(优选)实验六蚕豆根尖微核检测技术学时综合性设计性
蚕豆根尖微核技术实验方案
实验方案(蚕豆根尖微核技术)
一、实验题目
蚕豆根尖微核技术检测流仓河污水污染情况
二、实验目的
1、利用植物压片技术和微核实验原理，设计实验方案，研究环境中存在的毒害物；
2、理解环境致突变因子对生物体DNA的损伤
3、掌握环境因子遗传毒性检测的微核实验方法
4、培养初步的科研能力
三、材料仪器与方法
1.1材料仪器
选取蚕豆大小均匀籽粒饱满无虫害100颗，采集于流仓河污水，烧杯，剪刀，培养皿，量筒100ml，，胶头滴管，显微镜，卡诺固定液，5 mol/L盐酸，石炭酸品红溶液，天平（带砝码）
1.2方法
1.2.1污水处理
将采集到的污水稀释100倍、10倍、不稀释，用自来水做对照
1.2.2蚕豆根尖的培养处理
将蚕豆用蒸馏水浸泡一天使其充分吸胀，然后用滤纸浸水放于培养皿中在25℃恒温箱中培养24h。
每12小时换水一次。
待蚕豆初生根长至2cm左右，选取长度一致的蚕豆，分别用蒸馏水，1倍稀释液，10倍，50倍，100倍，分别处理6h，其中蒸馏水作为阴性对照处理。
然后再放于25℃恒温箱恢复培养24h。
卡诺固定液固定24 h；固定好的幼根以蒸馏水浸洗两次，用5 mol/L的盐酸于28℃水解约25 min，至幼根被软化即可；然后用蒸馏水洗净切取0.5cm的根尖，用改良的石炭酸品红溶液染色5~10分钟。
1.2.3制片
用常规压片法制作临时装片。
1.2.4镜检计数
每剂量组选取5个根尖，每个根尖随机镜检1000个细胞，计算微核率MCN‰=观察到微核细胞数/观察细胞总数*1000‰。
环境生态学 (蚕豆实验)
蚕豆根尖微核实验实验方案第一组姓名学号龚丽桦20110442001王春20110442002周鹏20110442003蔡梣仪20110442006贺吉20110442007李彦欣20110442008蚕豆根尖微核实验一、实验目的1.通过“环境遗传物质污染的微核指示”的综合实验过程，加强学生对环境污染的遗传毒性的感性认识，掌握环境污染物对生物遗传物质及生理过程的改变及生物对环境污染物的指示作用。
2．掌握微核试验相关操作技术。
3．使学生在复习和巩固基本理论知识的同时，能深刻认识环境污染物质对环境中生物的危害，增强学习环境科学的兴趣和责任感。
4．通过本综合性实验，培养学生独立观察、思考及分析、研究、解决实践问题的能力。
二．实验内容微核试验(Themicro nucleu stest, MNT)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。
微核是无着丝点的染色体断片，在有丝分裂后期不能向两极移动，所以游离于细胞质中，在间期细胞核形成时，即可在它附近看到一到几个很小的圆形结构，直径大约是细胞直径的 1 ／ 20 － 1 ／ 5 ，这就是微核（ micronucleus ）。
微核是常用的遗传毒理学指标之一，指示染色体或纺锤体的损伤。
由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧，而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比，因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的损伤程度。
蚕豆(Vicia faba)是一种理想的细胞遗传学研究材料。
蚕豆的染色体大，数量少(2n=12),根尖中含有较多的分裂相细胞，非常适合显微观察，而且蚕豆根尖细胞周期中的大部分时间对诱变剂敏感，便于遗传毒性检测实验。
（一）实验仪器、试剂和材料A．实验材料：蚕豆种子B. 实验器材：光学显微镜、试管(10ml)×2、蚕豆发芽盒、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、滤纸等C. 试剂[1] 环磷酰胺：用其与水可溶剂配置系列溶液：0%（对照），5%，10%，20%。
微核畸变实验报告
一、实验目的1. 了解微核畸变的原理和实验方法。
2. 掌握微核畸变检测技术，分析实验结果。
3. 培养学生严谨的实验态度和科学探究精神。
二、实验原理微核畸变是指在细胞分裂过程中，染色体发生断裂、缺失、易位等异常现象，导致染色体片段无法正常分离，形成微核。
微核畸变是生物体受到物理、化学、生物等因素作用后，染色体畸变的重要表现形式之一。
本实验采用植物根尖分生组织作为实验材料，利用植物组织培养技术，诱导微核畸变，并通过显微镜观察、计数和统计分析，研究微核畸变的形成机制。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：蚕豆种子、0.01g/mL龙胆紫溶液、15%盐酸、95%酒精、蒸馏水等。
2. 实验仪器：显微镜、解剖镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、培养皿、培养箱等。
四、实验步骤1. 种子萌发：将蚕豆种子浸泡于水中24小时，取出后播种于培养皿中，置于培养箱中培养，待幼苗长出3-5片真叶时，选取生长状况良好的幼苗。
2. 根尖培养：将幼苗的根尖剪下，放入装有蒸馏水的培养皿中，置于显微镜下观察，待根尖伸长到2-3mm时，取出根尖。
3. 解离：将根尖放入装有15%盐酸和95%酒精的混合液中，在室温下解离5-10分钟。
4. 漂洗：用蒸馏水冲洗根尖，去除解离液。
5. 染色：将根尖放入装有0.01g/mL龙胆紫溶液的培养皿中，染色5-10分钟。
6. 制片：将染色的根尖滴在载玻片上，盖上盖玻片，制成临时装片。
7. 观察：在显微镜下观察，记录微核畸变的细胞数量。
8. 统计分析：对实验数据进行统计分析，计算微核畸变率。
五、实验结果与分析1. 实验结果：在显微镜下观察，发现部分细胞中出现微核畸变，微核数量随实验时间延长而增加。
2. 结果分析：本实验结果表明，植物根尖分生组织在受到一定外界因素作用后，可发生微核畸变。
微核畸变率随实验时间延长而增加，说明微核畸变具有一定的累积效应。
六、实验结论1. 本实验成功诱导了植物根尖分生组织的微核畸变，验证了微核畸变检测技术的可行性。
诱变物质的微核检测技术—蚕豆根尖微核检测与应用
v 更多问题……
五、 实验流程——准备工作 ——
v 每个自然班分成4个组
§ §
人数基本相同、确定每小组的组长 确定试验目的、各小组所用的处理因素(阴性 对照、阳性对照、两种污水处理) 上报分组名单(组长)、试验目的、因素 实验开始前提交试验方案(班内协调、统一时 间安排)
§ §Leabharlann 实验工作时间安排参考§
若干种待测诱导物(如不同来源的污水)，由各 组同学采集 阳性对照(NaN3)：已证明可诱导微核形成 阴性对照(洁浄水样)：微核形成率接近于0
§ §
五、 实验流程
准备工作 § 查阅文献 § 确定研究目的 • 如：待测物、蚕豆品种差异等 § 制订试验方案 v 蚕豆发根、取材 v 处理与恢复培养 v 取材制片、镜检观测 v 结果分析、撰写报告(论文)
诱变物质的微核检测技术 诱变物质的微核检测技术
——蚕豆根尖微核检测与应用 —— 蚕豆根尖微核检测与应用 (综合型实验) (
四川农业大学 普通遗传学课程组
提 纲 纲
1. 实验目的 2. 实验原理 3. 实验材料 4. 用具与药品 5. 实验流程
一、 实验目的
v v v
了解诱变物质微核检测技术原理与应用 掌握蚕豆根尖微核检测技术 了解研究性试验开展的基本环节
§ §
实验教学角度：综合性实验 实验内容角度：研究性试验(非验证性实验)
二、 实验原理
u u u
微核的概念与形成 微核检测技术 微核检测的应用
（一）微核的概念与形成
v
微核(micronuclei, MN/MCN)
天数 工作内容 方案、材料与待测物准备 1 2 3 5 6 7 8+ 浸种(其间换水两次) 第一阶段催芽 第二阶段催芽(其间检查水分) 诱导处理 恢复培养 根尖取材、固定 解离、制片观察 结果分析与报告写作 24h 12~24h 36~48h 12~24h 22~24h 24h 2~4h 大致时间 注意 班、组 自然班 组 组 组 组 组 组 组
蚕豆根尖微核检测汇总
蚕豆根尖微核检测汇总蚕豆根尖微核检测一、实验背景和目的本组实验运用蚕豆根尖微核检测技术，分别用不同牌子0.25mg/mL洗发露(欧莱雅、力士、沙宣)对蚕豆根尖做处理，同时以0.25mg/mL的醋酸铅溶液处理蚕豆根尖做阳性对照，自来水作阴性对照。
洗发露是我们生活中的日用品，洗发露主要成分为:界面活性剂，也就洗干净的成分。
以SLS及sls的乙基衍生物类:月桂醇聚醚硫酸酯钠盐、十二酯硫酸铵(月桂酸硫酸酯纳)为主，SLS争议很多，主要表现在对皮肤的刺激性，容易让你头皮变得敏感，虽然SLS也有用在牙膏中，但是在舒适达等国外牙膏中，是没有SLS的存在的，从这一点上，也看出SLS的刺激性是厂商的心知肚明的。
微核(micronucleus, 简称MCN)，也叫卫星核，是真核类生物细胞中的一种异常结构，是染色体畸变在间期细胞中的一种表现形式。
微核往往是各种理化因子，如辐射、化学药剂对分裂细胞作用而产生的。
在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。
微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具合成DNA的能力。
一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的。
有实验证明，整条染色体或几条染色体也能形成微核。
这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。
当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即形成了微核。
已经证实，微核率的大小是和作用因子的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点与染色体畸变的情况一样。
所以许多人认为可用简易的周期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。
由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出等都存在污染环境的可能性，欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，需要有一套高度灵敏，技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。
只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。
蚕豆根尖微核检测
蚕豆根尖微核检测指导老师：吴麟组长：路青瑜小组成员:何悦李婷陈鸿谭小娥刘清唐珍冯沁李双吴海林符方亮摘要：本实验运用蚕豆根尖微核检测技术，分别用0.25mg/mL染发剂、0.5mg/mL 洗洁精对蚕豆根尖做处理，同时以0.25 mol/L叠氮化钠处理蚕豆根尖做阳性对照，自来水作阴性对照。
镜检后测得其微核率分别为17.55%，19.82%，23.18%，11.16%；染发剂、洗洁精处理的污染指数分别为1.7、1.8，结果表明均属于轻度污染。
关键词：蚕豆微核检测微核率Abstract：This experiment using vicia faba micronucleus test technology, respectively for 0.25 mg/mL colourants, 0.5 mg/mL of vicia faba detergent, at the same time to do processing mol 0.25 / sodium azide processing vicia faba do positive, negative control for water. After the microscopic micronucleus rate 17.55% respectively, 19.82%, 23.18%, 11.16%, Hair, detergent pollution index respectively with 1.7, 1.8, results show that belong to light pollution.Key word：Horsebean micronucleus test；micronucleus rate引言：染发剂和洗洁精都是我们生活中的日用品，特别是洗洁精。
化学去污剂主要分为阳离子型、阴离子型和非离子型3类(其中阴离子型表面活性剂使用频率最高)。
实验六蚕豆根尖微核检测技术学时综合性设计性(ppt)
蚕豆根尖微核检测记录表
试验号
镜检日期
片号
第一片
各自观察的细胞 细胞数 微核数
数或微核数
镜检者
第二片
第三片
细胞数 微核数 细胞数 微核数
总计 平均微核千分率
实验六蚕豆根尖微 核检测技术学时综 合性设计性(ppt)
（优选）实验六蚕豆根尖微核 检测技术学时综合性设计性
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各 样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术 简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系 统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传 危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且 有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率 可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、 辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及 癌症前期诊断等各方面。
五、实验方法
1．实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对
诱变因子反应敏感。松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中 筛选出来的一种较为敏感的品种。本品种引入后在栽 培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷 洒农药、以保持该品种较低的本底微核值。也可用其 它蚕豆品种，但是必须设置对照组。种子成熟后，晒 干贮藏于干燥器内或4℃冰箱内备用。
3． 处理
每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的 种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。 阳性因子可采用CrO3（1.0和2.5 mol/L）、NaN3 （0.5、1.0和1.5mol/L）或EMS（150和200 mol/L）， 另取一处污水作待检测物质，用自来水作对照，共9 个处理，处理根尖6～24h(处理时间可视实验需要和 被测液浓度而定)。
蚕豆根尖微核试验的应用与发展
癌变·畸变·突变 1999年第11卷第3期 Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis Vol11No31999蚕豆根尖微核试验的应用与发展臧 宇 综述 薛开先 审校江苏省肿瘤防治研究所 南京 210009 蚕豆根尖微核试验在1986年已被中国环保局列为一种水环境生物测试的规范方法。
它作为一种环境致突变性的检测手段,在我国不少地区的环保部门和医疗卫生系统中都有广泛的应用。
近十多年来仅国内关于蚕豆根尖微核试验的论文就已达百余篇。
本文在前人工作积累的基础上,对蚕豆根尖微核技术的理论、方法学和应用方面做一个阶段性的综述,希望有助于有关学者和工作人员全面了解本方法以及今后的改进和普及。
1 研究背景蚕豆(V icia f aba)是一种很好的细胞遗传学研究材料。
蚕豆的染色体组型为六对相当大的染色体,而且根尖含有较多的分裂相细胞,非常适合显微观察。
早在1959年,放射生物学家已经用蚕豆的根尖细胞来进行X射线的遗传损伤研究。
到了70年代,蚕豆根尖染色体畸变技术已发展得相当成熟,作为一种检测化学品遗传学毒性的方法为人们所知,并广泛采用。
而蚕豆根尖的微核试验是1982年由Degrassi 和Rizzoni正式介绍的(1),他们指出微核试验与染色体畸变试验同样具有准确、快速、有明显的剂量—效应关系等特点,操作更简便,也更适于大批量样品的检测。
美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖细胞学试验在环境致突变性检测中的作用,对许多环境致癌物都作了标准化的试验,建立了庞大的数据库,并建议在全世界范围内推广(2)。
蚕豆根尖细胞微核实验的测试终点是微核出现的频率。
微核是常用的遗传毒理学指标之一,指示染色体或纺锤体的损伤。
由于这种损伤会因细胞受到的外界诱变因子的作用而加剧,而微核产生的数量又可与诱变因子剂量的强弱呈正比,因此可以用微核出现的频率来评价环境诱变因子对生物遗传物质的程度(3)。
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也可以采用“污染指数”判别：此方法可避免因实验 条件等因素带来的MCN‰本底的波动，方法如下：
污染指数在0－1.5区间为基本没有污染； 污染指数在1.5－2区间为轻度污染； 污染指数在2－3.5区间为中度污染； 污染指数在3.5以上为重度污染； 如果对照本底MCN‰为10 ‰以上，可采用t检验（被 测样品较少时）检测处理液致畸效果是否明显，或以 F检验（被测样品较多时）检测各处理之间是否具有 显著的差异。
五、实验方法
1．实验材料的培育 蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而对
诱变因子反应敏感。松滋青皮豆是从不同蚕豆品种中 筛选出来的一种较为敏感的品种。本品种引入后在栽 培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷 洒农药、以保持该品种较低的本底微核值。也可用其 它蚕豆品种，但是必须设置对照组。种子成熟后，晒 干贮藏于干燥器内或4℃冰箱内备用。
2．浸种催芽：
将实验用蚕豆种子按需要量放入盛有蒸馏水的烧 杯中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两 次．所换水应25℃预温。种子吸胀后；用纱布松散 包裹置白磁盘中，保持湿度，在25℃温箱中催芽12 －24小时，待初生根长出2—3mm时，再取发芽良好 的种子，放入铺满滤纸的磁盘中，25℃继续催芽， 经约36～48小时．大部分初生根长至1～2cm左右， 根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。
4．根尖细胞恢复培养
将处理后的种子用蒸馏水浸洗三次，每次2－3min。 将洗净的种子再放入铺好滤纸或脱脂棉的白磁盘内 25℃温箱中恢复培养22－24小时。
5．固定根尖细胞及制片(参考根尖压片法)
(1)将恢复培养后的种子，从根尖顶端，切下1cm长的 幼根。用卡诺氏液固定24h，固定后如果不及时制片， 可换入70% 的乙醇中，置4℃冰箱内保存备用。
七、注意事项：
1. 各种诱发微核的处理试剂具有一定毒性，请注意 使用安全，并防止污染环境。 2.凡数值在上下限时，定为上一级污染。 3.对严重污染的水环境进行检测时，检测处理会造 成根尖死亡，应稀释后再作测试； 4.在没有空调恒温设备时，如室温超过30℃，MCN 本底可能有升高现象，但可经污染指数法数据处理， 不会影响检测结果。
6．酸解：
从70％乙醇中取出固定好的根尖→流水冲 洗３min→吸水纸吸干→放入盛有适量1 mol/L HCl，60±0.5℃水浴保温的青霉素瓶中→解离 10min。
7．染色 改良石炭酸品红染色：
解离后材料水洗3min并吸干，挑取1个根 尖的乳白色分生组织于载玻片上夹碎捣烂，滴 加1～2滴染液，染色10～15min，压片。
六、实验数据的统计处理和污染程度划分
将实验数据按以下步骤进行统计学分析处理： 1． 计算各测试样品（包括对照组）微核千分率（MCN‰） 如果对照本底MCN‰为10 ‰以下，可采用如下标准进行 分析以确定样品的污染程度： MCN‰在10‰以下，表示基本没有污染； MCN‰在10‰－18‰区间，则表示有轻度污染； MCN‰在18‰－30‰区间，则表示有中度污染； MCN‰在30‰以上，则表示有重度污染；
利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试，可准确 的显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的 监测。
三、实验材料
松滋青皮豆（蚕豆）种子
四、实验器具、药品试剂
实验器具：显微镜，计数器，镊子，载玻片，盖玻片， 烧杯，瓷盘等。 实验药品：6mol/L盐酸，甲醇，冰乙酸，醋酸洋红， EMS(甲基磺酸乙酯)处理液： 150, 200mmol/L 2种处理浓 度。 NaN3(叠氮钠) 处理液：0.5, 1.0, 1.5mmol/L 3种浓度。 CrO3：1.0，2.5mol/L 2种处理浓度 污水：
蚕豆根尖微核检测记录表
试验号
镜检日期
片号
第一片
各自观察的细胞 细胞数 微核数 数或微核数
镜检者
第二片
第三片
细胞数 微核数 上加一滴染液，盖上盖玻片，
覆一层吸水纸，用带橡皮头的铅笔垂直敲打，或以 拇指垂直紧压盖片(注意勿使盖片搓动)，使材料分 散压平，便于观察。
9．镜检及微核识别标准
首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂 相较多的部位，再转高倍镜观察。 微核识别标准： （1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。 （2）小核着色与主核相当或稍浅。 （3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。 每一处理观察3个根尖，每个根尖计数1000个细胞中 的微核数并进行记录。
3． 处理
每一处理选取6-8粒初生根生长良好、根长一致的 种子，放入盛有待测物溶液的培养皿中，浸没根尖。 阳性因子可采用CrO3（1.0和2.5 mol/L）、NaN3 （0.5、1.0和1.5mol/L）或EMS（150和200 mol/L）， 另取一处污水作待检测物质，用自来水作对照，共9 个处理，处理根尖6～24h(处理时间可视实验需要和 被测液浓度而定)。
（优选）实验六蚕豆根尖微核 检测技术学时综合性设计性
由于大量新的化合物的合成，原子能应用，各种各 样工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏、技术 简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核的测试系 统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传 危害，在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。且 有研究显示以植物进行微核测试与以动物进行的一致率 可达99%以上。目前微核测试已经广泛应用于辐射损伤、 辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及 癌症前期诊断等各方面。