贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律

贮存过程中大曲原核微生物多样性及土味素含量变化规律杜海;杜小威;赵景龙;张鑫;徐岩【摘要】通过对不同贮存时期大曲的微生物群落结构的分析,进一步阐述了大曲的贮存过程的必要性.采用MiSeq高通量测序方法,鉴定出原核微生物119个属.其3种大曲相对丰度靠前的优势菌属主要为乳酸菌属、芽孢杆菌属、明串珠菌属、魏斯氏菌属、链霉菌属、短杆菌属等.随着贮存时间的推移,3种大曲的物种多样性都处于上升趋势.在各个阶段高温曲的物种丰度和多样性都高于清茬曲和红心曲,说明高温曲的制曲工艺使得微生物生长更活跃.分析3种大曲中链霉菌与土味素的含量变化趋势,在贮存3个月时,两者的含量相对较低.因此,从异味控制的角度来看,大曲贮存3个月左右的时间更利于白酒风味的形成.%The necessity of storage of Daqu was clarified by analyzing microbial community structure of Daqu during different storage periods.119 genera of prokaryotic microbe were identified using the method of MiSeq highthroughputsequencing.Dominant microbes which have a relatively higher abundance in three kinds of Daqu mainly wereLactobacillus,Bacillus,Leuconostoc,Weissella,Streptomyces,Brevibacterium etc.Species diversity of three kinds of Daqu presented a rising tendency as time goes on.Species diversity and abundance of Gaowen Daqu were higher than those of Qingcha Qu and Hongxin Qu.It indicated that the craft process of Gaowen Daqu was more suitable for the growth of microbes.Both the content of geosmin and abundance of Streptomyces in the three kinds of Daqu were found obviously lower in the third month ofstorage compared with the initial stage.Therefore,Daqu storing over three month was conductive to the control of off-odor.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P1-6)【关键词】大曲贮存;MiSeq测序;微生物群落;链霉菌【作者】杜海;杜小威;赵景龙;张鑫;徐岩【作者单位】江南大学,酿酒科学与酶技术中心,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;山西杏花村汾酒厂股份有限公司技术中心,山西汾阳,032205;江南大学,酿酒科学与酶技术中心,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文中国白酒历史久远，是以粮谷为主要原料，以大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒。

大曲在白酒酿造过程中有着举足轻重的地位，其中栖息着丰富的微生物种属(比如细菌、酵母及霉菌等)[1]，其作为白酒酿造过程中微生物及生物酶的有效载体，在白酒酿造中起着糖化、发酵、生香的作用，因此，大曲质量的好坏会直接影响到白酒的产量以及质量。

大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过粉碎，加水混捏，压成曲醅，形似砖块，大小不等，让自然界各种微生物富集生长而制成[2]。

清茬、红心、高温这3种大曲在培养的过程中存在差异，具体来说是3种曲在培养温度上各有不同[3]。

因而其生化性能与微生物的数量也有较大的差异性，而这些差异与工艺是相一致的。

据目前的研究，在贮存3个月后，清茬曲的糖化力、液化力和蛋白酶均高于另两种大曲。

而红心曲中的细菌含量最高，清茬和高温曲中总的酵母和霉菌的含量比较高[4]。

3种大曲若单独发酵，出酒率是高温曲最高，清茬曲次之，红心曲最低。

而将3种大曲按照一定比例混合(3∶3∶4)，则出酒率会得到提高。

3种大曲混合可以取长补短，菌种较多后，各种营养的成分才能尽可能地被各种微生物利用，进而代谢出各种产物，提高出酒率的同时也能提高其质量和风味[5]。

同时，大曲白酒中除香气成分以外，还存在着许多像糠嗅味、涩苦酸等常见的不愉快气味[6]。

其中，糠嗅味则在清香型白酒中表现更为突出。

研究表明，产生这一异味的源头为大曲中链霉菌代谢的土味素[7]。

研究制曲过程分析土味素产生菌变化规律以及其他微生物之间的相互作用，对于白酒风味提升以及品质稳定性的提高有重要意义。

根据文献记载，PCR-DGGE技术在21世纪初开始运用到大曲微生物的研究中，使人们更近一步地认识大曲中的微生物的分布[8]。

CHEN等人采用PCR-DGGE技术，共检测到了11株细菌、9株杆菌和7株真菌，其中优势菌群有枯草杆菌和米曲霉[9]。

利用PCR-DGGE技术来研究大曲中的微生物，能够提供微生物群落中比较详细的种类信息并且可以同时去分析多个样品，但弊端是实验操作很繁琐，对微生物多样性的认识比较有限[10-11]。

近几年，因为高通量测序技术的发展，在微生态学研究中开始大规模地使用二代测序技术。

ZHANG等人利用二代测序的技术，分析了清香型白酒3种大曲的微生物结构，为生产时大曲的添加比例提供了可靠依据[12]。

但新曲中微生物种类丰富且生物量较高，导致投入生产的酒醅发酵前升温迅速，总酸度高。

因此，出房大曲必须贮存于通风干燥的曲库。

在此过程中，随着贮存时间的推移，3种大曲中所含微生物的结构也在不断发生变化。

目前关于这些微生物结构的动态变化报道还相对比较少。

本研究以汾酒酿造用大曲为研究对象，通过提取大曲微生物总DNA、PCR扩增等预处理，以MiSeq高通量测序剖析大曲贮存过程中微生物群落结构变化；对微生物群落组成进行比较研究，以此分析各功能菌的变化趋势，从而进一步解析清香型大曲功能微生物，探究大曲最合适的贮存时间。

1.1 大曲样品实验大曲样品取自某清香型白酒厂所产清茬曲、红心曲和高温曲，3种大曲均按照出房、贮存1个月、3个月和5个月一共4个时间点分别采集。

为了保证取样的科学性以及均一性，出房时在5处取样，贮存1个月、3个月和5个月则随机选取3块大曲做平行样并放置在-20 ℃进行保藏。

1.2 样品前处理取7 g大曲样品，加入20 mL无菌的0.1 mol/L PBS缓冲液(0.057 7 mol/LNa2HPO4，0.042 3 mol/L NaH2PO4)将样品悬浮，再加入玻璃珠平放漩涡振荡3 min使其充分混合。

将混合样300×g转速下离心5 min，取上清液，沉淀用上述PBS缓冲液重复洗涤3次，再次离心后收集全部的上清液。

上清液于10000×g离心15 min，收集细胞沉淀。

用5 mL PBS缓冲液将上述沉淀重复洗涤3次，直到洗液干净呈无色状态，再10 000×g离心10 min重新收集细胞沉淀。

1.3 大曲宏基因组提取采用玻璃珠细胞破碎仪破碎细胞，苯酚氯仿抽提方法提取窖泥细菌基因组，具体方法参照文献[14]。

1.4 IlluminaMiseq测序及序列分析利用引物对338F (5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GTGGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，对上述大曲基因组进行PCR扩增，该对引物针对细菌16S rRNA基因序列中的V3-V4可变区进行扩增。

将合并的PCR产物按照说明书TruSeq® DNA Sample Preparation Guide中的Low Sample (LS)Protocol进行文库制备，然后在Illumina平台上进行双端测序(2×250 bp)。

然后将所得原始序列按照Ren等人的方法进行序列质量控制处理最终得到有效序列。

本实验用QIIME′s uclust程序将相似度为97%有效序列归为一个OTU并确定每个OTU的代表序列。

利用QIIME软件计算酒醅微生物群落的α-多样性信息，包括Shannon及Chao1指数。

基于Weighted UniFrac距离对不同酒醅样品中微生物群落进行主坐标轴分析(PCoA)。

将每个OTU的代表序列与Ribosomal Database Project (RDP)在线数据库进行比对，选取置信度为80%的阈值对上述序列进行分类，进而得到每个OTU的分类水平，即门、纲、目、科及属水平。

采用MiSeq测序技术结合PCR技术对3种大曲样品进行定性定量分析，将测序结果所得到的原始的序列按照REN[15]等人的方法进行一个初步的处理，来控制质量，进而得到有效的序列。

然后将每个OUT所代表的序列在NCBI的在线数据库里进行比对，选择匹配度最高的比对结果，进而进行分类，得到门、纲、目、科、属5个水平。

基于以上处理结果，探究其在不同贮存时期微生物群落的变化，以此来区分3种大曲，以及每种大曲在不同时期的特点。

2.1 三种大曲贮存过程中微生物群落结构差异为了更加全面地揭示3种大曲在贮存过程中微生物群落的组成以及多样性信息，本研究采用IlluminaMiSeq技术，对清茬、红心和高温曲不同贮存时间下微生物群落结构进行了分析。

图1为3种大曲在不同贮存时间下针对原核微生物测序结果的稀释曲线。

该曲线相对来说趋于平缓，说明本研究测序结果可以比较全面的覆盖应有的物种。

表1中分析了3种大曲细菌的Chao1和Shannon指数。

表中显示，随着贮存时间的推移，原核微生物多样性总体呈现先上升后下降的趋势。

清茬曲和红心曲在贮存3个月的时候物种丰度和多样性达最高值，高温曲则在贮存5个月的时候达到最高。

说明大曲贮存过程中微生物的群落多样性及结构在不断地进行调整变化。

生物多样性与后期发酵风味的产生密切相关，各菌种相互平衡、协同作用，更利于发酵的进行。