细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识
细菌内毒素测定技术—细菌内毒素检查方法
知识点：光度测定法
四、结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释
倍数后小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定；若 大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容 器，如微孔板中的孔。
技能点：凝胶限度试验操作规程
检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制 备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供 试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内 毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不 符合规定。
知识点：光度测定法
一、方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度 变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终 点浊度法和动态浊度法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产 生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素 含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色 法。
试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品 符合规定；否则判定供试品不符合规定。
技能点：凝胶限度试验操作规程
4、阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标 示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或 稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应 试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现 阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染，试验器具污染，试验过 程操作不当污染造成。
A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
中国药典细菌内毒素检测方法
检测细菌内毒素的方法
1、热原检查
通常以家兔作为试验介质，检查在规定时间里观察家兔的体温变化，反应了热原物质引起哺乳类动物的体温反应过程。
2、凝胶法
通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理进行限度检测或半定量检测内毒素的方法。
3、光度法
浊度法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。
显色基质法
利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。
中国药典 细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。
首先，制备试样溶液。
将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。
然后，制备标准溶液。
将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。
接下来，准备试管。
将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。
然后，进行混合。
轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。
接着，培养细菌。
将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。
培养结束后，观察结果。
通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。
最后，记录结果。
根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
➢内毒素检测人员应经过严格的培训，并应配备相 应的防护设施（如穿防护服、戴口罩、头套等）。
——2010年版药品GMP实施指南
7 样品
➢β-葡聚糖样物质的影响 ➢PH值的影响 ➢金属离子和弱酸阴离子的影响 ➢药物浓度的影响
1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
二、影响试验结果的因素分析
鲎试剂 细菌内毒素工作标准品 细菌内毒素检查用水 环境 实验器皿 实验人员 样品 试验
1 鲎试剂
➢质量标准：WS1-363（B-123）-91 性状、鉴别、检查、灵敏度测定、 用途、规格、贮藏
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
2） 湿度 ➢ 吸潮 ➢ 灵敏度增高 ➢ 挥发
5 实验器皿
➢器皿的计量管理（校正） ➢器皿的选择标准 ➢器皿的正确处理
1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的玻璃刻度移液管 或精密移液器。注射器刻度不精确，内壁磨沙 面吸附内毒素，而且要特别注意注射器针头引 入的铁离子对试验结果的干扰，故不宜选用注 射器。
内毒素检测标准及方法
内毒素检测标准及方法
内毒素检测的标准及方法主要包括以下几个方面：
检测标准：
1.细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显
色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
2.细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）
相当。
检测方法：
内毒素检测主要使用鲎试验法，这是国际上至今为止检测内毒素最好的方法，具有简单、快速、灵敏、准确的特点，被欧美药典及我国药典定为法定内毒素检查法，并已被世界各国所采用。
鲎试剂按实验方法可分为凝胶法、动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法。
其中凝胶法操作简单、经济，不需要专用测定设备，可以进行定性或半定量测定。
请注意，进行内毒素检测时应严格遵守相关标准和操作规范，确保结果的准确性和可靠性。
细菌内毒素检查法介绍：
细菌内毒素检查法介绍：细菌内毒素检查法介绍：细菌内毒素检查法是判断供试品中细菌内毒素是否符合规定。
内毒素(Endotoxin)即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A。
菌体死亡崩解后释放出来。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
细菌内毒素检查法正常值：体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡。
细菌内毒素检查法临床意义：热原主要是细菌释放的一种内毒素，热原进入机体血液循环系统会引起发热等一系列不良反应，因此，注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射剂安全性的重要质量指标。
异常结果：临床上在进行静脉滴注大量输液时，由于药液中含有热原，病人在0.5～1h内出现冷颤、高热、出汗、昏晕、呕吐等症状，高热时体温可达40℃，严重者甚至可休克细菌内毒素检查法注意事项：在细菌内毒素检查方法的建立中，计算内毒素限值L、MVD和MVC时，需要注意最大人用剂量、产品规格、鲎试剂的灵敏度等重要的参数，因为计算错误会导致后续的所有努力均告失败。
常见的问题有：(1)临床用药剂量确定不正确，仅用常规用药剂量，未考虑临床可能的人体最大用药剂量和给药途径，在限值计算公式L=K/M中，由于对K值及M值的定义模糊，使K值及M值赋值不准确，最终导致限值计算错误。
例如，某注射剂临床成人每次静脉滴注给药40～80mg，婴儿(三个月以上)静脉滴注给药每次10～20mg。
按成人(体重60kg)剂量计算限值为3.75EU/ mg，而婴儿体重仅为5kg左右，计算限值约为1.25EU/mg，如果不考虑临床每公斤体重最大用药剂量，细菌内毒素限值就会出现较大的差别。
(2)有的申报品种细菌内毒素限值不是根据临床用量计算出来，而是根据同品种热原检查的剂量推算出来的，造成限值错误。
(3)有的品种细菌内毒素限值从国外药典抄来，没有考虑该品种国内上市的临床使用剂量及中国人与国外人均体重等的差异，也造成限值确定不正确。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识
摘要：由于方法本身的优越性，采用细菌内毒素检查法取代热原法的国内申报资料逐年增加，但部分资料仍存在一定缺陷，本文对该法及其影响因素、质控要点等进行简要评述，以期申请人注意规范对该部分的研究工作。
关键词：细菌内毒素方法学
热原检查法或细菌内毒素检查法是注射制剂的关键质控指标之一。
一直以来，热原检查在药物研发中广泛使用，方法比较成熟，目前药典和其他国家标准中有很多品种采用热原检查，但热原检查易受试验动物个体差异，方法灵敏度、药物本身性质（某些药物如乳糖酸红霉素引起降温，青霉素往往也有类似作用，两性霉素B 可引起升温）等影响，使用受到一定限制；细菌内毒素法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，检测供试品中细菌内毒素的限量的方法，由于方法灵敏度高、准确、快速和经济等优点，已在各国药典中得到推广。
当然也仍有部分药物因为药物干扰等其他因素无法使用细菌内毒素检查法。
上述两种方法目前都是可行的内毒素物质检查方法，在实际应用过程中可以结合药物本身性质进行选择。
但在审评中发现，由于细菌内毒素检查法国内研究时间不长，导致部分注册申请人在药物研发时对细菌内毒素检查法的认识上存在一定偏差，本文希望通过对该方法的方法学和限值计算的相关介绍，使研发者增进对细菌内毒素检查法的认识，提高药物研发水平。
关于细菌内毒素的研究方法，中国药典2000年版纳入的细菌内毒素检查法为凝胶法（附录XI E），在细菌内毒素检查应用指导原则中（附录XIX F）提出了浊度法和显色基质法。
即将执行的中国药典2005年版将两部分进行了合并，并进行了修订，纳入了凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
浊度法是测定凝胶形成过程中的浊度变化，可进一步细分为终点浊度法和动态浊度法，在做细菌内毒素定量测定时，检测波长一般为360nm。
显色基质法是测定特殊底物释放出来的生色团，也可分为终点显色法和动态显色法，定量测定的检测波长一般为405nm或545nm。
影响细菌内毒素检查结果的因素较多，一般包括：试剂因素（鲎试剂、内毒素标准品）；样品因素（pH值、温度、离子强度、浓度、可发生鲎试剂反应的非内毒素杂质）和实验因素（试验器皿、细菌内毒素检查用水、鲎试剂的抗干扰能力）等等。
中国药典要求在实验前必须对试验器皿进行处理、复核鲎试剂灵敏度、考察供试品干扰试验等，以排除上述干扰，避免假性试验结果。
上述试验实际上是方法学验证过程，以保证该方法的准确性和可信性。
方法确定之后，就需要根据品种用法用量等具体情况测算细菌内毒素限值。
内毒素限值指单位药物（制剂）所含内毒素的最大浓度，中国药典2000年版和2005年版均采用公式
L=K/M计算。
其中K指注射途径内毒素致家兔发热阈剂量，或病人无任何不良反应的内毒素阈剂量，实际计算时为5EU/kg。
M一般可以理解为每公斤体重1小时内给予药物的最大量（药物用量或输液体积）。
对于静脉滴注制剂，通常采用1小时内输注的剂量，对于皮下肌肉或静脉注射，一般采用单次剂量计算。
例如注射用头孢哌酮钠，其临床单次使用最大量为2g，按60kg、每小时所折算的限度应为0.15EU/mg。
在实际操作过程中，根据惯例或者提高药品质量的要求，一般各国药典均在上述计算最高限度基础之上将限度要求提高2-3倍，如中国药典2005年版注射用头孢哌酮钠的细菌内毒素限值即为0.05EU/mg。
以上是细菌内毒素方法和限值计算的简要介绍。
由于GMP的实施、细菌内毒素检查方法的经济性、药检所检查的方便性和准确性等因素，目前采用该法的申报资料逐年上升，已逐渐取代了热原检查法的地位，这体现了细菌内毒素检查方法本身的优越性，但部分申报资料中也或多或少存在一定问题，如：仅仅按照中国药典要求对该项进行检查，忽视了对方法学的验证，试验结果可信度低；另外由于不同厂商生产的鲎试剂其生产工艺、配方、质量参数
等存在一定的差异，鲎试剂其抗干扰能力存在差别，但申请人忽视了对鲎试剂的选择，或对鲎试剂灵敏度的考察。
在实验过程中未考察供试液浓度、pH值的影响，未进行干扰性试验等致使出现假阴性和假阳性试验结果；部分申请人未结合药物具体的临床用量，设置的细菌内毒素限值要求偏低，无法满足安全性要求；稳定性考察过程中，不注意选取安全性指标如细菌内毒素项目在最后时间点进行考察，不能对制剂的生物学稳定性有充分的把握；等等。
凡此种种，都一方面可能影响申报进度，另一方面也不利于对产品安全性的全面认识，因此我们建议申请人在后续品种的研发和申报过程中，能够不断规范对细菌内毒素的研究工作。
以上为个人观点，希望与大家就此展开进行讨论交流，共同提高对细菌内毒素研究工作的认识。