ram)与菌落直径(C／mm)，计算R／C比值。
2. 复筛摇瓶发酵，即在300mL三角瓶中装入30mL基础培养基，用3mL孢子悬液(1×107／mL)接种，28℃，160 r／rain旋转摇床培养96h。
相同条件下接入几丁质酶诱导培养基培养24 h。
离心发酵液(3 000 r／min，20min)的上清液即为粗酶液，测定酶活力。
3. 几丁质酶活性测定
取0．5mL粗酶液与0．5 mL含1．0％胶体几丁质的磷酸缓冲液(0．1 M，pH 6．0)混合，50℃保温1 h，煮沸5min，冰浴冷却，10000 r／min离心5 min，取上清液加入DNS试剂1 mL。
于100℃加热10 min，冰浴冷却，离心后取上清液在波长540nm下测吸光度。
以N一乙酰氨基葡萄糖做标准对照。
酶活力单位定义：在上述条件下，每小时产生1μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。
(采用DNS(3，5一二硝基水杨酸)比色法。
，测定还原糖含量，其标准曲线的回归方程为Y=0．840 5x+0．009 9，式中x为N一乙酰葡萄糖质量(mg)，Y为吸光值，R2=0．996 2。
在3根1．5“离心管中分别加入0．5 ml待测液和0．5nd浓度l％胶体几丁质；向其中I根离心管加入0．5 ml[DNS，放入100 ℃水浴10 rain，作为对照；另外3根离心管于4。
℃水浴60 rain后，加入0．5 d DNS，放人100℃水浴10rain。
3根管中均加入5 rnl 蒸馏水，4 000 r／rain离心10 rain后，取上清液，于540 nm测量OD，根据N一乙酰氨基葡萄糖的标准曲线计算出还原糖含量。
酶活力单位(U／m1)表示在上述反应条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需酶量。
)（from：《淡紫拟青霉几丁质酶提取工艺的优化研究》）。