基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用

基因打靶技术在构建基因敲除或敲入细胞系中的应用时文涛，邵荣光（中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所，北京100050）摘要：同源重组介导的基因打靶技术是一项判定哺乳动物基因功能的强有力工具。

在过去的十几年中，应用于转基因小鼠的基因敲除∕敲入技术经过必要的完善后进一步被应用于人源细胞。

本文介绍了在人源细胞系中基因打靶技术应用的优势与局限性、可应用细胞系的选择、基因打靶的基本方法，并比较系统地讲解了重组腺相关病毒介导的基因打靶的实验设计，以使读者对这项技术的应用有一个基本的了解。

关键词：基因打靶；基因敲除∕敲入；重组腺相关病毒The Application of G ene T argeting T echnology in C onstructionstructing ng G eneK nockout and K nockin C ell L inesWen-tao Shi，Rong-guang Shao（Institute of Medicinal Biotechnology,Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing100050,China）Abstract：Homologous recombination-mediated gene targeting technology is the most powerful technique available for analysis of mammalian gene function.Over the past decade years,the methods used to generate knockout and knockin mice have been modified for use in cultured human cells.In this paper,the advantages and limitations of gene targeting technology,suitable cell lines for gene targeting and the basic method for generating knockout/knockin cell lines are introduced.Moreover,we also systematically describe the experimental design of rAAV-mediated gene targeting to enable readers to basically understand the application of this technology. Key words：Gene targeting；Knockout；Knockin；rAAV基金项目：教育部博士点基金（No:20070023017）同源重组介导的基因敲除（knockout）∕敲入（knockin）技术是一项判定基因功能的强有力工具，这种基因打靶技术已经帮助人们在一定程度上认识了某些细胞或动物个体异常表型的遗传基础。

应用这种技术产生的模式生物（例如基因敲除小鼠）对人类基因进行研究已经广泛开展[1]，早在1999年就有超过800个小鼠种系被报道[2]。

比较基因敲除小鼠而言，对人类体细胞基因敲除或基因敲入细胞系构建的报道相对较少，但这项技术对于在细胞水平上分析某些人源基因参与的生化或生理途径是不可替代的。

基因打靶技术最常见的应用是通过连续使所有等位基因失活，建立基因敲除细胞系。

另外，这种技术还可以用于将外源序列引入内源基因，建立基因敲入等位基因，小到引入单碱基替换，大到引入报告基因[3]。

本文主要介绍了基因打靶技术的基本原理以及最近发展起来的腺相关病毒介导的基因打靶技术的基本应用。

1基因打靶技术应用的优势与局限性迄今为止，在所有使细胞系中特定基因失活的技术中，应用最多的是引起基因表达下调的RNA干扰（RNAi）技术。

与同源重组介导的基因打靶技术相比，RNAi技术应用起来更方便、快捷，成本较低，且适合于高通量筛选[4]。

但是，RNAi结果在不同的实验室及不同的实验之间会有一定差别，而且RNAi只能用于下调而不能彻底消除基因的表达，故其不能用于不同遗传变异体之间的比较，无法彻底取代基因敲除∕敲入技术。

其他的一些基因操作技术，例如过表达显性失活突变，也取得了相当的成功，但其明显不能精确地重演自然发生的遗传改变。

由此可见，基因敲除∕敲入技术有其独特性，可以用于帮助解决许多用其他实验方法无法解决的问题。

像所有实验系统一样，针对人体细胞的基因敲除∕敲入技术既有其独特的贡献，也有明显的局限性，最主要的局限性是这项技术大多应用于培养的人肿瘤细胞。

在肿瘤细胞形成时会产生很多获得性或选择性遗传改变，从而使肿瘤细胞与正常细胞有很明显的差别[5,6]，所以当我们应用一种遗传背景不完全清楚的细胞系时，就应该非常小心。

另外，这种遗传不稳定性在细胞培养过程中还可能产生获得额外的、无法预期突变的亚克隆，在理论上会混淆对表型的分析[7]。

在实际操作中，细胞基因组中自发的改变会随机发生，但是其发生的频率较低，在可接 受的范围内。

例如，错配修复缺陷细胞发生突变的频率比正常细胞高三个数量级，但突变主要发生在重复序列元件中，每代每个碱基的突变频率大约为10-8。

经过认真的设计和适当的对照实验，可以将遗传不稳定性造成的干扰降到最小。

例如，通过比较亲代细胞、独立的靶向基因敲除∕敲入细胞以及非靶向细胞，我们对目的基因功能分析的结果就会具有较高的可信度。

2基因打靶细胞系的选择与基因打靶的基本方法用于基因打靶细胞系的选择是很重要的。

由于产生纯合的基因敲除∕敲入等位基因需要反复打靶，所以选择二倍体或近二倍体细胞对实验最为便捷，大多数具有稳定染色体组的二倍体肿瘤细胞系是具有错配修复缺陷的[7]。

迄今为止，在基因打靶中应用最广泛的是错配修复缺陷的结肠癌细胞系HCT116和DLD1。

当然还有一些细胞系也曾被用于基因打靶，包括其他肿瘤细胞系以及正常组织细胞系，但也有很多未经验证的细胞系很可能不适合基因打靶，所以我们应该尽量选择经过验证的细胞系。

人们设计了多种方法用于基因的改造，其成功率和效率差别很大，而最直接的方法就是利用构建好的含外源基因的载体转入细胞与内源基因进行同源重组。

用于体细胞打靶的方法与构建基因敲除小鼠的方法相似，在两种方法中，都包括四个基本的步骤：（1）设计并构建打靶载体，载体中包括两段同源区及在两段同源区之间的筛选标记，（2）将打靶载体高效转入目的细胞，（3）在一定的筛选条件下，使稳定整合筛选标记的克隆扩增，（4）鉴定并大量扩增发生同源重组而非随机重组的细胞克隆。

除了上述基本的步骤外，对人源细胞的打靶又有独特的要求，需要对用于小鼠的标准方法进行修改。

首先，外源DNA整合进人类细胞基因组的效率比整合进小鼠基因组的效率低，这就使大量转基因克隆的产生变得相对困难。

其次，人类基因组大小约为小鼠基因组的三倍，有证据显示培养的人源细胞中同源重组效率较低[8]。

最后，人源细胞与小鼠细胞相同，一般为二倍体，在小鼠中杂合子可以通过回交（back crossing）变为纯合子，这在人源细胞中显然不能实现，所以多个等位基因需要逐个敲除∕敲入才能获得纯合克隆。

在以上四个步骤中，打靶载体的构建是后续实验的基础，决定了同源重组的位点及重组效率，所以打靶载体的选择与构建就显得尤为关键。

3重组腺相关病毒介导的基因打靶在基因打靶技术应用的早期，一般以质粒为骨架构建打靶载体，再通过电转化的方法将载体转入目的细胞系。

例如，Brown等[9]成功在人正常二倍体成纤维细胞中敲除p21基因，揭示了p21与细胞衰老间的关系。

Chan等[10]在HCT116细胞系中成功敲除14-3-3σ基因，证明这个基因在DNA发生损伤后参与维持G2期检验点并阻止细胞死亡。

Ku86在哺乳动物中的非同源末端连接中起非常关键的作用，敲除Ku86产生的杂合子HCT116细胞，其增殖速度减慢，p53表达水平增高，而敲除的纯合子细胞在经过几次分裂后就发生凋亡[11]。

以上实验取得了很大的成功，但是在上述实验中，载体转入细胞及整合进特异位点的效率较低，增加了实验的成本和操作的复杂性。

重组腺相关病毒（rAAV）载体的出现在一定程度上克服了上述缺点。

Russell等[12]发现rAAV载体中的外源DNA序列整合进染色体同源位点的效率较高，有证据证明其效率比质粒载体高25倍[13]。

由于细胞表面的腺相关病毒受体广泛分布于各种人体组织中，所以包装好的rAAV 病毒颗粒可以高效转染各种人源细胞。

另外一个对基因打靶技术的改进是启动子捕获载体（promoter trap vector）的应用。

典型的例子是应用于小鼠胚胎干细胞的打靶载体，包含一个由强启动子驱动的筛选标记基因，这种筛选元件在染色体上发生随机重组时也会稳定表达筛选标记，产生非目的打靶克隆，增加了筛选的工作量。

Sedivy等[8]发现，当筛选标记基因的表达依赖于内源目的基因的启动子，就可以使所有转基因克隆中产生同源重组克隆的比例大大增加，这项技术就叫做启动子捕获技术。

Bunz等[13]设计了一个通用的筛选元件，从元件的上游到下游包含剪接受体（Splice acceptor, SA）、IRES序列（internal ribosomal entry sequence），筛选标记基因以及多聚腺苷酸尾，将这个元件命名为SEPT（synthetic exon promoter trap），用于构建启动子捕获载体。

在SEPT的两侧，还包括loxP位点，从而可以通过Cre重组酶将筛选基因切除（见图1a）。

需要说明的是，这项技术需要一个有活性的内源启动子，所以被打靶的基因必须是在正常生长条件下持续表达的基因[14]。

rAAV打靶载体和启动子捕获技术的应用在很大程度上提高了产生同源重组细胞克隆的效率，优化了转基因克隆产生的条件，缩小了克隆筛选的范围，使阳性克隆的产生率达到1%以上[3]。

应用上述改进的基因打靶方法，研究人员在细胞水平上对肿瘤的凋亡、生长、转移等许多方面有了进一步的认识，有很多的基因敲除∕敲入细胞系还被用于新药研发及对药物靶点的验证[3]。

图1：同源重组介导的基因敲除/敲入。

(a)基因打靶载体中的功能元件，主要是两条同源臂及中间的筛选标记；SEPT 通用筛选元件，包括一个剪接位点、一个IRES 序列、新霉素转移酶编码序列（neo ）以及一个多聚腺苷酸尾；这个筛选元件两端还含有Cre 重组酶的识别位点（即loxP 位点）。