溶菌酶酶活力测定
溶菌酶活力的简易测定
该 方 法 与 常 规 方 法 相 比 较 无 显著 差 异 （ ＜０ ０ ） Ｐ ． １。 关 键 词 ：溶 菌酶 ；酶 活 力 ；简 易测 定 中图 分 类 号 ：Ｔ ２ １ ２ Ｓ０．５ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１０ 一２ ３ （０ ２ ０ ０ ｌ ２ ０ ２ ０ ）５—０ ２ ０ ｌ８— ２
ｎ ｔｍａ ｅ ｆｏ ｂ ｃ ｅ ｕ ｐ ｗｄ ｒａ ｄ ｏ ｌ ｅ ｄｉ ｈｅ ｖ ｌｅ ｏ ｏ ｄ ｒ ｍ ａ ｔ ｒ ｍ ｏ ｅ ｎ ｎ ｙ ｒａ ｎｇ ｔ ａｕ ｆ０Ｄ４０ａ Ｓａ ｄ ７ ． ｅ ｒ ｓ ｌ ｈｏ ｈａ ｈｓ ｍｅ ｈ ｄ ｉ ｏ ｉ— ｉ ５ ｔ１ ｎ ５ Ｓ Ｔ ｅ ｕ ｔｓ ｗｓ ｔ ｔｔ ｉ ｔ ｏ ｓ ｎ ｔｓｇ ５ ｈ
溶 菌 酶 标 准 品 ，活 力 为 １ ０ ｍ 上 海 生 物 工 程 有 限 ８０ ０Ｕ／ Ｌ（
公司 ） ；
溶 壁 微 球 菌 （ 国 科 学 院微 生 物 研 究 所 ） 中 ； 磷 酸 盐 缓 冲液 （ 己配 制 ） 自 ； ７ １ 光 光 度 计 （ 海 第 三 分 析 仪 器 厂 ） ５ 分 上 ； 研 钵 （ 北 农 业 大 学 食 品学 院提 供 ） 东 ； 微 量 进 样 器 （ 北 农 业 大 学 食 品 学 院 提 供 ） 东 。
可 以用来 治疗 口腔和鼻腔 粘膜 发炎 ，且对 人体无 任何毒 副作
用 ，具 有 良好 的 医 疗 效 果 和 广 阔 的应 用 前 景 。 因 而 近 年 来 ， 溶 菌 酶 的 生 产 得 到 飞 速 的 发 展 ，工 业 化 规 模 不 断 扩 大 。但 在 生 产 过 程 中 ，溶 菌 酶 活 力 测 定 的 复 杂 性 始
溶菌酶活力测定实验报告
1. 掌握溶菌酶活力测定的原理和方法；2. 熟悉分光光度计的使用；3. 了解溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
二、实验原理溶菌酶（N-乙酰胞壁质聚糖水解酶）是一种能够催化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖水解的酶，从而溶解细菌细胞壁，起到杀菌作用。
测定溶菌酶活力时，可用细菌细胞壁作为底物，细胞壁溶解后，菌悬液浊度降低，通过分光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。
三、实验材料与试剂1. 试剂：1. 1mol/L氢氧化钠溶液；2. 1mol/L盐酸溶液；3. 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）：NaHPO·2H2O 0.392g，溶于蒸馏水并稀释至1000mL，调节pH至6.2；4. 牛肉膏培养基；5. 溶菌酶结晶标准品（酶活力单位为70000U/mg）。
2. 仪器：1. 分光光度计；2. 离心机；3. 移液器；4. 电子天平；5. 烧杯；6. 漏斗；7. 移液管。
1. 准备实验试剂和仪器；2. 配制0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.2）；3. 将枯草杆菌制成菌悬液；4. 将溶菌酶标准品稀释成不同浓度；5. 分别取不同浓度的溶菌酶标准品和菌悬液，加入反应体系中；6. 在分光光度计上测定菌悬液在450nm波长下的吸光度值；7. 根据吸光度值和溶菌酶标准品浓度，绘制酶活力曲线；8. 测定待测溶菌酶样品的酶活力。
五、实验结果与分析1. 酶活力曲线：根据实验数据，绘制酶活力曲线，结果表明酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系。
2. 待测溶菌酶样品的酶活力：根据酶活力曲线，计算待测溶菌酶样品的酶活力。
六、实验结论通过本实验，我们成功掌握了溶菌酶活力测定的原理和方法，熟悉了分光光度计的使用，并了解了溶菌酶对革兰氏阳性菌细胞壁的溶解作用。
实验结果表明，溶菌酶活力与溶菌酶浓度呈线性关系，为后续相关研究提供了实验依据。
七、实验注意事项1. 实验过程中，注意控制反应体系的pH值，以保证溶菌酶活性；2. 使用分光光度计测定吸光度值时，注意选择合适的波长；3. 实验过程中，操作要规范，避免污染。
溶菌酶的测定方法
溶菌酶的测定方法溶菌酶（lysozyme）是一种广泛存在于生物界的酶类分子，能够切断细菌细胞壁的三葡聚糖链（N-醋酸氨基葡庚糖-N-乳酸氨基葡庚糖-β1,4-N-乳酸氨基葡庚糖）。
溶菌酶的测定方法可以从不同的角度进行，包括溶菌酶活性的测定、溶菌酶的产量测定以及溶菌酶在生物体内的测定。
一、溶菌酶活性的测定方法：1. 醋酸甲酯法：该方法通过测量溶菌酶对醋酸甲酯的水解产生的醋酸乙酯的量来间接测定其活性。
首先使用醋酸甲酯制备醋酸乙酯标准曲线，然后将酶样液和醋酸甲酯复合反应一段时间，加入硫酸中断反应，测定产生的醋酸乙酯的吸光度，并通过标准曲线计算出酶的活性。
2. 改良的漆酶法：该方法以溶菌酶对大肠杆菌产生的透明圈直径为基础，通过测量透明圈的直径或面积来间接测定其活性。
方法简单易行，主要用于溶菌酶活性快速筛选。
3. 电导法：该方法基于溶菌酶在水溶液中产生的游离离子影响电导率的原理。
通过将一定浓度的酶溶液加入含有特定离子的缓冲溶液中，测定加入酶溶液前后的电导差异，从而计算出酶的活性。
二、溶菌酶的产量测定方法：1. 透明圈法：该方法将溶菌酶产生菌株接种于含有含有菌斑形成的凝胶平板上，经过一定时间后，用碘溶液显色，可在平板上观察到菌株周围出现的透明圈，通过透明圈的直径或面积来判断酶的产量。
2. 血凝法：该方法使用牛血液和凝血酶来测定溶菌酶产量。
将溶菌酶产生菌株培养得到的培养基与牛血液相混合，通过观察血凝情况来判断溶菌酶产量的大小。
三、溶菌酶在生物体内的测定方法：1. 酶活测定：通过采集动物的血液、组织或细胞，制备相应的提取液，然后通过测定其对某种特定底物的酶活性来间接测定生物体内溶菌酶的水平。
2. 分子生物学方法：通过采用PCR扩增技术、核酸杂交等方法，检测生物体内溶菌酶基因的表达水平和突变情况，从而间接测定生物体内溶菌酶的含量。
总结起来，溶菌酶的测定方法可以根据需求选择。
溶菌酶活性的测定方法主要包括醋酸甲酯法、漆酶法和电导法；溶菌酶的产量测定方法主要有透明圈法和血凝法；溶菌酶在生物体内的测定方法包括酶活测定和分子生物学方法。
溶菌酶活性的测定
溶菌酶活性的测定方法一1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成一定浓度的菌悬液（O.D.570=0.3，菌浓度为4×106cfu/mL）；3.取3.0 mL该悬液于离心管中，再加入50μl血清混匀，570nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于37℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。
公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法二1.取血，断尾或腹主动脉采血，在室温下静置1h，然后4℃冰箱中保持4h，2000r/min离心10min，取上层血清备用；2.用0.067mol/L的磷酸缓冲液(PBS,PH6.4)将溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)配制成0.2mg/ml的菌悬液；3. 3.0 mL该悬液于离心管中，再加入40μl血清混匀，540nm下测初始光密度值（A0）；4.然后将试液移于28℃水浴30 min；5.取出后立即置于冰浴10 min以终止反应，测反应后的光密度值（A）；6.计算。
公式：U=(A0-A)/AU：溶菌活力；A0：反应前光密度值；A：反应前光密度值方法三准确称取溶菌酶标准品，用pH 6.4，1/15 mol/L PBS配成1ug/mL，，临用时用PBS稀释成500，100，50，25，10 ug/mL标准液，用以制成标准曲线。
以溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）冻干粉为底物，用1/15 mol/L，pH 6.4磷酸缓冲液配成一定浓度的悬浊液（用722型分光光度计于640 nm测定并调整其浓度为透光率达30％-40％）。
溶菌酶的提纯结晶和活力测定.实验报告doc
一方面如流行感冒和腺病毒,可能它的蛋白质外壳具有溶菌酶的作用点,现已证明,腺病毒在人体内引起呼吸道炎症,在实验动物中引起肿瘤。因此,用溶菌酶可以治疗呼吸道疾患,抗动物肿瘤。另一方面溶菌酶作用的细菌产物可诱发产生干扰素,而干扰素主要功能是抗病毒。
(3)提高抗菌素疗效
因为抗菌素是微生物合成的代谢产物,通过抑制细菌细胞壁肤聚糖及核酸和蛋白质的合成,影响细胞膜,因而具有抑制或致死其他微生物的作用。而溶菌酶也作用于细胞膜,与抗菌素合用可提高疗效。
（3）本实验的酶活力单位定义为：每分钟A450nm下降0.001为一个活力单位（25℃，pH6.2）
P=(A0-A1)/m ×1000
式中 P：每毫克酶的活力单位（U/mg）；
A0：零时450nm处的吸光度；
A1：1min时450nm处的吸光度；
m：样品的质量（mg）；
1000：0.001的倒数，即相当于除以0.001。
(4)组织修复
一方面酞胺类溶菌酶已证明对细胞的生长、分裂起直接作用.另一方面溶菌酶作用的微生物细胞壁是含氮的多糖(叫粘多糖),它在组织生长和再生过程中起重要作用。日本学者在各种类型伤口的实验鼠中证明了溶菌酶的组织修复和临床治疗作用。
(5)促进血凝
实验证明:糖昔酶作用于鱼(节肢动物甲壳类),其分解产物一脂多糖具有凝胶化作用,通过激活凝血酶原,促进血凝,在人类临床上已用于牙科和泌尿科等小手术止血。
(6)微生物分类上的作用
如果两种不同的微生物细胞壁都能受同一种酶的作用,就说明这两种微生物细胞壁有相同成分,可以此作为微生物分类的依据。
(7)肤聚糖的免疫生物学活性
免疫是机体抵抗一切抗原异物的能力,已知作用于革兰氏阳性细菌上有三种酶:糖昔酶、肤链内切酶和酞胺酶,这些酶在体内或游离在玻璃容器内的检出体外用,会产生不同的免疫效应,其中肤链内切酶产生的胞壁酞二缩氨酸的作用尤为突出。最近日本学者研究发现溶菌酶可作为潜在检测金属免疫毒性的生物标志剂。
溶菌酶活力测定(艳红微球菌法)操作规程
溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）操作规程1.目的为保证溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）的准确性，特制定本规程2.范围适用于溶菌酶活力测定（艳红微球菌法）测定3.责任相关检验人员对本规程负责4.规程1.溶壁微球菌的培养将溶壁微球菌菌种于LB平板上划线，28℃培养48h后挑取单菌落于100mL的LB液体培养基中，28℃,200rpm摇床培养48小时后，将菌液离心，4000rpm，10min，收集菌体，用无菌水反复洗涤，离心数次，将菌体干燥后置-20℃保存待用。
2.0.1mol/L，pH6.2磷酸盐缓冲液的配制2.1先称取磷酸氢二钾17.42g，蒸馏水溶解并定容至100mL，配制成0.1M的磷酸氢二钾溶液，称取磷酸二氢钾13.61g，蒸馏水溶解并定容至100mL，配制成0.1M的磷酸二氢钾溶液。
2.2分别取1M磷酸氢二钾19.2mL和1M磷酸二氢钾80.8mL，混匀，加蒸馏水定容至1L即制得0.1mol/L ，pH6.2磷酸盐缓冲液。
3.溶壁微球菌悬液的制备称取-20℃保存的干燥溶壁微球菌菌体1g左右，用约100mL 0.1mol/L ，pH6.2磷酸盐缓冲液悬浮菌体，充分混匀，使其A450在0.6~0.8之间（临用前配制）。
4.溶菌酶标准酶活的测定4.1酶活性定义：在25 ℃，pH值为6.2条件下，在波长450nm处，每分钟使吸收度下降0.001所需的酶量为1个活力单位。
4.2酶活力测定方法：精密量取室温下的底物（溶壁微球菌）悬液2mL，置1cm比色皿中，然后迅速量取供试品溶液0.1mL，加入上述比色皿中，盖下紫外分光光度装置盖子，开始计时，记下反应15s和75s时的光吸收度A450，计算二者差值即每分钟吸光度下降数△A450。
以空白培养基作为空白对照，同法操作，记下反应15s和75s时的光吸收度A450＇，二者差值记为△A450＇。
4.3酶活力计算公式：酶活（U/mL）=[（△A450－△A450＇）]×D×104D为稀释倍数。
实验溶菌酶的粗提取、分离纯化及酶活力、纯度及分子量测定报告
2.离子交换填料：
离子交换剂由载体、电荷基团和反离子构成。
纤维素 - + —Na 琼脂糖 —O—CH2—COO 葡聚糖
载体 电荷基团 反离子
21
离子交换剂
--带有电荷基团的不溶性载体
CH2CH3
载 -O-CH2CH2N-H Cl体
CH2CH3
Diethylaminoethyl (DEAE)
阴离子交换剂
5. 酶活力及比活性计算：
U=(ODn-OD2)/0.001*T(min)*0.2 C(mg/ml)=A280/13 6. 纯化回收率及纯化倍数计算 US2*V2 US1*V1 S2比活力 S1比活力
回收率＝ 纯化倍数＝
×100％
42
7. 完成下表
样品 S1 S2 体积 ml V1＝ V2＝ 蛋 白 浓 度 总蛋白 mg/ml mg 活力 u/ml 比活力 u/mg 总活力 U 回收率 提 纯 倍 数 % 100 1
10
高速离心机
6000〜 25000
超速离心机
>25000Fra bibliotek离心的形式
角式及水平（外摆）式：水平式一般为低速。
角式由低速到超速均有。
11
角式离心机和离心头（转子）
角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作 注意稳、盖、旋紧。
12
离心管
材质：玻璃， 塑料 强度：和离 心速度相配 大小：和转 子配套 高速超速管 要加盖
称为1标准单位。
2.酶的比活力：
每单位酶蛋白所含的活力单位数。
对固体酶：用活力单位/mg酶蛋白、或活力单位
/mg酶蛋白氮来表示；
对液体酶：用活力单位/ml酶液来表示。
溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定-2
溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定-22．加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。
3. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。
过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。
对于CM Sepharose FF填料，最适流速在100cm/h以下。
因此，在我们的实验中，控制流速为2mL/min。
4．冲平过程一定不能省。
因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。
五、演示由于本实验装柱操作与实验一凝胶过滤层析的操作方法相同，所以演示略。
洗脱时，梯度混合器中高盐溶液与低盐溶液的放置。
依据洗脱目的进行。
如果是离子交换，采用低盐上样高盐洗脱的方式，就需要将低盐放置在靠近洗脱液出口的容器中。
如果是疏水层析，采取的是高盐上样低盐洗脱的方式，则将高盐溶液放置在靠近洗脱液出口的那个容器中。
注意老师的演示。
六、实验报告1．如实完整地记录实验流程、现象及结果；分析记录仪上所绘制的峰型与所分离的蛋白质纯度的关系。
2. 实验报告中必须包含原始数据以及洗脱曲线图（同组可以复印同一张图）本实验的数据处理：根据酶的动力学特性可知，在特定的时间段，酶促反应的速度是相等的，即产物浓度随时间成线性变化。
根据此特性，将所得数据在坐标纸上作图，以时间为横轴，OD595值为纵轴，将数据定位后，根据拟合直线的斜率，即为单位时间内OD值的下降值，然后再除以0.001，即可得到所取测量酶液的活力单位。
除以酶液体积，即可得到酶浓度（u/mL）。
溶菌酶活力单位(U)=△OD/0.001其中△OD为一分钟内OD值的下降值。
八、背景资料（一）离子交换树脂离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。
网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。
在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
0
30
60
90
溶菌酶活力的测定
• 实验数据处理ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ酶活力单位（U）的定义是：在25℃，pH6.2，波长 为450nm时，每分钟引起吸光度下降0.001为1个 活力单位。 酶的活力单位数=△A450/t×0.001 比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单位是 u/mg。比活力越高则酶越纯。 比活力=活力单位/mg蛋白
溶菌酶活力测定
掌握溶菌酶的活力测定的原理和方法
溶菌酶活力的测定
酶活力测定原理 溶菌酶又叫胞壁质酶，N-乙酰胞壁质聚糖水解酶。能催 化某些细菌（革兰氏阳性菌）细胞壁多糖的水解，从而溶解 这些细菌的细胞壁，起到杀死细菌的作用。 测定溶菌酶活力时，可用某些细菌细胞壁做底物，细胞 壁溶解，细菌解体后，菌悬液浊度降低，因此，可以通过分 光光度法测定菌悬液浊度变化，计算溶菌酶活性。 本实验以溶壁微球菌为底物，通过测定细菌悬液浊度的 变化（OD450）来测定溶菌酶的活性。 溶壁微球菌为革兰氏阳性；生长最适温度为25℃-30℃。
溶菌酶活力的测定
3 酶活力的测定
将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～ 15min, 吸取底物悬浮液3mL放入比色杯中测底物悬液的 OD450 值,作为对照。然后加入酶液0.2mL,迅速摇匀。从加 酶时开始记时, 每30s测1次OD450值,共测3次。 按下列表格记录是按结果：
时间/s OD450
溶菌酶活力测定
实验仪器、材料及试剂 （一）仪器 分光光度计 （二） 材料及试剂 溶菌酶，0.1mol/L pH6.2磷酸缓冲溶液， 溶壁微球菌干粉, 烧杯，玻璃棒，量筒
溶菌酶活力测定
操作步骤
1、溶菌酶液配制：准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L磷 酸缓冲液5ml溶解成1mg/ml的酶液，再用0.1mol/L磷酸缓冲 液稀释4倍，即为酶应用液。 2、底物配制：取干菌粉5mg加缓冲液少许，在乳钵中（或 匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光 电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。