酶联免疫吸附法测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法
盐酸克伦特罗的检测方法
盐酸克伦特罗的检测方法科技信息职教与成教盐酸克伦特骂硇楦测方法河南科技大学林业职业学院刘荣森[摘要]肉食中的盐酸克伦特罗严重危害人体健康.检测盐酸克伦特罗残留常用的方法有气相色谱一质谱联用法,高效液相色谱法,酶标记免疫吸附测定法,毛细管电泳'~--(CE)等,本文分析了各方法的优缺点,指出了今后的研究方向.[关键词]盐酸克伦特罗检测方法研究进展中央电视台2011年3.15晚会上,曝光了一些地方在动物饲养中滥用"瘦肉精"的问题."瘦肉精"是盐酸克伦特罗的俗称,通用名称:Clenbuterol(CLB),化学名称:d一[(叔丁氨基)甲基卜4一氨基一3,5一二氯苯甲醇盐酸盐,分子式:C.:H.C12N20?HC1,结构式:]}H31.l盐酸克伦特罗是一种B:一受体激动剂,具有蛋白同化作用,可以减少脂肪的形成,提高瘦肉和脂肪的比率,因而被滥用于饲养业,造成该药在动物体内蓄积,尤其是肝脏组织中的浓度较高.人类食用含有克伦特罗残留的肉品后会出现头晕,心悸,手指震颇等中毒症状.滥用瘦肉精已成为重大的食品安全问题.中国严禁盐酸克伦特罗等在动物生产中使用.但目前非法使用情况仍非常严重.近几年来,接连发生数起人食用有CLB残留的肉品中毒事件.造成CLB屡禁不止的原因一方面是利益驱使;另一方面是现在检测CLB的方法,手段还不完善,急需建立宰前监测体系和准确,迅速,方便,精确的检测方法.检测CLB残留常用的方法有气相色谱一质谱联用法(GC—MS),高效液相色谱法(HPLC),酶标记免疫吸附测定法(ELISA),毛细管电泳法(CE)等.1.气相色谱一质谱联用法(GC—MS)气相色谱一质谱联用法是我国CLB测定中的确证性方法fNY/T468—2001].是最常用的CLB测定方法,能在多种残留物同时存在情况下对某种特定的残留物进行定性,定量分析.具有灵敏度高,假阳性率低等特点.测定时一般需要柱前衍生,最常用的衍生试剂是双三甲基硅基三氟乙酰氨(BSTFA).本办法具有前处理过程烦琐,检测时间长,需贵重仪器等缺点.吴银良等建立了同时测定动物肝组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺残留量的固相萃取一气相色谱一质谱分析方法.样品在碱化条件下经乙酸乙酯和异丙醇混合溶剂提取,浓缩后用乙酸乙酯溶解,经SCX固相萃取(SPE)柱净化,经氮气吹干后用双三甲基硅基三氟乙酰氨(BSTFA)衍生,外标法定量.盐酸克伦特罗的检出限为O.301~g/kg.盐酸克伦特罗添加浓度在1.O～5.01zg/kg范围内,添加回收率为77.4%～88.3%;相对标准偏差(RSD)为3.1%～5.1%.胡明友等[21建立了克伦特罗的测定方法,用甲醇提取,正己烷脱脂净化,然后旋转蒸发冷冻离心浓缩后加0.1mmol/L的盐酸溶解,加样到净化柱上,用4%氨化乙酸乙酯洗脱后氮气吹干,甲苯溶解后加BSTFA衍生,用气相色谱一质谱法进行测定,内标定量.结果表明:添加56~10-9540x10(∞)浓度水平的克伦特罗,方法回收率在89.3%～107%,相对标准偏差为7.3%～16.5%,线性相关系数r为0.998,克伦特罗的最低检测限为2.0xl0f∞).PeterBa—tioens等[31用气相色谱一质谱联用法测定了牛,羊,猪粪便中的盐酸克伦特罗含量,最低检测限为2n.2.高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法是检测CLB残留常见的分析检测手段之一,适合大批量样品的快速测定.我国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证法.HPLC法中常用的检测器有电化学检测器,紫外检测器;其优点是检测精确度高,其最低检测限范围为1～15ng/g,而且假阳性率低,与GC—MS法相比样品不必衍生;缺点是检测过程繁琐,检测时间长,需贵重仪器,难于操作,价格昂贵.吴庆洁等用高效液相色谱法同时测定畜禽组织中盐酸克伦特罗和4种抗生素(土霉素,四环素,金霉素,氯霉素).用50%的三氯乙酸沉淀蛋白质,通过固相萃取(sPE)小柱进行活化,进行高效液相色谱分析.本法对盐酸克伦特罗的最低检出量为1.25ng.盐酸克伦特罗的回收率85.4%～93.8%.顾国平等用5%HClO超声提取肉样中的盐酸克伦特罗,80%水浴沉淀杂质,然后用固相萃取柱预分离和富集,用高效液相色谱法进行测定,以SunfireCl84.6mX150mm,3.9txm分离柱为固定相,用紫外二极管阵列检测器检测,外标法定量;在该色谱条件下盐酸克伦特罗在6.3rain左右可达到基线分离.方法的回收率在81.6%～103.7%.相对标准偏差在4.76%～7.94%.刘志梅等选用7cm的聚丙烯中空纤维,在样品溶液pH=l1,室温条件下萃取20min后,将有机溶剂在氮气流下吹干,用151xL甲醇溶解,进行液相色谱分析.结果表明:在优化的试验条件下,克伦特罗的富集倍数为78倍,线性范围在30～60001~g/kg 之间,线性相关系数O.9995,检出限2.4l~g/kg.将该方法用于猪肉组织中克伦特罗的测定,低,中,高3种浓度的加标回收率分别为84.9%,91.4%和95.0%,相对标准偏差(RSD)分别为6.3%,5.8%和4.6%.该方法操作简便,环境友好,具有较高的灵敏度,适于猪肉中盐酸克伦特罗残留的检测.高效液相色谱法也经常和质谱联用,实现分析过程的自动化.毛丽莎等171通过液相色谱一质谱以MRM方式检测,同时测定了猪肉组织中沙丁胺醇,莱克多巴胺和克伦特罗.样品用5%高氯酸溶液振荡提取,反相c18小柱净化浓缩,,以D3一沙丁胺醇为内标定量.测定克伦特罗的线性范围均为0.1～10.Oe~L,线性相关系数0.9992,定量检出限为0.5~g/kg,回收率为88-4%～96.2%.该方法简便,灵敏度好,选择性好.3.酶标记免疫吸附测定法(ELISA)ELBA法是检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析法,测定的基础是免疫学抗原抗体特异性结合反应和高效的酶促反应.ELISA法检测限可达0.05r-gs,实际应用中常使用EHSA试剂盒.该方法具有样品不需前处理或前处理简单,一次可检测样品数多,操作简便,快速等特点.但假阳性率较高.杨兴武等8】应用酶联免疫吸附法检测猪尿液中盐酸克仑特罗残留.结果表明,盐酸克仑特罗的线性范围为200～2000ng/kg,最小检出限为100n~L,样品不用前处理可直接检测,1个样品的2个平行样测定时间为45min.该方法回收率在81.9%～106.8%之间,相对标准偏差(RSD)d~ 于9%.李平等(采用直接竞争酶联免疫吸附试验对动物组织中的盐酸克伦特罗残留量进行了快速检测.将CBL与蛋白质载体偶联制备了CBL—BSA和HRP—CBL结合物,以CBL—BSA免疫实验兔获得特异性抗体,并建立了CBL残留直接竞争EHSA检测方法及检测试剂盒.结果表明,检测线性范围0.1～62.5ng/mL,检测低限为0.10ng/mL,尿,肝,肉和饲料的加标回收率为60.3%～l15.O%;相对标准偏差fRSD1为3.4%～7-2%.4.毛细管电泳法(CE)毛细管电泳法测定盐酸克伦特罗残留具有重复性好,操作相对简单,所需样品数量少等特点.高杨菲等峒毛细管电泳法同步分离检测肉制品中"瘦肉精"及其替代物法,整个分离在12min内完成.以90mmol/L的柠檬酸三钠(pH5.6)为电泳缓冲液,8kV分离电压,200nm检测波长,在25~C下可使克伦特罗,沙丁胺醇,特布他林和莱克多巴胺达到分离,分离度分别为1.90,2.73和2.17,回收率为92.4%～102.0%,相对标准偏差(RSD)Ib于3.2%,结果令人满意.王伟宇等…采用小型化毛细管电泳一电化学检测技术测定了猪尿和猪饲料中的克伦特罗及其替代品莱克多巴胺和沙丁胺醇,以直径300~m的碳圆盘电极为工作电极,检测电极电位为+0.95V, 在lOOmmol/L的硼酸盐运行缓冲液中,3种组分在7min内实现了分离. 被测物浓度与峰电流在3个数量级范围内呈良好的线性关系,检测限为1.20x10~-2.06x10-Tg/ml.该方法简单可靠,已成功应用于猪尿和猪饲料样品中3种B一兴奋剂的测定,是一种有效的食品安全分析检测方法5.其他方法樊晓博等采用时间分辨荧光免疫分析建立了简便,快速,灵敏的盐酸克伦特罗检测方法.以自制盐酸克伦特罗单克隆抗体包被96孔微孑L板作为固相抗体,Eu标记抗原与样品中的CBL竞争结合抗体,建立直接竞争荧光免疫分析体系.实验表明:方法灵敏度为0.021xg/L,样品回收率为91%～101%,与沙丁胺醇,莱克多巴胺等结构类似物的交叉反应率均小于1%.方法灵敏度高,特异性强,且操作简单,完全可以满足现有实际检测需求.曾文芳等【'3l建立了用离子色谱一电化学修饰方法l钡0定盐酸克仑特罗.采用离子色谱分离,碳纳米管修饰电极,直流安培检测,DionexAG9一HC保护柱(2mmx50mm),8mmol/L碳酸钠+1O%甲醇为淋洗液测定盐酸克仑特罗.盐酸克仑特罗的检测限是0.0003mg/L;样品测定的回收率分别为96%～103%.陈丽莉等【锻计了一种快速检测猪肉中盐酸克伦特罗的流动注射一化学发光免疫分析方法.采用过氧化脲作为luminol—CH~I20?Hz0z—HRP化学发光体系氧化剂,联苯硼酸作为.--——207...——科技信息.职教与成教增强剂,流动注射化学发光法检测竞争免疫反应后的上清酶标复合物.在最优条件下,测定克伦特罗的线性范围0.05～9~zg/L(r=-0.9959),检出限为0.021~L.该方法已经成功应用于猪肉中克伦特罗残留的检测.胡华军噪用巯基丁二酸作为表面修饰剂,水相法合成水溶性的CdTe/ZnSe核壳量子点,然后在N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)的作用下,将CdTe/ZnSe核壳量子点与抗克伦特罗多克隆抗体(Anti—CLBpAb)连接.CdTe/ZnSe—Anti—CLBpAb偶联物能识别克伦特罗一BSA抗原(CLB—BSA).光谱分析表明,量子点与抗体连接后荧光增强,荧光峰位从628nm红移至635nm.将合成的CdTe/ZnSe—Anti—CLBpAb偶联物作为指示克伦特罗(CLB)分子的荧光标记物,制备出一种用于检测CLB的免疫层析试纸条,其最低检测量可达1Ixg/L.现常用的盐酸克伦特罗的检测方法各有优缺点,研究更快速,高效,检测限更低,操作简单,费用低廉的现场检测方法是今后的发展方向.参考文献[1]吴银良,李晓薇,刘素英等.气相色谱一质谱法测定肝脏组织中盐酸克伦特罗和盐酸菜克多巴胺[J]分析化学,2006,34(8):1083—1086 [2]胡明友,邵国建,郭和光.GC—MS测定肝脏中克伦特罗方法的探讨[J]冲国卫生检验杂志,2010(8):1867—1868[3]PeterBatioens',DirkCourtheyn,HuberF,eta1.GasChromato—graphicTandemMassSpectrometricanalvsisofclenbuterolresiduesinfaeces [j]JournalofChromatograF'hyA.1996,750(1—2):133—139[4]吴庆洁,石朝辉,蔡江帆.高效液相色谱法同时测定畜禽组织中4种抗生素及盐酸克伦特罗残留量[I].中国卫生检验杂志,2010(7): 1642—1644[5]顾国平,王森,周亚莲等-固相萃取高效液相色谱法测定猪肉中盐酸克伦特罗残留[1].浙江农业科学,2008(5):624—626[6]刘志梅,陈永艳,杨秀敏等.中空纤维液相微萃取——高效液相色谱法测定猪肉中盐酸克伦特罗残留[I]中国食品,2009,9(2): 171—175[7]毛丽莎,刘红河,陈慧玲.液相色谱一质谱联用法测定猪肉组织中3种B一激动剂[J].中国热带医学,2009,9(7):1356—1358[8]杨兴武,刘振国,周蓉等应用ELISA检测肉猪尿液中盐酸克仑特罗方法的研究lI1.黑龙江畜牧兽医,2003(5):9—10[9]李平,潘荣生,周洪斌等.动物组织中盐酸克伦特罗残留ELISA检测试剂盒的研制[J].免疫学杂志,2006,22(6):178—151[10]高杨菲,许学书毛细管电泳同步分离检测"瘦肉精"及其替代物[J].食品工业,2008(3):71—74[11]王伟宇,张玉莲,邢晓平等.小型化毛细管电泳!电化学检测法测定猪尿和猪饲料中的B一兴奋剂[J]色谱,2()O8,26(2):228—231 [12]樊晓博,杨金易,高秀杰等Eu标抗原盐酸克伦特罗的时间分辨荧光免疫检测[1].食品科学,2010,31(20):307—310[13]曾文芳,陈永欣,吴龙等l离子色谱电化学修饰法测定盐酸克仑特罗I1}冲国卫生检验杂志,2007,17(8):1350—1352[14]陈丽莉,章竹君,付爱华流动注射化学发光免疫分析检测猪肉中的盐酸克伦特罗残留[1].分析实验室,2011,30(2):6-8[15]胡华军,付涛,张明洲等.CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究[T].分析化学,2010,38(12):1727—1731护理学基础实跬教学新搽i刁宝鸡职业技术学院医学分院高丽萍[摘要]护理学基础是一门实践性很强的学科,也是护理专业一门重要学科,要使护生学好掌握好,我们必须改革传统的教学模式,以多元化的教学方式授课,来提高护生的学习兴趣,能力,以适应医学护理事业的发展.[关键词]护理学基础实践教学教学改革护理学基础是护理专业课程的主干课程,是一门实践性应用性学科,可使护生具备从事护理工作所必须的基本知识,基本技能,基本情感的专业基础课.随着社会的发展,医学事业的不断创新,过去的护理医学模式已不再满足于临床工作,这就要求护理教师在临床教学工作中,必须改革传统的教学模式,提高护理教学质量,使大多数护生完成教学目标,强化护生的动手实践能力,做到理论和实践的有机结合.因此,笔者在教学方法上做一下尝试:1,道德素质的培养近代护理学创始人南丁格尔将护理的发展带进新纪元,并提出和实践了护理者必备的职业道德和伦理准则.1973年国际护士节学会修订的《护士伦理学国际法》中规定:护士的基本职责包括"增进健康,预防疾病,恢复健康和减轻痛苦"四个方面.与此相适应,护理道德的实质在于:珍视人的生命,尊重人的尊严和权利,为个人,为家庭,公众提供高质量的健康服务.l】现代医疗护理是一种医生,护士,患者之间帮助与被帮助的关系,护士承担着各种各样的角色,是护理工作的直接参与者,工作中应协调好各方面的关系,才能使医疗护理井然有序,提高质量.以促进人民的健康为宗旨,视患者为亲人.因此,我们要帮助学生树立正确的人生观, 价值观,职业责任感和道德感,树立牢固的专业思想,养成精益求精,一丝不苟的工作作风,有吃苦耐劳的奉献精神,热爱护理事业,以促进患者的健康,视患者为亲人为宗旨,为护理事业奉献一生.2,传统的教学模式在护理学基础的实践教学过程中,传统的教学模式是课前准备一教师示教一学生回复一学生练习一抽查考核.这些教学方法如果重复一二次,学生可能会认真耐心的学习,可长期用此教学方法会让学生厌烦,甚至会觉得是一种填鸭式教学,以至于对本门学科毫无兴趣.如今的护生不同以往的中专生,她们基础好,理解力强,这种单一的教学模式根本无法满足她们的求知欲望.3,改革措施3.1提高教师的综合素质"要想教给学生一滴水的知识,教师必须要有一桶水的知识",这是我院一位老校长的话.为了满足护理事业的发展,教师在授课前坚持集...——208...——体备课和学习,讨论护理理论及操作教学中可能出现的问题及教学改进方法,在教育观念上将应试型转变为创新型,素质型教育观;为保证课堂教学不与临床应用脱节,教师应轮流定期到临床实习,参与临床一作;为了更新,提高知识,应定期在高等学府进行深造学习,来满足专业的需求.3.2教学方法改革3.2.1应用多媒体教学法多媒体教学是一种较先进的辅助教学手段.在《护理学基础》实践教学中应用多媒体技术,有着无可比拟的优势,使实践教学更显生动,直观,精彩.开阔学生视野,诱发学生想象,提高学习效率,增强教学效果.比如无菌技术操作,在教师示教正确方法后应用多媒体教学再次演示,学生的印象更加深刻.3.2.2运用情景设计,角色扮演开展师生互动式教学.在实践操作中设置情景,让护生利用角色扮演进行操作练习.在病员运送法教学中,教师扮演护士,学生扮演患者,进行轮椅运送,一人,二人,三人及四人运送的搬运,示教结束后由学生互相角色扮演,效果相当好,学生兴趣很浓.3.2.3以案例形式进行授课通过训练使学生体会到为病人解决健康问题不只是简单的操作,还需要与病人沟通,评估和研究病人病情, 取得病人的配合,解决病人的问题.在口腔护理实践教学中,首先给出一个有口腔感染的患者,让学生按护理程序进行评估(观察到患者有哪些客观体征),计划(如何护理患者口腔,选择何种簌口液),实施(具体护理措施),评价(口腔护理后感染是否消失或好转),通过此形式的授课,学生会深入教学中,彻底吃透教学内容.3.2.4增加临床见习临床见习在《护理学基础》教学中必不可少,是弥补在校学习无法开展的实践,比如:洗胃法,在校实践教学只能模拟性的操作讲授,尤其是下胃管,缺乏真实感,有时觉得像演戏,学生听后似懂非懂.因此,临床见习提高学习效果.3.2.5比赛式教学法此教学法不仅激发了学生学习的积极性和趣味性,巩固了学生所学知识和技能,使学生以赛促学,达到增强记忆, 激发上进心,熟练掌握技能操作的目的,提高了心理素质及集体荣誉感.铺床法在教学中要求学生快速,正确完成操作,以体现节力的原则. 从教十几年,每届学生铺床法都采用比赛式,深受学生的欢迎.。
猪肉中“瘦肉精”盐酸克伦特罗残留危害及检测方法
猪肉中“瘦肉精”盐酸克伦特罗残留危害及检测方法作者：宋瑞，张彩云，何立宁，张蕾来源：《科技资讯》 2011年第15期宋瑞张彩云何立宁张蕾（石家庄市畜产品质量监测中心石家庄 050041）摘要:本文介绍了盐酸克伦特罗(瘦肉精)的性质、危害性以及主要的检测方法。
关键词:盐酸克伦特罗残留检测方法中图分类号:S859.84 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2011)05(c)-0104-011 盐酸克伦特罗的性质盐酸克伦特罗(Clenbuterol,CLB)俗称瘦肉精,又名氨哮素、克喘素,化学名为“4-氨基-α-[(叔丁基氨基)甲基]-3,5-二氯苄醇盐酸盐”,常温下为白色或微黄粉末状固体,熔点为170℃～176℃,极易溶于水、甲醇和乙醇,微溶于氯仿,不溶于苯,是一种β2一肾上腺素能激动剂。
20世纪70年代末,美国等发达国家进行了盐酸克伦特罗实用性开发研究工作。
80年代,由于盐酸克伦特罗能促进猪生长,提高瘦肉率,而被作为饲料添加剂广泛应用到猪的生产中。
但是近年来,因食用被盐酸克伦特罗污染的猪肉导致中毒事件屡有发生,且后果极其严重,引起了世界各国的高度重视,为了保证猪肉产品质量安全,保护人类健康,许多国家都禁止在食用动物源性的生产中使用盐酸克伦特罗[1]。
2 危害性2.1 对猪的影响在饲用初期会在短期内出现血压升高、血管扩张、呼吸加剧、体温上升等症状,并出现采食下降、行为动作失调、神经紧张不安甚至全身震颤等症状。
后期会使猪体内糖降解作用不足,导致猪肉品质下降,同时容易发生蹄损伤和跛行,大运动量或高温条件会造成死亡。
2.2 对人的影响人食用含残留盐酸克伦特罗猪肉后对肝、肾等内脏器官会产生毒害作用,出现心悸、头痛、目眩、恶心、呕吐、心率加快、肌肉振颤等症状,特别是对高血压、心脏病、甲亢和前列腺肥大等疾病患者危害更大,严重的可导致死亡。
3 国内外对盐酸克伦特罗的禁用规定由于盐酸克伦特罗对猪具有加强脂肪分解,促进蛋白质合成,实现动物营养再分配,提高胴体瘦肉率,加快猪的生长等作用,盐酸克伦特罗曾作为科研成果推广,从而使多起摄入残留“瘦肉精”的消费者中毒案件发生,严重的甚至导致了死亡。
酶联免疫吸附法（ELISA）检测猪肉中盐酸克伦特罗
BB 0×100%百分吸光度值（%）=酶联免疫吸附法（ELISA ）检测猪肉中盐酸克伦特罗薛金英（山东省诸城市畜牧兽医管理局山东诸城262200）盐酸克伦特罗（俗称瘦肉精）为一种人工合成的β-肾上腺素兴奋剂，具有扩张支气管的作用，常用来防治哮喘、肺气肿等肺部疾病。
当其应用量达到治疗量的5～10倍时，其有能量重分配作用，可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此俗称为“瘦肉精”。
在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种和生长促进剂添加到动物饲料中，用以改善胴体的品质，同时也造成食品中盐酸克伦特罗（瘦肉精）的残留。
当人们食用盐酸克伦特罗残留的产品后会出现一系列的中毒症状。
动物源性食品药物残留问题逐渐引起人们的重视。
本法用于定量、定性检测猪肉中盐酸克伦特罗的残留。
1试验原理采用间接竞争ELISA 法，在微孔板上包被抗盐酸克伦特罗检测抗原，样品中的盐酸克伦特罗将和酶标板上的盐酸克伦特罗检测抗原竞争结合盐酸克伦特罗抗体，盐酸克伦特罗检测抗原结合的盐酸克伦特罗抗体再与同时加入的酶标二抗结合，洗涤后，用TMB 底物系统显色，微孔板吸光值与样品中盐酸克伦特罗含量成负相关，与标准曲线比较再乘以浓度比值即可得出盐酸克伦特罗在样品的实际含量。
2试验方法（稀释倍数为4倍）称取1.0g （±0.05g ）均质样品于50mL 聚苯乙烯离心管中，加入1mL 0.1M 盐酸，再加入2mL 提取工作液，充分振荡混匀5min ，4000rpm （20～25℃）离心10min 。
取1mL 上清液加入约25μL 1M 氢氧化钠调节pH 至6.5～7.5之间，充分振荡混匀，取50μL 用于分析。
如果上层中存在白色脂肪层，取样时应避开。
试剂准备：将10×浓缩洗涤液和蒸馏水（或去离子水）按1∶9充分混匀，即为1×洗涤液。
编号：将盐酸克伦特罗标准溶液和待测样品对应微孔按序编号，建议每个标准溶液和待测样品均做重复孔。
酶联免疫吸附法检测瘦肉精
酶联免疫吸附法检测瘦肉精摘要:介绍了竞争酶联免疫吸附法测定猪肉中的盐酸克伦特罗的方法。
利用盐酸克伦特罗试剂盒,对猪肉组织中残留的盐酸克伦特罗经抽提、竞争后,用酶标仪进行检测分析。
此法较适用于现场检验,检测速度快、灵敏度高,是保证肉品卫生安全的较好监控方法。
酶联免疫吸附法是目前最佳的检测方法。
ELISA 检测方法有双抗体夹心法测抗原、间接法测抗体、竞争法测抗体等。
该文是利用酶联免疫吸附法中的竞争法测抗体,其原理是利用多克隆抗体既能与盐酸克伦特罗结合,也能与包被抗原结合。
这些包被抗原被固定在酶标板孔壁上,当样品中含有瘦肉精时,它与包被抗原竞争结合抗体中有限量的结合位点。
由于每一个孔中抗体的结合位点数相同,当样品中瘦肉精浓度低时,就有更多抗体的位点与包被抗原结合,更多的抗体被固定在酶标板壁上,就会与更多的酶标二抗结合,所以结果就呈现深兰色。
相反,样品的瘦肉精浓度高,结果就呈现浅兰色。
加入终止液后,兰色相应变成黄色,然后用酶标仪进行测定。
利用竞争酶联免疫吸附法检测瘦肉精,具有速度快,灵敏度高的特点,适用于现场检测,对以后瘦肉精检测工作的发展具有指导作用。
1 实验材料与方法1.1 原料的准备抽取具有一定批量的有代表性的无皮猪肉,剔除杂质、脂肪。
将精肉用高速捣碎机捣碎混合均匀,放置冰箱冷冻备用。
取捣碎的样品5g ,加入25mL ,50mmolHCl 振动1.5h ,以达到均质。
称取5g均质物(相当于1g 肝脏或肌肉),加入离心管中,10000r/min 离心15min。
取上清液至另一个离心管中, 加1mol NaOH 300ul , 混合15min。
加入4mL ,500mmol KH2PO4 (pH3.0),迅速混匀置于4摄氏度的冰箱内保存至少1.5h。
10000 r/min 离心15min ,分离上清液。
1.2 试剂盐酸克伦特罗—酶联免疫试剂盒1.3 仪器电热恒温水浴锅、酶标仪、离心机、匀浆机（HFJ系列内切式匀浆机，厂家：天津恒奥）、微量加样器。
酶联免疫吸附法测定肉组织及尿液中“瘦肉精”产生误差分析及解决方法
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俞 晓， 刘淑 华
（ 鲁木 齐 市农 产 品质量 安全检 测 中心 ， 乌 新疆 乌 鲁木 齐 ８ ０ ０ ） ３００
中 图分 类 号 ： ５ ． ５ Ｒ１５５ ＂ 文 献标 识码 ： Ｂ
２ 样 品 处 理产 生误 差
现将情 况列 举一 二 ， 同行 参 考 。 供 １ 不 同厂 家 的酶 联 免 疫 试 剂 盒 产 生 的差 异
在检测 中 ， 首先 要查看 试剂 盒标 注 的检测对 象 ，
５ 实验 室 环 境
５１ 温 度 ．
．
检 测 肉组织 、 液样 品等 ， 要使 用非 同一 个试 剂盒 尿 不
农 产 品 质 量 安 全检 测 工作 。
开展动物产地裣疫工作应重视的几个方面
麻迎 东 吕秀霞 ， ， 何登峰 ， 广清 稽
（． １新疆 维吾 尔 自治 区动物卫 生监 督所 ， 疆 乌鲁 木 齐 ８ ０ ６ ； 新 ３ ０ ３ ２乌鲁 木 齐市动 物卫 生监督 所 ， ． 新疆 鸟鲁木 齐 ８ ０ ６ ） ３ ０ ３
实验 结果 偏低 。 ２２ 取 样 不具有 代表 性或 不均 匀 ．
植 物辣 根 过氧 化 物 酶 （ ａ ） 克 伦特 罗 （ Ｌ 结 合 ， Ｈ Ｐ与 Ｃ） 形 成酶偶 联 克伦特 罗 。将 固相载体 上 已包被 的抗 体 （ 抗 兔 ＩＧ抗 体 ）与特 异 性 的抗 克伦 特 罗抗 体 结 羊 ｇ 合， 然后 加入 待测 克伦 特罗 和酶偶 联克 伦特 罗 ， 们 它
样微 孔 里还未 来得 及加完 试剂 ，前 面 已加好试 剂 的
组 织 为± ０ ２ ％的偏差 ， 液为 ± ５ 尿 ｌ ％的偏 差 ， 能够 作 不
盐酸克伦特罗(瘦肉精)
综述盐酸克伦特罗的药理作用、在机体内的残留性及检测技术摘要：由瘦肉精引起的中毒事件屡见不鲜，而品种繁多的瘦肉精中盐酸克伦特罗是使用最普遍的一种，本文从盐酸克伦特罗的理化性质、药理作用、残留性、检测方法等方面详细介绍其对人体的危害，为我们更好的认识和抵制瘦肉精提供参考。
关键词：理化性质；药理作用；毒性；残留性；检测方法瘦肉精是一类药物，而不是某一种特定的药物，任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精”。
在中国，通常所说的瘦肉精是指克伦特罗，而普通消费者则把此类药物统称为瘦肉精。
当它们以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。
1. 盐酸克伦特罗的理化性质及药理作用1.1 理化性质中文名：瘦肉精；克伦特罗；学名：盐酸克伦特罗(Clenbuterol Hydrochloride)，又称氨哮素、克喘素氨双氯醇胺，化学名称为羟甲叔丁肾上腺素，是一种平喘药。
该药物既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂。
相对分子量：313.7，分子式：C12-H18-Cl12-N2-O·HCl；图1盐酸克伦特罗结构式盐酸克伦特罗的外观与性状：白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦；熔点：174～175.5°C；溶解性：溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚[1]。
1.2 药理作用20世纪70年代中后期,克伦特罗作为一种伦特罗1000～3000 μg 具有促进新的、选择性的β肾上腺受体激动剂逐步应用于临床试验,它能够引起交感神经兴奋在治疗剂量下,强而持久地松弛支气管平滑肌,口服治疗剂量仅为30～40 μg/d, 对支气管哮喘和伴随有逆性气道梗塞的慢性支气管炎均有良好的效果,能较长时间地增加肺的最高呼气量(PEFR)，用药剂量仅为舒喘宁片的1%, 副作用和对心血管系统的作用不明显。
酶联免疫吸附法(ELISA)检测猪肉中盐酸克伦特罗
从 ６个 乡 镇 的 ｌ ８家 规 模 养 兔 场 随 机 抽 取 了 １ ８ ０ 份 兔 血清 。 １ ． ２诊 断试 剂 兔瘟 抗 体监 测 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试 剂 ： 购 自深圳 市芬 德 生
式中 ： Ｃ： 稀 释 后样 品提取 液 中盐 酸 克 伦特 罗 含 量（ ｓ ／ Ｌ ） ， Ｄ： 样 品稀释倍 数
后 出现板 孔 干燥 ， 会导 致 标 准 曲线 线 性不 好 。底 物
本试 剂 盒 灵 敏度 为 ０ ． １ ｇ ／ Ｌ ， 样 品 最低 检 测 限
为０ ． ４ ｇ ／ ｋ ｇ ， 回收率 一般 在 ８ ０ ％ １ ０ ０ ％之 间 ， 为 确
溶液如果变蓝表示 已经变质 ， 不能使用。 ０ 号标准溶
液 的吸光 值 ＜０ ． ６时 ， 表 示试 剂 盒 已经 变 质 ， 不 能 使
保 结 果准 确 ， 试 验 过程 中应 注意 以下 问题 ： 试 剂 盒保 存 于 ２～８ ℃， 不能冷冻 ， 未 用 的微 孔 板 放 回原铝 箔袋 密 封后 ２ ８ ℃存 放 ，并 尽快 使 用 。
注： 为获 得 样 品 中盐 酸 克 伦 特 罗 的 实 际 含 量 （ ｇ ／ ｋ ｇ ） ， 从标
３ ． １ ． ２原 因分析
影 响 规 模 养 兔 场 兔 瘟 免 疫 效 果 的 主 要 原 因到
底有 哪些 ？ 通 过调 查 ， 归纳起来主要有以下几个方面：
底 物 溶液 要 避光 保 存 。使 司 ， 诊 断 试 剂 在 有 效 期 内使 用 ； 试 验
严 格按 照诊 断试 剂说 明书 的要求 进行 操作 。
２结 果与 分析 结 果 表 明： 被 检测 的 １ ８ ０份 血清 中 ， ８ １份血 清 的
农产品快速检测技术W1203-1 酶联免疫法检测猪肉中克伦特罗的原理-微设计
掌握ELISA法操作的要点及常见的问题。
教学内容
知识点
技能点
1.ELISA检测的基础知识；
2.ELISA法检测猪肉中克伦特罗的原理；
3.ELISA法操作的要点；
4.ELISA法常见的问题。
1.ELISA法规范操作的要点。
设计思路
教学步骤
呈现形式与素材
时长(min)
3、微课教学设计模式：讲授法、直观演示法、任务驱动法、讨论法、案例分析法、角色扮演法等；
《农产品/食品快速检测技术》课程-微设计
微课编号
W1201
微课名称
酶联免疫法检测猪肉中克伦特罗的原理
所属模块
残留物的快速检测
子模块
兴奋剂类药物残留的快速检测
关键词
酶联免疫；猪肉；克伦特罗；原理
是否通用
√通用农产品食品是否重点建设√否微课类型讲授型
微课形式
PPT动画式
教学设计模式
直观演示法
教学目标
了解ELISA检测的基础知识；
ppt
6.5
小计
18
PBL讨论
无
设计者
陈晶，上海农林职业技术学院
版本号
（01）2016.7.6
附：
1、微课类型（限填项）：讲授型、实验实训型、答疑型、总结型、其它；
2、微课形式：画中画式、讲坛式、录播教室实录式、讨论式、访谈式、实地拍摄式、可汗学院式、PPT动画式、Prezi动画式、二维动画式、三维动画式、虚拟抠像式、混合拍摄式、师生形象的处理、混合拍摄式等（可参考给的学习资料），应根据课程的特点，选用丰富的形式；
1.ppt形式讲解抗原、抗体、抗原抗体反应等ELISA检测的基础知识（知识点1）。介绍ELISA的概念已经主要类型。
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酶联免疫吸附法测定猪肉中盐酸克伦特罗的方法
作者：张清超
来源：《现代食品》 2017年第11期
盐酸克伦特罗俗称瘦肉精，是人工合成类的β- 肾上腺素兴奋剂的一种，在治疗支气管
扩张方面有显著效果，用量适当时，是防治哮喘、肺气肿等肺部疾病的有效物质；但当其用量
为正常治疗量的5 ～ 10 倍时，在能量重分配的作用下，将导致脂肪沉积异常减少、肌肉合成
异常增加，部分非法使用者往往将其添加到动物饲料中，用以改善动物胴体品质。
当动物食用
盐酸克伦特罗后，其体内将残留不同程度的盐酸克伦特罗，用其制作的食品一旦被人们食用，
将引发一系列中毒症状，严重危害人体生命安全。
调查显示，盐酸克伦特罗一次摄入量过大，
人体将产生呕吐、心跳骤然加速等异常生理反应，严重者甚至直接死亡，因此被世界上大多数
国家禁用。
近年来，在我国的严厉打击下，非法生产销售添加盐酸克伦特罗食品的现象显著减少，但畜产品抽检的实际工作显示，瘦肉精仍时有检出，加强对畜产品中盐酸克伦特罗的检测
势在必行。
在多种检测方法中，胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法较为常见，广泛应用于畜
牧业中，具有准确率高、操作简便、耗时短等优点。
下面本文将就酶联免疫吸附法测定猪肉中
盐酸克伦特罗的方法进行进一步分析和总结。
1 原料与方法
1.1 原料
到附近市场随机抽取一批剔除杂质、脂肪的无皮精肉，使用高速捣碎机对无皮精肉进行处理，彻底捣碎后将所有精肉混合均匀并置于冰箱冷冻备用。
检测时，从冰箱冷冻室抽取5 g 捣
碎样品，将25 mL 的50 mmol/L HCl与样品混合，持续摇动至均质。
在离心管中加入5 g 均质物，以10 000 r/min 的速度高速离心15 min，分离血清，提取上清液，在上清液中加入300
μL 的1 mol/L NaOH，混匀并静置15 min。
15 min 后，在混合上清液中加入4 mL 的500 mmol/L KH2PO4，混匀静置，保存在温度为4 ℃左右的环境中。
90 min 后，取出混合液，以10 000 r/min的速度高速离心15 min，分离上清液，待检，待检标本共10 份[1]。
1.2 方法
本次研究所用盐酸克伦特罗- 酶联免疫试剂盒来自西安绿盾生物科技发展有限公司，酶标
仪型号为DG5031，离心机型号为0412-1(80-2)；此外，所涉及的仪器还包括匀浆机、电热恒温水浴锅及微量加样器。
从冰箱中取出适量待检混合液，在常温中静置至所有待检混合液均恢复室温。
对待检混合
液进行洗板处理，使用蒸馏水10 倍稀释浓缩洗涤液，取出酶联免疫板，室温下平衡 5 min 后，将300 μL 的洗液分别加入板孔中，静置1 min 并彻底甩掉洗涤液，按照上述步骤反复操作
3 ～ 5 次，直至酶联免疫板内的残留洗涤液完全甩干。
完成上述操作后，按照1 ∶ 1 000 的
比例对试剂盒中的抗体进行稀释，加样时严格控制加样顺序，在酶联免疫板上依照1-3 的顺序
依次加样，每孔内加样100 μL，反复两次。
此外，在其他孔内加入100 μL 的抗体以及适量
待测样品。
加样完成以后，在湿盒内放入酶标板，以37 ℃的温度开始竞争，持续30 min。
竞
争完成以后持续加二抗，按1 ∶ 1 000 的比例稀释二抗标记酶，将配制好的二抗标记酶加入
酶联板内，每孔200 μL 并放置于湿盒中，保存于温度为37 ℃的环境中，静置30 min。
取出
加底物显色，将底物A、B 等体积混匀，将配好的底物显色极加入酶标板内，每孔200μL，显
色后再将50 μL 的终止液加入酶标板内，终止反应。
轻轻振荡混匀，在混匀后的5 min 内测
定样品和标准样450 nm 处的吸光度值[2]。
结果判定：将样品和标准样的吸光度值与0 号标准溶液的吸光度值相除，将所得到的数值
再乘以100%，该结果即为百分吸光度值。
与此同时，采用绘制标准曲线的方式对样品中盐酸克
伦特罗浓度进行计算，以盐酸克伦特罗标准溶液浓度对应的百分吸光度值为Y 轴，以标准溶液
浓度本身为X 轴，使用该方法在标准曲线上依次读出每一个样品的浓度[3]。
2 实验结果
实验结果显示，10 份猪肉标本的OD 值均在0.45以上，1 份样品中所包含的盐酸克伦特
罗的含量在5 ng/mL 以上，检验合格率为90%。
3 讨论
本次研究顺利完成，10 份猪肉标本的检验合格率为90%。
研究结果提示，酶联免疫吸附法
是测定猪肉中盐酸克伦特罗的有效途径，能够较为准确地显示猪肉中所包含的盐酸克伦特罗含量，且具有操作相对简便、经济、快速的优势。
但为保证检测准确性，在实际检测过程中，应
当注意以下事项：①取样时应采取纵切取样的方式，避免以肌肉、肾、血液等以及肝实质上部
肥厚部位处为样本，确保检测价值。
②在处理样品时，严格控制过C18 柱时的流速。
一般情况下，样品进柱时，应当将流速控制为1 滴/s；甲醇洗脱时，流速控制为15 滴/min。
③切忌交
叉使用同批号的试剂，试剂使用之前确保温度恢复至室温并充分稀释，使用完毕之后立即将试
剂放回温度在2 ～8 ℃的环境中保存，防止试剂变质，影响检测准确性。
此外，以悬空滴入
的方式添加试剂，防止枪头接触板孔，可用一只手轻扶另一只拿微最加样器的手，保证试剂完
全加入微孔中底部。
④洗涤过程中，避免移液器管尖与孔中混合物接触；对于部分浓度超出最
高检出限的样品，为保证检测的有效性，应对其持续稀释，但切忌盲目稀释样品的倍数，应从
较小的稀释倍数开始，循序渐进，以进一步提高检测结果的准确度。
⑤严格把握平行样加样顺序，按照相关实验要求和试剂要求按顺序添加试剂，防止因任意添加试剂而使平行样结果CV
变大的情情况发生，导致实验精密度降低。
⑥对于在实验中需进行两次抗原抗体反应的标本
（加标本以及加酶结合物），应当注意对标本进行保温，保证标本能够达到反应的终点。
研究
指出，抗原抗体完成反应需要一定的时间和温度，抗原抗体反应的这一段过程，即温育或孵育，酶联免疫吸附法属固相免疫测定的一种，同时，抗原抗体的结合只在固相表面上发生，而对于
加入板孔中的标本所包含的抗原而言，并非所有标本抗原都享有与固相抗结合的机会。
一般情
况下，仅与孔壁最贴近的一层溶液中所包含的抗原能够直接与抗体接触并发生反应。
由此可见，对于需要两次抗原抗体反应的标本而言，其反应是一个逐步平衡的过程，需要不断扩散才可达
到反应终点，该道理同样适用于后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合。
为此，在温育过程中，应当采用水浴等方式将温育温度控制在37 ℃。
⑦在使用酶联免疫吸附法对样本中的盐酸克伦
特罗进行测定时，要严格控制实验室环境，避免因实验室环境不合格而造成测定结果准确度降低。
研究指出，实验室温度过低，将导致抗体抗原反应减弱甚至被抑制，使抗体无法在正常试
验时间内完全反应，当反应不充分的抗体加入停止液终止反应时，最终的检测结果可能出现误差，难以形成标准曲线图；若实验室温度过高，可能将加速抗体抗原反应，使微孔内还未完全
加样，而前面已加好试剂的微孔已经发生了反应，造成最终测定结果偏低。
因此，一般情况下，实验室应当充分避光，室温控制在20 ～24 ℃。