具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选
海洋微生物产生的抗肿瘤物质研究
海洋微生物产生的抗肿瘤物质研究在当今医学领域中，癌症是一种全球性的重大疾病，已经成为世界范围内死亡率最高的疾病之一。
尽管人们已经在癌症治疗方面取得了一些进展，但仍然需要寻找新的治疗方法。
近年来，越来越多的研究表明，海洋微生物中的天然产物可能成为抗肿瘤药物的重要来源。
本文将重点讨论海洋微生物产生的抗肿瘤物质的研究进展和前景。
1. 海洋微生物的多样性及潜在应用海洋是地球上最大的生物资源库之一，其中包含着极其丰富的微生物群落。
由于海洋环境独特的物理、化学特性，海洋微生物具有广泛的生物多样性，并且产生了许多具有潜在应用前景的活性分子。
其中，包括对抗肿瘤活性的物质。
2. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的发现和鉴定目前，研究人员通过不同的方法和策略，如生物活性筛选、化学组合分析、基因组学等，发现了许多海洋微生物产生的具有抗肿瘤活性的物质。
这些物质中包括多种天然产物，如生物碱、多糖、脂质、蛋白质等。
通过进一步的鉴定和研究，研究人员已经发现了一些具有潜在抗肿瘤效应的分子。
3. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的机制研究抗肿瘤物质的机制研究是揭示其抗肿瘤活性的重要途径。
通过研究海洋微生物产生的抗肿瘤物质的作用机制，可以帮助我们更好地了解肿瘤细胞的发生和发展过程，并为新型抗肿瘤药物的开发提供重要的启示。
现阶段，研究人员已经发现了一些海洋微生物产生的抗肿瘤物质的机制，如抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡、抗氧化、调节免疫等。
4. 海洋微生物产生的抗肿瘤物质的应用前景海洋微生物产生的抗肿瘤物质具有广泛的应用前景。
这些物质可能成为新型的抗肿瘤药物或为现有的抗肿瘤药物提供辅助治疗。
目前，已经有一些海洋微生物产生的活性物质进入了临床试验阶段。
例如，海洋微生物产生的抗肿瘤物质某某素已经显示出良好的抗肿瘤活性，并在临床试验中取得了一定的进展。
5. 未来的研究方向和挑战尽管目前已经取得了一些进展，但海洋微生物产生的抗肿瘤物质的研究仍面临一些挑战。
例如，海洋微生物产生的抗肿瘤物质的提取和纯化过程仍然较为困难，且目前还没有找到高效的合成方法。
抗肿瘤海洋真菌的筛选及菌株HGQ6的初步研究
作者 简介 ： Ｎ （９ ７ ， ， ￣ ： １７ 一）男 安徽太和人 ， 淮海 工学院江苏省海 洋生物技术重点建 设实验室讲师 ， 士 ， 博 主要从事生 物资源开发与利 用
研 究 ，Ｅ ｍａ ）ｅ ｕｏ ｓｎ． ｏｎ （ — ｉ ｌｇ ｏ＠ ｉａｃ ｒ ｌ ｉ ．
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淮 海 工 学 院 学 报 （ 然科学版） 自
Ｈｅ ａ 结 肠 癌细 胞 Ｌ Ｌ， ＯＶＯ， 卵巢癌 细胞 Ｓ Ｖ３ 胃 ＫＯ ， 癌 细胞 Ｂ ８ ３ 均 由中国药 科大 学提供 。 ＧＣ ２ ，
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关键 词 ： 洋真 茵 ； 海 抗肿 瘤 活性 ； 筛选 ； 定 ； 鉴 理化 性质 中图分 类号 ： ３３ １ Ｑ９ －３ 文献标 识 码 ： Ａ 文 章编号 ：６ ２６ ８ （ ０ １ ０ —０ ５０ １ ７— ６ ５ ２ １ ） ３０ ８ —４
￣ ｅ ｎ ｎＲ ｏ Ｓ ｒ ｅ ｉ ｆ Ａｎｔｔ ｍ ｏ ａ ｉ ｎｇ ｓ ａ ｃ ｎｇ Ｏ ｔ ｉｕ Ｕ ｒ Ｍ ｒ ｎｅ Ｆｕ ｕ ｎｄ
ｓ ｒｂ ｄ ｓ ａ ｅ （ＴＳ ｅ ｕ ｎ ｅ ｔａｎ ＨＧＱ６ ｗａ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓＰｅ ｉｉｌｕ ｃ ｒ ｓ ｇ ｎ ｍ ． ｃ ｉｅ ｐ ｃ ｒ Ｉ ）ｓ ｑ ｅ ｃ ，ｓｒ ｉ ｓｉｅ ｔｆ ｄ ａ ｎ ｃｌｉｍ ｈ ｙ ｏ ｅ ｕ ｉ
从海藻和植物中发现抗菌和抗肿瘤活性化合物
从海藻和植物中发现抗菌和抗肿瘤活性化合物目前,新药尤其是抗生素,急切需要解决病原体抗性的问题,其中大自然拥有最丰富的新抗生素来源,因此,从天然资源中寻找具有显著生物活性的天然产物仍然是发现新药先导化合物的主要途径。
此外,抗生素在生物工程合成领域和化学合成领域也有相当大的进步。
海洋为海洋生物提供了巨大而多样的栖息地。
海洋因其具有不断变化的温度,压力,盐度和金属浓度等因素,使得成为海洋植物和藻类产生新化合物的环境来源。
独特的海洋环境中生长着种类繁多的海洋植物和藻类,这些生物能产生很多具有生物活性的天然产物,不少是在陆地上不曾发现的。
独特的海洋生物使得海洋天然产物具有显著多样性。
近几十年来,海洋天然产物因其多样的生物活性和用途而备受关注。
据文献报道,已从海洋来源中分离出16000个天然产物,包括萜类化合物、甾体化合物、酚类化合物、生物碱-多糖复合物、多肽类化合物、聚酮类化合物、脂肪酸类化合物和甘油类化合物,到目前为止有6800篇出版物。
海洋环境中包含数量众多的微观和宏观有机体种类,特别是海洋植物和藻类被证实具有产生结构独特的次级代谢产物的能力。
植物在海洋世界中,在耐火生物材料的再循环上发挥重要的生态作用,并且在药学应用中能够生产新颖的次级代谢产物。
尽管海洋微生物能产生多种次级代谢产物,它被认为是抗生素的顶级生产者,同时也是制药工业的重要提供者,但在生产抗生素的总量上,海洋植物占最大份额。
海洋植物生长于各种环境中,其中不乏有生存压力,并且它们有能力产生次级代谢产物也是众所周知的。
因此,海洋生物产生的次级代谢产物的生物合成途径和酶反应系统与陆地生物相比有着巨大的差异,导致海洋生物往往能够产生一些化学结构新颖、生物活性多样、显著的先导化合物,为新药研究提供大量的模式结构和药物前体。
海洋是地球上最具多产的生态环境,生长其中的植物次级代谢产物具有相当高的多样性。
自早些时候以来,许多研究人员着眼与从陆地到海洋或淡水的藻类化学成分,尤其是绿藻类,它们有望在营养品和制药行业中被开发利用为功能活性物质;在广泛的陆生植物上研究了这些绿藻代谢产物的化学性质。
海洋微生物的抗肿瘤作用
海洋微生物的抗肿瘤药用价值引言：随着环境污染的加剧和人类寿命的延长，心脑血管疾病、恶性肿瘤等疾病日益严重地威胁着人类健康，与此同时新的疾病又不断出现，而细菌的抗药性问题也日趋严重，寻找新型药物已经成为十分迫切的任务。
由于陆地资源的不断开发，发现新型生物活性物质的可能性日趋减少，于是人们纷纷将目光投向海洋，特别是寻找抗肿瘤药物，从海洋中取药已经成为各国医药研究的新方向。
从海洋中取药：海洋的特殊环境如高压、低营养、低温(特别是深海)、无光照以及局部的高温和高盐等，造成了海洋微生物的多样性和特殊性。
美国海洋生物实验室研究表明，海洋微生物种类多达1000万种以上。
而目前所研究和鉴别过的海洋微生物还不到海洋微生物总量的5％。
由于海洋微生物具有独特的代谢途径和遗传背景，故可产生出不同结构和功能的天然活性物质，为寻找能解决目前疑难杂症（如恶性肿瘤）的药物提供了丰富的资源，也为微生物工业化生产新药开辟了一条崭新道路。
海洋微生物中抗肿瘤活性物质主要有三个来源，分别是海洋放线菌、海洋细菌和海洋真菌。
海洋放线菌:⏹放线菌是一类比其他微生物具有更为丰富的生物活性物质的生物资源，也是海洋微生物中抗肿瘤代谢产物的重要来源之一。
⏹海洋放线菌主要包括链霉菌属、小单孢菌属以及红球菌、诺卡氏菌、游动放线菌等稀有属种。
⏹应用于临床的微生物药物中，大部分来源于放线菌的次级代谢产物，并仍不断有新的发现。
在放线菌产生的有使用价值的药物中，抗菌药物较多，其次为抗肿瘤药物。
⏹海洋放线菌ACMA006属于链霉菌属 ,其发酵液对多种肿瘤细胞株都具有很强的细胞毒性，能诱导肿瘤细胞凋亡；有良好的抗肿瘤活性。
从发酵液中分离得到2种抗肿瘤活性化合物，放线菌素D以及放线菌素D的衍生物能够激活细胞凋亡程序诱导癌细胞凋亡，通过诱导细胞凋亡而杀死肿瘤细胞海洋细菌：⏹海洋细菌是海洋微生物抗肿瘤活性物质的另外一个重要来源。
主要集中在假单胞、弧菌属、微球菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属和别单胞菌属。
生物制造工艺中的微生物菌株筛选与鉴定
生物制造工艺中的微生物菌株筛选与鉴定生物制造工艺是一种利用生物体的代谢活动，生产化合物、材料等物质的技术。
在生物制造过程中，微生物作为重要的生物体被广泛应用。
不同的微生物菌株具有不同的代谢途径和特性，为生物制造带来了多样性和可塑性。
微生物菌株的筛选和鉴定是生物制造过程中不可或缺的环节。
一、微生物菌株筛选微生物菌株筛选是确定在生物制造工艺中使用的微生物菌株的过程。
微生物菌株筛选的目的是筛选出能够在特定条件下有效产生目标化合物、并具有良好稳定性的菌株。
1. 初步筛选初步筛选是指对一批菌株进行初步筛选，以确定其是否适合进行后续的深入筛选。
初步筛选的方法包括：对微生物菌株进行外观观察、有机物分解能力检测、生长速度检测、耐受性检测等，以排除生长缓慢、低产量、对特定条件不敏感等菌株。
2. 深入筛选深入筛选是指对初步筛选后的微生物菌株进行深入筛选，以确定其是否可以产生目标化合物。
深入筛选需要进行以下几个方面的检测：（1）代谢通路鉴定：通过对微生物菌株代谢途径的鉴定，确定其是否具有产生目标化合物的代谢能力。
（2）生物活性检测：通过对微生物菌株抗菌、杀虫、抗肿瘤、抗氧化等生物活性的检测，确定其是否具有生产潜力。
（3）产量检测：通过对微生物菌株产生的目标化合物产量进行检测，确定其产量是否满足生产需求。
二、微生物菌株鉴定微生物菌株鉴定是对已经确认生产潜力的微生物菌株进行结构、生理、生化、分子生物学等多方位的检测，确定其属于哪一个物种、亚种以及亚型等级。
微生物菌株鉴定的目的是确保使用的微生物菌株的质量和稳定性。
1. 形态学和生理学特征鉴定形态学和生理学特征鉴定是通过对微生物菌株形态特征和生理学特征的描述，确定其属于哪一个物种。
形态学和生理学特征包括微生物菌株的菌落形态、色素特征、形态、大小、运动方式、传代过程等。
2. 生化特征鉴定生化特征鉴定是通过对微生物菌株进行化学反应、生化反应等测试，考察其在代谢途径中的特殊酶类的运作和产物的生成，进而确定其属于哪个物种和亚种。
临床常用具有抗肿瘤作用的海洋药物简述
氯化钠、 磷酸钙和镁盐等。 此外， 经吕昌龙等〔研 8」
究表明， 乌贼墨也具有明显的抗肿瘤作用， 其高效 抗癌活性成分为一种比较复杂的蛋白 一 多糖复合 体。 刘成玉等[9]采用红细胞 C3 b受体花环试验和肿 瘤红细胞花环试验， 检测了乌贼墨对正常人和肿 瘤病人红细胞 C36受体活性及红细胞免疫勃附肿 瘤细胞能力的影响， 提示乌贼墨的抗肿瘤作用与 其激活红细胞的免疫豁附功能有关。 11 珍珠母
药物与临床 2003 年第 18 卷第 5 ,6 期合刊
If 床 常用具有抗肿瘤作用的海洋药物简述 M
张玉萌 赵夕秋
解放军总医院药材处中药房， 北京
100853
海洋药物是我国传统医学的重要组成部分， 我国第一部药学专著《 本草纲目 中收载中药1892 》 种， 其中海洋药物就有近100种， 随着现代科学技 术在药物研究中的应用， 我国海洋药物越来越受
9. 刘成玉、 腾青、 周绪祥等. 乌贼墨对红细胞免疫粘附肿瘤
细胞能力的影响 中国 海洋药物 ， 1996, (3) : 14.
部肿瘤的治疗。 其碳酸钙含量高达80% 一 90% 以
上， 角蛋白中含有20多种氨基酸和多种微量元素。
12 海龙
为海龙科动物刁海龙 Solengnathus hardwickii
(Gray) 、拟 海 龙
Syngnathoides biaculeatus
为海龙科动物克氏 海马Hippocampus kelloggi
(Rich. )小黄鱼P. polyactis B leeker 或鲜科动物
中华鳄Acipenser sinensis Gray, 蝗鱼Husodauricus Georgi 等的鱼缥。 味甘， 性平， 人肾经。 可补肾益
海洋微生物抗肿瘤活性物质研究进展
１１０１４的发酵产物分离得到２５个化合物，包 括４个五元环内酯类化合物，８个酚类衍生 物和１３个环二肽，采用ＳＲＢ法测定了１３个 环二肽的体外抗肿瘤活性，其中环二肽１０在 ５ ｍｇ·Ｌ＿１时有较强的体外抗肿瘤活性，１， ３，４，８，９，１２具有弱的体外抗肿瘤活性，同时 发现这些环二肽的体外抗肿瘤作用在５～ １００ ｍｇ·Ｌ＿１范围内不具有浓度依赖性，其 它化合物未表现出体外抗肿瘤活性，朱天骄 等［２６３从一株海洋放线菌￥１００１的活性部位 分离鉴定了１个异黄酮类化合物，１个苯甲 酸类衍生物，以及６个环二肽类化合物，并经 活性测试阐明了环二肽类化合物为该菌株的 主要活性相关成分。文献报道也显示环二肽 类化合物可作为免疫功能调节剂和抗肿瘤制 剂，并且体内体外试验证明均有效。测定了 化合物１～８对人白血病细胞Ｋ５６２的抑制 活性，结果表明环二肽类化合物４，５和７在 １０ ｔ比ｍｏｌ·Ｌ叫时即能表现出细胞坏死活性， 抑制率分别为１５．４％，１９．３％和１８．６％，其 他化合物在１００ ｇｍｏｌ·Ｌ＿１高浓度时也未检 测到相关活性。江红等口７］在筛选新免疫抑
摘 要：概述２０００年以来海洋微生物抗肿瘤活性物质的研究进展，着重介绍海洋细菌、海洋放线茵及海洋 真茵抗肿瘤活性物质取得的成果，并展望该领域研究的广阔应用前景。 关键词：海洋微生物；抗肿瘤活性物质｝海洋细茵Ｉ海洋放线茵；海洋真茵 中图分类号：Ｒ９３１．７７，Ｒ９７９．１文献标识码：Ａ文章编号：１００２—３４６１（２００８）０３—００５１—０６
海洋生物源天然产物的药理活性筛选
海洋生物源天然产物的药理活性筛选海洋生物是地球上最为丰富多样的生物资源之一，拥有极高的生物多样性和独特的适应性，其中许多植物、动物和微生物生物因产生了丰富多样的天然产物而备受研究者关注。
这些海洋生物源天然产物具有潜在的药理活性，具备开发成新药的前景。
本文将介绍海洋生物源天然产物的药理活性筛选方法及其意义。
一、海洋生物源天然产物筛选方法1. 采集海洋生物样品：海洋生物源天然产物的筛选首先需要采集具备潜在药理活性的生物样品。
这些样品可以是海洋动植物的组织、细胞、体液或微生物的培养物等。
采集过程需要遵循保护海洋生物资源的原则，并确保样品的纯度和质量。
2. 提取和分离：从海洋生物样品中提取天然产物是药理活性筛选的基础步骤。
提取可以利用物理方法（如研磨、超声波等）或化学方法（如溶剂提取、萃取等）进行。
分离则是通过多种色谱技术（如柱层析、高效液相色谱等）和电泳技术（如凝胶电泳、毛细管电泳等）实现，以获得单一纯度的化合物。
3. 结构鉴定：提取和分离得到的单一化合物需要进行结构鉴定。
利用一系列分析技术，如核磁共振、质谱、红外光谱等，确定化合物的分子结构和功能基团。
这一步骤有助于后续药理活性筛选的解释和理解。
4. 药理活性筛选：得到化合物之后，需要进行药理活性筛选。
药理活性筛选包括体外实验和体内实验两个层面。
在体外实验中，常用的筛选方法包括抗氧化活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、抗菌活性等。
而在体内实验中，常用的筛选方法包括小鼠模型、大鼠模型和小鼠移植瘤模型等。
二、海洋生物源天然产物药理活性筛选的意义1. 探索新药来源：海洋生物源天然产物具有丰富的化学结构和多样的药理活性，对于医学和药物研究而言具有重要意义。
通过药理活性筛选，有可能发现潜在的新药分子，拓展药物创新领域。
2. 提高药物研发效率：海洋生物源天然产物经过药理活性筛选后，有望提供备选的候选药物分子。
这有助于缩短新药研发周期，提高药物研发效率。
3. 解决重要疾病问题：海洋生物源天然产物具有广泛的药理活性，可应用于多种疾病的治疗。
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第21卷 第1期台 湾 海 峡 Vol.21, No.1 2002年2月J OU RNAL O F OC EANO GRA P H Y IN TAI WAN S TRAI T Feb.,2002具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选Ξ李 根1,陈瑞川2,林 昱1(1.国家海洋局第三海洋研究所海洋生物工程重点实验室,福建厦门 361005;2.厦门大学抗癌中心,福建厦门 361005)摘要:本研究采用M TT法对海洋放线菌、细菌、霉菌及极地和大洋细菌进行细胞毒活性物质的筛选,结果有10%放线菌及一株极地细菌具有细胞毒活性.此外利用DNA修复特性在 E.coli343/591和 E.coli343/636之间的差异性,对前面筛得的菌株进行DNA损伤的筛选,结果得到两株活性菌株.采用荧光染色观察得到3株具有诱导肿瘤细胞凋亡的菌株,这些具抗肿瘤活性的菌株可供进一步研究.关键词:M TT分析法;DDR T法;细胞毒活性物质;细胞凋亡中图分类号:Q7 文献标识码:A 文章编号:100028160(2002)0120018205近年来,国内外在海洋生物抗肿瘤活性物质筛选和研究上已取得了初步的成果.NCI每年筛选的3万个新的抗肿瘤化合物中,约有5%来自海洋生物;业已证实,约10%的海洋动物提取物有抗P388白血病细胞及K B细胞活性,3.5%的海洋植物提取物有抗肿瘤活性或细胞毒活性[1].这些化合物绝大多数具有独特的化学结构和明显的抗癌、抗病毒作用,主要包括生物碱、多肽及蛋白质、萜类、大环内酯类、多糖类、脂类等,其作用机理亦呈多样性,有以影响DNA、RNA、蛋白质为主的,也有以干扰有丝分裂或诱导细胞内信息分子的改变为主的,通常这些活性物质作用浓度甚微,而且毒副作用较低[2].目前,国内外寻找海洋药物的研究对象主要是海藻和海洋动物,据报道,到目前为止已成功地分离到5000多种具有生物活性的海洋天然产物,但由于其含量低,生物量有限,分离提取的生产成本较高,使得许多研究成果的应用推广受到限制.因此,人们把注意力转向海洋微生物的培养与发酵技术以及其代谢产物的研究上.由于海洋微生物所处的海洋环境是十分独特的,海洋微生物是产生新的生物活性物质极好来源之一.同时海洋微生物的特点是繁殖快、易培养等,可以结合现代发酵工程技术,使之工业化生产,降低海洋药物的生产成本[3].本文以M TT法、DDR T法及荧光染色法对从极地、大洋、近海大量分离得到的放线菌、细菌和霉菌进行抗肿瘤活性物质的筛选.1 材料与方法1.1 细胞株及试验菌株Ξ收稿日期:2001210217基金项目:由科技部基础性工作项目《海洋药源生物种质资源和基因库的构建》和国家海洋局海洋生物工程重点实验室研究课题资助(No HY9903)作者简介:李根(1978～),男,在读硕士研究生.细胞株 人胃癌细胞M GC 8023,由厦门大学抗癌中心提供.试验菌株 343/591为赖氨酸和生物素营养缺陷型并具有发酵乳糖能力和DNA 修复缺陷的uvrB/recA 菌种343/636为不能发酵乳糖的脯氨酸营养缺陷型菌株并具有紫外线损伤和DNA 修复能力,购自上海医药工业研究院.1.2 待筛菌株363株海洋放线菌,70株极地及大洋细菌,234株海洋细菌及26株霉菌,均由本实验室分离保存.1.3 细胞培养人胃癌细胞M GC 8023于含10%小牛血清、100U/cm 3青霉素、100μg/cm 3链霉素及50μg/cm 3卡那霉素的RPM I 1640培养液中,在37℃,5%CO 2及饱和湿度环境下培养、传代.1.4 菌株发酵及发酵液的预处理菌株接种于发酵培养基,经2d 活化后,补加培养基,28℃摇床培养至对数生长期后期(细菌3d 、放线菌约5d ).发酵结束后,将发酵液转移至10cm 3的管子中,超声波破碎2min ,104r/min 离心10min ,小心吸出上清液.上清液用0.22μm 的微孔滤膜过滤除菌,分装于小管中,于-20℃冻存,使用时以RPM I 1640培养液作适当稀释.1.5 M TT 分析法根据文献[4]作适当修改,步骤如下:细胞培养至90%铺底(处于对数生长期),用胰酶消化液(0.25%胰酶/D 2Hank ’s 液)消化收集细胞,吹打制成单细胞悬液,苔芬蓝染色计算活细胞数,接种细胞于96孔板中,每孔加200mm 3悬浮细胞液,在37℃CO 2培养箱培养过夜.第二天加入各稀释度的菌株发酵液20mm 3,继续培养3d ,倒去培养液,PBS 洗1遍,加入M TT (0.2mg/cm 3)100mm 3,在37℃培养4h ,然后去除M TT ,加DMSO 与甘氨酸NaOH 缓冲液(9∶1)200mm 3,摇床摇0.5～1h ,酶标仪测定570nm 吸光值.其中四孔做全培液空白对照,四孔做细胞悬浮液对照,每样平行测试3孔,以阿霉素为标准参照.抑制率计算式为:抑制率=100%×(OD 对照-OD 实验)/OD 对照发酵液活性以ID 50衡量,ID 50为抑制率为50%时,发酵液所稀释的倍数;抗癌药物的活性以IC 50衡量,IC 50为抑制率为50%时,样品的浓度.1.6 DDRT 法(diff e re n t DNA re p air t e s t )根据文献[5]作如下修改:343/636和343/591菌株(通常一个菌落)分别接种于含5cm 3蛋白胨-肉汤培养基中,在37℃振荡培养16h ,用分光光度计测450nm 处的343/591和343/636的OD 值,用蛋白胨-肉汤培养基稀释343/636菌液使其OD 值与343/591相同,在100cm 3中性红琼脂培养基中加入1cm 3菌液后倒入平皿中静置1h ,将所要测定的放线菌发酵液和受试物滴加在覆盖于琼脂培养基上直径为8mm 的滤纸片上,37℃培养24h ,以丝裂霉素为标准药物对照,根据发酵液产生的抑菌圈大小的差异来判定其对DNA 造成损伤的大小及是否有抗肿瘤活性.1.7 荧光显微镜观察细胞凋亡根据文献[6]作适当修改,步骤如下:M GC 8023细胞按2cm 3/瓶接种于10cm 3细胞培养瓶中,37℃过夜,每瓶加10mm 3菌株发・91・ 1期 李 根等:具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选 酵液,对照组仅加同量培养液,37℃继续培养1～2d 后,收集细胞,细胞涂片,以细胞固定液[甲醇∶冰乙酸(3∶1),现配]4℃固定5min ,蒸馏水稍洗后,滴加Hoechst 233258染色液(5μg/cm 3Hoechst 233258)染色10min.蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体,吹干.封片剂(封片液:20mmol/dm 3柠檬酸,50mmol/dm 3磷酸二氢钠,50%甘油,p H5.5)封片后荧光显微镜观察.2 实验结果与分析2.1 M TT 分析法本文采用M GC 8023细胞,以M TT 分析法为筛选模型,对363株海洋放线菌,70株极地及大洋细菌,234株细菌和26株霉菌的发酵液进行细胞毒活性筛选.初筛以550倍的稀释度为标准,当其ID 50大于550的时候,再进行复筛,以确定菌株发酵液的ID 50.筛选结果(表1)表明,约有10%的海洋放线菌及一株极地细菌ID 50大于或等于550,其中最大ID 50可达22000.表1 具有细胞毒物质的海洋微生物筛选结果Tab.1 Screening result of marine microorganism having cell toxicity样 号ID 50样 号ID 50S 2511650S 2350600S 2521650S 2351550S 2601100S 2357650S 2621320S 2363550S 264660S 2385550S 2651650S 23901650S 2731650S 2431550S 2921650S 2448600S 295880S 2459600S 2153550S 2467550S 21761650S 2468550S 2182550S 247715000S 2183880S 2478780S 21963300S 2492770S 2233550S 2494700S 22361650S 2502550L 243000S 25055500L 214550S 251322000J 27550S 2515680 注:其中作为标准药物的阿霉素的IC 50在0.025～0.03μg/cm 3之间.2.2 DDRT 法利用DDR T 法对M TT 粗筛得到的38株放线菌和细菌进行DNA 损伤的检测,结果得到A 2132、A 2442两株放线菌对DNA 产生损伤,其在343/591和343/636平板上的实验结果(表2)如下:表2 放线菌和丝裂霉素对照对两个菌株的抑菌活性比较Tab.2 Bacteriostastic activity of actinomycetes and mitomycin towards two strains受试物343/591抑菌圈直径(mm )343/636抑菌圈直径(mm )S 218213-S 249213-丝裂霉素0.5μg 23-2.3 荧光染色显微镜观察・02・ 台 湾 海 峡 21卷经S 2176、S 295和L 243株放线菌发酵液(终稀释度均为1∶200)处理后,荧光染色显微镜下观察,M GC 803细胞核内可见浓染致密的颗粒或块状蓝色荧光,荧光亮度明显增强,染色质多集中于结构完整的核膜边缘,形成环状、新月状、僧帽状的浓染带,部分细胞的核固缩、碎裂,成为细小的碎片.而对照组M GC 803细胞的细胞核呈均匀弥散荧光,核的大小、形态一致.表明上述3个菌株可产生具有诱导肿瘤细胞凋亡的活性物质.3 讨论3.1 M TT 分析法M TT 法是一种检测细胞生存和增殖状态的方法,该方法以其简单、快速、准确等优点被用于细胞毒和淋巴因子生长抑制的定量检测,尤其在肿瘤化疗药敏实验中广泛使用.其原理是M TT 可被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为蓝色的甲 化合物,再经适当溶剂溶解后,其吸光度与活细胞数相关,从而可作为检测活细胞数的指标.因此M TT 法可用于细胞毒活性物质的筛选.3.2 DDRT 法DDR T 法是一种利用两个菌株对DNA 损伤修复的差异性建立的方法,可以用来检测试物的DNA 毒性.343/591为DNA 修复缺陷菌株,而343/636菌株具有紫外线损伤和DNA 修复能力,因而通过两个菌株的修复能力不同可以检测出受试物的DNA 毒性.从抗肿瘤药物的作用机理来看,多数抗肿瘤药物的作用机制主要是作用于DNA ,因而DDR T 法可用于筛选得到作用于DNA 的抗肿瘤活性菌株.3.3 荧光染色显微镜观察细胞凋亡是一种不同于坏死的死亡形式,其特点之一是细胞在凋亡过程中细胞核内的染色质通常会发生凝聚作用,形成块状、致密的染色质.因此,加入荧光染料Hoechst 33258后,凋亡细胞由于膜通透性的改变.可摄取Hoechst 染料,后者与DNA 结合,在紫外光下呈浓度致密的颗粒块状蓝色荧光.正常细胞也可摄取少量Hoest 荧光染料,而坏死细胞则不能摄取,故在荧光显微镜下,可观察到正常细胞的细胞核呈弥散均匀蓝色荧光.4 小结通过以上几种方法的筛选,我们得到了两株通过对肿瘤细胞的DNA 产生损伤从而抑制肿瘤细胞生长繁殖的菌株及3株对肿瘤细胞具有诱导凋亡作用的菌株,可以提供作为进一步的分离研究.我们对海洋放线菌抗肿瘤活性物质的筛选和初步研究表明,海洋放线菌中蕴藏着丰富的抗肿瘤活性物质,进一步的筛选和研究有望从中筛选出独特结构及作用机理的抗肿瘤活性物质.参考文献:[1] 廖辉南,戴建凉.海洋生物抗肿瘤活性物质的研究进展[J ].生物工程进展.1995,15(1):8～14.[2] Faye F.Chemical p rosp ect ors scour t he seas f or p romising drugs [J ].S cie nc e ,1994,266:1324.[3] Attaway D H ,Zaborsky O R.Marine bio t e c hnology.Vol I.Pharmac e u t ic al and bioac t ive na t uralp roduc t s [M ].Plenum Press ,1993,419～458.[4] Mosmann F.Rapid colorimet ric assay f or cellular growt h and surival :application t o p rolif eration and・12・ 1期 李 根等:具抗肿瘤活性的海洋微生物菌株的初步筛选 cyt ot oxicity assay[J ].J Immunol Me t hods ,1983,65:55～63.[5] 许文思,彭剑,王吉成,等.一种新的快速简便的抗肿瘤药物筛选模型[J ].中国抗生素杂志,2001,28(1):15～18.[6] Darzynkiewicz Z ,L i X ,Gong J P.Assays of cell viability :discrimination of cells dying by ap op t osis[J ].Me t hods in Cell Biology ,1994,41:15～38.The s c re e ni ng of a n t i t umor a c t i ve ma t e rialf rom mari ne mi c roorga nis mL I G en 1,Chen Rui 2chuang 2,L IN Yu 1(1.The Key L aborat ory of Marine Biotech ,SOA/Third Institute of Oceanograp hy ,SOA ,Xiamen 361005,China ;2.The Cancer Research Center ,Xiamen U niversit y ,Xiamen 361005,China )A bs t ra c t :A screening model of M TT was used to identify antitumor active material from ma 2rine actinomycetes ,bacterials ,molds and extreme bacterials.The results showed about 10per 2cents of actinomycetes and one polar bacterial strain have cell toxicity.Further more ,according to the DNA repair test vitality different between E.coli 343/591and E.coli 343/636,two positive strains were identified.By fluorescence dyeing ,we observed that three strains had the ability to induce cell apoptosis.These strains can be further researched for antitumor drug study.Ke y w ords :M TT assay ;DDR T assay ;cell toxicity agents ;cell apoptosis・22・ 台 湾 海 峡 21卷。