浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析
不同储藏期浓香型白酒大曲的微生物多样性分析
不同储藏期浓香型白酒大曲的微生物多样性分析刘延波;王琳琳;金尚萍;韩素娜;王贤;孙西玉;张立新;潘春梅【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2022(41)4【摘要】该研究利用Illumina Miseq高通量测序技术分析不同储藏期赊店老酒浓香型白酒大曲的微生物多样性。
结果表明,从3个储存期的大曲样品中共检测到26个细菌属和13个真菌属,其中共有优势细菌属为乳球菌属(Lactococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、魏斯氏菌属(Weissella);共有优势真菌属为复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、毕赤酵母属(Pichia)、曲霉菌属(Aspergillus)、耐碱酵母属(Galactomyces)。
不同储存期大曲样品群落组成相似,但其优势菌群的相对丰度差异明显。
从微生物的菌属特性、平衡角度分析,储存期为6月的大曲更适合投入白酒生产。
此外,首次从浓香型白酒大曲中发现耐碱酵母属(Galactomyces)、Arachniotus、norank_c_Cyanobacteria、Escherichia-Shigella、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、norank_f_Bacteroi-dales_S24-7_group、Ruminococcaceae_UCG-005和Rikenellaceae_RC9_gut_group。
【总页数】6页(P105-110)【作者】刘延波;王琳琳;金尚萍;韩素娜;王贤;孙西玉;张立新;潘春梅【作者单位】河南大学生命科学学院;河南牧业经济学院食品与生物工程学院(酒业学院);河南仰韶酒业有限公司博士后创新实践基地;河南牧业经济学院河南省白酒风格工程技术研究中心;河南牧业经济学院郑州市白酒酿造微生物技术重点实验室;赊店老酒股份有限公司;河南张弓老酒酒业有限公司【正文语种】中文【中图分类】TS261.1【相关文献】1.浓香型和酱香型大曲微生物多样性分析2.浓香型白酒大曲与入窖糟醅细菌多样性的对比分析3.基于高通量测序解析赊店老酒浓香型白酒大曲古菌群落多样性4.浓香型白酒发酵结束后不同层酒醅的微生物多样性分析5.基于高通量测序技术分析浓香型白酒大曲真菌菌群多样性因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
浓香型白酒发酵过程中各因子动态变化研究
浓香型白酒发酵过程中各因子动态变化研究方军;张宿义【摘要】Through tracing sampling analysis of the change of microbes, temperature, moisture content, amylum content, sugar content, acidity, alcohol content and main flavoring compositions during the fermentation process of Luzhou-flavor liquor, the change rules of microbes and each physiochemical factor and their relationships were revealed, which was useful for the exploration of the fermenting mechanism of Luzhou-flavor liquor.%通过跟踪取样分析浓香型白酒发酵过程中糟醅的微生物、温度、水分、淀粉、糖分、酸度、酒精含量及主要香气成分的变化。
初步揭示了浓香型白酒发酵过程中糟醅内的微生物与各理化因子在演变过程中的变化规律及其之间的相互关系，对浓香型白酒的发酵机理进行了初步探讨。
【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2012(000)001【总页数】4页(P47-50)【关键词】微生物;浓香型白酒;发酵因子;香气成分;变化规律【作者】方军;张宿义【作者单位】泸州老窖股份有限公司,四川泸州646000;泸州老窖股份有限公司,四川泸州646000【正文语种】中文【中图分类】TS262.31;Q93-3在浓香型白酒发酵过程中，涵盖了一个由庞大、复杂的微生物区系发动起的物质能量代谢过程。
伴随着糟醅发酵的进行，窖池微生物区系不断地发生着有序的消长变化。
清香大曲糖化力酯化力功能及真菌群落结构分析
清香大曲糖化力酯化力功能及真菌群落结构分析大曲是白酒酿造中微生物和酶的有效载体，在白酒酿造过程中起糖化、发酵、生香作用，被称为酒之骨。
由于大曲本身是生料制曲、自然接种、开放式培养，导致大曲中微生物种类非常复杂，因而也是酿酒微生物研究的重要内容。
大曲是酿酒的糖化发酵剂，说明大曲中真菌来源的酶为酿酒原料中淀粉的降解提供糖化酶等相关酶类，更说明大曲中真菌的重要作用。
本文针对清香大曲真菌群落结构，大曲糖化力、酯化力功能进行了相关研究。
本文首先利用高通量测序法分析了冷季和热季清香白酒生产用曲真菌群落结构。
结果表明，用不同的宏基因组DNA试剂盒以及不同测序区域18S V4区和ITS区得到较为一致的结果，清香大曲在热季和冷季的主要真菌类群相同，主要的真菌类群有霉菌和酵母，霉菌有Rhizopus oryzae（米根霉）和Lichtheimia corymbifera （伞枝犁头霉），酵母有Pichia kudriavzevi（i库德毕赤酵母）和Saccharomycopsis fibuligera（扣囊复膜酵母），两种霉菌含量明显高于酵母，而且冷季酵母比例较热季明显减少。
通过本实验可以确认清香大曲主要真菌类群有米根霉、伞枝犁头霉，酵母菌则比较少，主要有扣囊复膜酵母和库氏毕赤酵母。
糖化力的高低对于酿酒过程有很大影响，尤其在清香白酒的发酵初期。
本文选取只有糖化力不同其它成分完全相同的大曲添加到酒醅中进行酿酒实验，结果表明糖化力为1200U、1500U时，酵母菌生长过快，在2对时已达较高，容易出现菌种早衰的现象，不符合前缓、中挺、后缓落的规律。
糖化力为900U时，酵母菌在4对时达到最高点，符合一般发酵规律；糖化力为600U和300U 时，酵母菌生长减弱，最高点的酵母菌数量减弱，有可能导致发不起来的后果。
结合酒精度变化情况，糖化力为1500U、1200U和900U的酒醅发酵结束后酒精度比较高，说明较高的糖化力水平有助于提高原料出酒率。
浓香型白酒大曲发酵成熟过程中四种主要酶产生菌多样性分析
浓香型白酒大曲发酵成熟过程中四种主要酶产生菌多样性分析大曲具有糖化、发酵、酒化和生香等功能,不但为大曲酒的发酵、成香提供必不可少的微生物菌群和风味前驱物,还提供发酵所必须的丰富的生物催化剂——酶类。
大曲,作为大曲酒品质和产量的重要保障,一直是白酒行业研究的重点。
单宁酶(EC3.1.1.20),也称作单宁酰基水解酶、鞣酸酶。
单宁酶能水解没食子单宁中的酯键和缩酚羧键,生成葡萄糖和没食子酸,同时影响着白酒的风味及品质,单宁酶在食品、化工和制药等领域有着广泛的应用。
酯化酶是浓香型白酒生产中的最为的重要酶类之一,酶化酶含量多少和酶活高低,都与白酒优质酒率有着密不可分的关系。
蛋白酶在白酒酿造过程,不仅能水解发酵原料和菌体的蛋白质,还能促进产酒和生香、降低杂醇油含量。
脂肪酶为微生物生长繁殖,以及白酒风味物质具有一定影响。
实验以单宁酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶为研究重点,采取平板分离法筛选产酶微生物,通过测算透明圈直径与菌落直径比值判断各菌落产酶能力并对菌落形态进行分辨描述,利用分子生物学手段对纯化菌株进行5.8S PCR和16S PCR分子鉴定。
各酶产生菌菌落形态及种属情况如下所示。
(1)实验分离得到产单宁酶的真原核微生物菌落共有16个类别,其中真核产生菌有9个类别,比原核产生菌多了两类,且发酵期大曲样品中的真核单宁酶产生菌菌落形态多样性显著多于成熟期的大曲样品。
分子生物学鉴定得到产单宁酶真核微生物有三个属(Penicillium、Aspergillus和Byssochlamys),其中Aspergillus有六个种,占全部单宁酶真核产生菌的60%。
其次是Penicillium属的Penicillium commune strain、Penicillium chrysogenum strain和Penicillium robsamsonii三个种。
鉴定到的单宁酶原核产生菌的三个属都各只一个种,即Bacillus siamensis strain、Oxalophagus oxalicus strain和Pedobacter sp。
泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析
摘要本文采用Illumina PE250测序法对浓香型新窖泥、老窖泥和品质较好的老窖泥中微生物群落结构与多样性进行研究。
结果表明:从门水平结构分析,厚壁菌门与子囊菌门分别为浓香型白酒窖泥的优势细菌与优势真菌;从属水平结构上分析,新窖泥的优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是单端孢属;老窖泥与品质较好的老窖泥优势菌属是乳酸菌属,优势真菌属是青霉属。
不同窖龄、不同质量的窖泥微生物结构多样性具有显著差异。
关键词浓香型白酒;窖泥;微生物多样性;结构组成中图分类号TS201.3文献标识码A 文章编号1007-5739(2021)03-0203-04DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2021.03.078开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Microbial Community Structure and Diversity in Luzhou-flavor Liquor Cellar MudLIANG Huan 1XU Changfeng 2*TANG Weibin 2REN Yueming 2ZHU Lining 3(1School of Biological Science and Engineering,Hebei University of Economics and Business,Shijiazhuang Hebei 050200;2School of Biological Science and Engineering,Xingtai University,Xingtai Hebei 054001;3Hebei Fenglaiyi Wine Co.,Ltd.,Ningjin Hebei 055550)Abstract In this paper,Illumina PE250sequencing method was used to study the microbial community structure and diversity in Luzhou-flavor new cellar mud,old cellar mud and good quality old cellar mud.The results showed that,from the perspective of phyla level,Firmicutes and Ascomycetes were the dominant bacteria and fungi in luzhou-flavor liquor cellar mud respectively;the dominant bacteria were Lactobacillus and the dominant fungi were Trichothecene in the new cellar mud from the analysis of the genus level.The dominant bacteria was Lactobacillus and the dominant fungi was Penicillium in the old cellar mud and good quality old cellar mud.There were significant differences in microbial structure diversity of pit mud with different ages and qualities.Keywords Luzhou-flavor liquor;cellar mud;microbial diversity;structural composition泥坑浓香型白酒窖泥中微生物群落结构与多样性分析梁欢1许长峰2*唐伟斌2任月明2朱立宁3(1河北经贸大学生物科学与工程学院,河北石家庄050200;2邢台学院生物科学与工程学院,河北邢台054001;3河北凤来仪酒业有限公司,河北宁晋055550)浓香型白酒具有独特的酿造工艺,混有特殊的窖香风味,深受人们喜爱[1]。
大曲贮存过程中理化指标及微生物变化研究
ｐ Ｈ ４ ． ６乙酸 一醋酸钠缓冲液 ： 量取 １ １ ． ８ ｍ Ｌ冰乙
作者简介 ： 孟姣姣 （ １ ９ ９ １ － ） ， 女， 大学 ， 食品科 学与工程 专业 ， 从事 白酒、 大曲生产过程 中的微 生物研 究， 发表论文 多篇。 ★ 通讯作者 ： 崔海灏 （ １ ９ ７ ４ － ） ， 高级工程师， 河北三井酒业股份有 限公 司。
第 ４ ２卷 第 ５期
２ ０ １ ５ 年 ９ 月
酿
酒
Ｖ０ １ ． ４２ ． № ． ５
Hale Waihona Puke ＮＧ Ｌ Ｉ Ｑ Ｕ Ｏ Ｒ ＭＡＫＩ
Ｓ ｅ ｐ ． ，２ ０１ ５
文章编号： １ ０ ０ ２ — ８ １ １ ０ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ５ — ０ ４ ３ — ０ ３
短， 生香 酵 母 在 堆 积过 程 中还没 有 代 谢 产 生 足 够量 的其 它香 味 成分 。
３ 结 果
刺鼻 ， 酸度比芝麻香型丢糟高 的缘故。
白 曲麸 曲 在 芝 麻 香 型 白酒 的过 程 中主 要 提 供 了糖 化 酶 和 酸性 蛋 白酶 ， 其 主要 功 能 分 别 是糖 化淀
Ｔｌ ｌ ｅ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ａｂ ｏ ｕ ｔ ｔ ｈ ｅ Ｃｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｓ ｏ ｆ Ｐ ｈ ｙ ｓ ｉ ｃ ｓ ａ ｎ ｄ Ｃｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｉ ｎ ｄ ｅ ｘ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ
Ｍｉ ｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ａ ｌ Ｄｕ ｒ ｉ ｎｇ Ｓ ｔ ｏ ｒ ａ ｇ ｅ Ｐｅ ｒ ｉ ｏ ｄ Ｄａ ｑ ｕ
大曲是大 曲酒生产 的糖化剂 、 发酵剂 ， 内含大 于使大 曲的生产 、 贮存 、 使用 向科学化、 系统化 、 可控 曲酒生产 、 发酵必须的各 种酶和微生物 ， 对大 曲酒 化 发展 ［ ２ １ 。
白水地区清香型大曲理化指标及真菌多样性分析
白水地区清香型大曲理化指标及真菌多样性分析陈佩;翟彩宁;刘莹;李军莉;党辉【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2024(50)10【摘要】该研究在测定了陕西白水地区清香型大曲理化指标的基础上,进一步采用MiSeq高通量测序技术对其真菌类群进行了解析,并探讨了真菌类群与理化指标间的相关性。
理化指标检测结果显示,不同清香型大曲样品在酒化力、发酵力、液化力和糖化力等指标上存在较大差异(变异系数>15%),且酸度偏低(0.52~0.76mmol/10 g)。
测序结果显示优势真菌类群主要为红曲霉菌属(Monascus,37.37%)、嗜热子囊菌属(Thermoascus,25.57%)和根霉菌属(Rhizopus,21.70%)等。
相关性分析显示Rhizopus与糖化力和发酵力之间存在显著正相关关系(P<0.05),而Xeromyces和Lichtheimia均与氨基酸态氮之间存在显著负相关关系(P<0.05)。
此外,该研究从MG-RAST数据库中下载了湖北襄阳地区清香型大曲的真菌序列,将白水地区与襄阳地区清香型大曲的真菌群落结构展开了比较分析。
结果显示白水地区清香型大曲的真菌多样性要显著高于襄阳地区,且白水地区的特征微生物主要为Rhizomucor和Lichtheimia等,而襄阳地区的主要为Monascus。
与此同时,2个地区清香型大曲中还含有Thermoascus、酵母菌属(Saccharomycopsis)、假丝酵母菌属(Candida)和Aspergillus等核心真菌类群。
纯培养结果表明白水地区清香型大曲中的可培养酵母菌主要为Saccharomycopsis fibuligera。
由此可见,白水地区清香型大曲在酒化力、发酵力和糖化力等理化指标上存在一定差异,其中的优势真菌主要以Monascus、Thermoascus和Rhizopus为主,且优势真菌类群与部分理化指标间存在一定的相关性。
浓香型白酒大曲生产相关酶研究、利用现状
浓香型白酒大曲生产相关酶研究、利用现状XX：蒋春华学号：110604029摘要：白酒在我国具有上千年历史，其独特工艺堪称古代劳动人民的伟大创举。
它以透明的外观、幽雅的香气、醇厚的口感深受人们喜爱。
对于浓香型白酒而言大曲酒酿造生产中的重要物质，是酿酒生产的糖化、发酵、酒化和生香剂，其品质对曲酒的出酒率和酒质都有极大的影响，常有“曲是酒之骨”之称。
浓香型大曲酒发酵属于多种微生物群的共同发酵,是一个复杂的生物化学反应体系。
所以对于浓香型白酒大曲生产相关霉的研究是非常有必要的，这样才能更好利用大曲中的相关霉，使酒的品质得到进一步地提高。
解决那些发酵周期长、设备利用率低、粮耗高、出酒率低等缺陷。
关键词：浓香型白酒大曲酶研究、利用现状浓香型白酒大曲中的酶有很多，主要的酶系有糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶（红曲霉）、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶、果胶酶等酶类组成。
本文我将对这些酶的相关研究及主要酶类在白酒生产中的应用现状进行简要概述，并阐明大曲酶的利用现状。
、1、糖化酶：糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，糖化酶的底物专一性较低，它能很快的把直链淀粉从非还原性末端开始，依次水解α－1、4葡萄糖苷键，也能缓慢水解α－1、6键和α－1、3键，转化为葡萄糖。
同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。
其作用条件为40～65℃、pH 3.0～5.5。
应用于酿酒生产，既能保持原酒的风味特色，又能提高出酒率。
大曲中糖化酶活力的高低直接关系到酒的质量。
糖化酶的优点：1）、糖化酶对设备没有腐蚀性，使用安全。
使用糖化酶工艺简单、性能稳定、有利于各厂的稳定生产。
2）、使用糖化酶对淀粉水解比较安全，可提高出酒率，麸曲法能减少杂菌感染，节约粮食可降低劳动强度，改善劳动条件。
3）、使用糖化酶有利于生产机械化，有利于实现文明生产。
2、α- 淀粉酶：α-淀粉酶在作用淀粉时，是一种内切葡萄糖苷酶能以随机方式从淀粉分子内部切开α-1，4- 葡萄糖苷键，使淀粉分解成长短不一的短链糊精和少量的低分子量糖类，从而使淀粉醪液的黏度显著下降，达到液化淀粉的作用，故又称为液化酶。
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浓香型大曲贮藏过程中糖化力发酵力变化及真菌多样性分析施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【摘要】为了探究大曲贮藏过程中微生物群落结构变化,采用高通量测序技术分析了真菌18S rDNA V4区,聚类分析共产生3 747个OTU分类.结果表明,在贮藏过程中大曲真菌群落结构不断调整,毕赤酵母属、根霉菌属及横梗霉属成为最终的优势菌群.随着时间的推移,大曲发酵力逐渐升高,而糖化力则经历了由高变低再升高的过程.数据结果与大曲质量要求相符,能为后续酿造提供足够动力.%To explore the change of microorganisms communities of Daqu in the storage process,the V4 regions of fungal 18S rDNA were analyzed by high-throughput sequencing,3747 OTUs were obtained in clustering analysis.The results showed that fungal community structure was constantly adjusted,Pichia,Rhizopus,Lichtheinia became the dominant genera at the end of storage.The fermenting power of Daqu gradually increased as time going on,while saccharifying power gradually decreased and then increased again.The data meet the requirements for quality of Daqu,which can provide enough power for the subsequent brewing.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)005【总页数】4页(P76-79)【关键词】大曲;储藏;真菌多样性;理化指标【作者】施思;彭智辅;乔宗伟;刘多涛;罗青春;涂福明【作者单位】五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;固态发酵资源利用四川省重点实验室,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007;五粮液股份有限公司,四川宜宾,644007【正文语种】中文在我国传统酿酒行业一直流传着“曲乃酒之骨”的说法，曲药既是酿酒的糖化发酵剂，又是酿酒的重要原料，同时为酿酒提供部分风味物质或风味前体物质，对白酒的香型风格有着举足轻重的作用。
五粮液作为中国浓香型白酒的典型代表，采用了独特的“包包曲”制曲工艺，以小麦为原料，经粉碎、加水拌合压制而成，天然接种，多微共酵。
作为中国传统酿造的浓香型白酒大曲，其微生物菌群的丰富度不言而喻，微生物的生长代谢也决定着大曲品质的优良。
近年来，随着测序技术的迅猛发展，广大科研工作者为了更加全面的认识曲药微生物，采用免培养技术做了大量研究。
梁晨等人采用Mi Seq测序方法研究了大曲贮存过程中原核微生物群落结构演替规律，共得到3 710个OTUs，指出乳杆菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、高温放线菌属、乳球菌属等是大曲中的优势菌群[1]；高亦豹等人利用PCR-DGGE技术对江苏北部某酒厂高温和中温大曲细菌菌群结构进行了分析，检测到了传统方法未能分离鉴定的Staphylococcus xylosus、Klebsiella oxytoca[2]。
另外，孟镇等人运用DGGE 技术及条带测序解析了山东某酒厂浓香型白酒大曲的细菌菌群，其结果显示了该酒厂大曲中细菌主要属于厚壁菌门[3]；罗惠波等人利用PCR-SSCP技术对泸州老窖大曲发酵过程中原核微生物菌群结构进行了研究，结果发现大曲发酵温度的变化对原核微生物多样性影响较小，而发酵后期的湿度、水分可能是造成原核微生物多样性改变的重要原因[4]。
大量研究结果表明，免培养方法检测大曲微生物组成更为直观、高效和全面。
综合浓香型大曲微生物研究现状和研究手段可知，利用高通量测序技术对真菌微生物的研究相对较少，而大曲作为糖化发酵剂，糖化力和发酵力是衡量大曲质量的重要指标，与之相关的微生物更是研究热点。
而大曲在投入生产前会经过长达数月的储存过程，期间发生多种生化反应，使得微生物区系结构、酶系结构、物系结构都会发生重大变化，是重要的后熟过程，对最终曲药质量产生重要影响，也很有必要对其进行深入研究。
因此本研究选取储藏期大曲样本进行针对18S rDNA V4区高通量测序，并跟踪检测其糖化力发酵力变化规律，一方面可以了解大曲微生物菌群的基本构成和丰度变化，弄清微生物多样性的构成差异与不同大曲质量的相关关系，另一方面，研究结果可以为更好地理解大曲贮藏的科学必要性提供一些参考数据及新的思路。
1.1 曲样选取五粮液制曲车间某一陈化曲库，在其储存过程中进行定点跟踪取样，每月1次，共计5个样品。
样品破碎成粉后用无菌袋密封，按取样时间依次标记为1、2、3、4、5。
1.2 主要试剂与仪器1.2.1 试剂真菌宏基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)；Q10212 Qubit2.0 DNA检测试剂盒(life)；V43NDF引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGA￣T￣C￣T￣N￣G￣G￣C￣A￣A￣G￣T￣C￣T￣G￣G￣TGCCAG；EukV4R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACC￣C￣G￣A￣G￣A￣A￣TTCCAACGGTATCTRATCRTCTTCG。
(上海生工)；理化检测试剂均为国产分析纯。
1.2.2 仪器UNIVERSAL 320R冷冻离心机；HWS26型电热恒温数字水浴锅；T100TM Thermal Cyeler PCR仪；DYCZ-21电泳槽；美国UVP凝胶成像系统等。
1.3 实验方法1.3.1 宏基因组提取采用差速离心法收集微生物细胞沉淀[1]，采取反复冻融与试剂盒相结合的方法，收集DNA，置于-20 ℃保存；利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应加入的DNA量。
按照产品说明书进行操作。
1.3.2 PCR扩增利用引物V43NDF和EukV4R对大曲真菌基因组18S rDNA V4进行扩增。
扩增体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol/L each) 0.5μL，DNA10 ng，引物F(50 μmol/L)0.5 μL，引物R (50 μmol/L)0.5 μL，Plantium Taq(5U/μL)0.5 μL。
扩增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，共5个循环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共20个循环；72 ℃ 5 min。
1.3.3 DNA纯化及高通量测序DNA纯化及高通量测序由上海生工有限公司完成。
利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，以方便按照1∶1的等量混合后测序。
等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度为20 pmol。
高通量测序数据主要采用Mothur和Excel软件进行统计和分析，将相关序列提交NCBI数据库进行BLAST同源性比较。
按照0.03的离散度聚类生成OTU，与RDP数据库比对得到物种分类信息，并计算每个样品的Chao1值，Shannon指数等。
1.3.4 糖化力及发酵力测定按照五粮液企业技术标准执行(2005年颁布)。
糖化力：1 g绝干曲，在30 ℃、pH4.6、60 min分解可溶性淀粉为葡萄糖的质量(mg)，即mg/(g·h)，底物为2.0%的可溶性淀粉溶液；发酵力：1 g绝干曲在30 ℃发酵72 h利用蔗糖产生CO2的体积(mL)，即mL/(g·72 h)，底物为8%的蔗糖溶液。
2.1 真菌多样性分析2.1.1 测序序列数目和多样性指数分析由图1及表1的Coverage指数可知，取样覆盖率均超过97%以上，样品随着测序序列数的增加，多样性指数曲线趋于平坦，说明本次试验取样合理，结果能代表样本的真实情况，更多的取样仅会产生少量的OTU。
对各样本测序序列进行质控过滤后，大曲储藏过程中的5个样本测序共获得116 122条序列，聚类分析共产生3 747个OTU分类。
Shannon 指数、Chao1指数是常用的描述群落物种多样性的指数，其中，Shannon值越大，说明群落多样性越高；Chao1指数常用来估计物种总数，其值越高，物种丰富度越高[5]。
由表1可知，大曲真菌微生物多样性随着储存时间的推移，Shannon index有所上升，接下来则需弄清微生物组成具体发生了哪些变化。
2.1.2 OTU分布的Venn图Venn图可以用来统计样本中共有和独有的OTU的数目，直观地展现样品OTU数目组成的相似性及重叠情况。
如图2所示，样品1到5独有的OTU数目依次为654、667、737、680和590，均远远超过自身总OTU的半数以上；5个样品共有的OTU仅28个，其所代表的真菌物种长期存在于储藏期内。
通过Venn图可以看出，每个样品都具有极高的特异性，说明真菌结构随着时间的变迁发生了较大的改变。
接下来，我们将通过真菌多样性分析，弄清哪些物种的改变和数量的变化造成了这样的差异。
2.1.3 大曲贮藏过程中不同时期真菌多样性分析对样品中物种多样性进行分类分析，可以得到以下2个信息：(1)样品中含有何种微生物；(2)各微生物的相对丰度。
为了展示效果，一般只显示相对丰度前50的物种分类，剩余物种合并为other。
如图3所示，在属水平上大曲贮藏过程中真菌多样性有较为明显的差异。
大曲贮藏初始阶段，毕赤酵母属(Pichia)所占比例最高为42.27%，是样品1中第一大优势属，其次枝氯霉属(Ramichloridium)也是主要真菌类群，所占比例为26.09%。
复膜孢酵母属(Saccharomycopsis)、根霉菌属(Rhizopus)和横梗霉属(Lichtheinia)也被检测到，所占比例分别为6.03%、5.24%和3.34%。
此外，一类分类信息不明的真菌类群(unclassified)所占比例达到了12.4%。
随着时间的推移，Ramichloridium 不再是优势真菌，而Pichia比例也略有下降，在贮藏末期(样品5)中占比为28.11%，不过仍为相对数量最多的优势真菌；Rhizopus数量则稳步增加，最后比例达到了17.37%。