抗补体活性测定法
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RBC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
血清最后稀释度 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 1∶32 1∶64 1∶128 1∶256 1∶512 1∶1024
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
病人血清(ml)
0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃 0.2
血清稀释度
量的变化可为某些变态反应性疾病与补体缺陷 病的诊断与预后提供依据。
实验报告要求
补体结合实验 原理、结果观察、结论
CH50法 原理、材料、方法、结果、讨论
血清总补体活性测定 (CH50法)
掌握50%补体溶血试验的原理、方 法、结果判定及临床意义。熟悉 血清补体含量的计算。
CH50法原理
绵羊红细胞与溶血素，在新鲜血清中补体的 作用下，绵羊红细胞可被溶解，产生溶血现 象。
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
中药抗补体活性研究进展
中药抗补体活性研究进展中药抗补体活性的评价方法有多种，目前常见的方法是C3/C4结合酶免疫吸附分析法和酶促免疫吸附分析法等。
这些方法可以在体外评价中药对补体活性的影响，为后续的体内研究提供重要的参考。
当前，中药抗补体活性的研究主要集中在以下几个方面：1. 中药对补体活化途径的调节补体系统的激活途径有三种，分别是经典途径、替代途径和Mannan结合途径。
中药可以通过调节不同途径的激活来影响补体的功能。
例如，黄芪、人参、丹参等中药可以减弱经典途径的激活，抑制C1激活酶的活性；夏枯草、银屑病等中药可以影响替代途径的激活，抑制C3分裂酶的活性；紫花地丁、连翘等中药可以影响Mannan结合途径的激活，影响Mannan结合蛋白（MBL）的结合能力。
2. 中药对补体所致炎症的调控过度的补体激活会引发多种炎症反应，因此抑制补体活性可以降低炎症反应的强度和程度。
中药可以通过调节多种炎症因子的表达来发挥抗炎作用。
例如，芍药、黄芩等中药可以抑制IL-1、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达，从而减轻补体所致的炎症反应。
3. 中药对补体相关疾病的治疗补体活性的异常与多种疾病的发生和发展相关。
近年来，越来越多的研究关注中药在补体相关疾病的治疗中的作用。
例如，薏苡仁、佛手、山药等中药对于抑制肾炎和肝炎病毒感染有一定的作用；桃仁、红花等中药对于缓解自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等也有一定的疗效。
综上所述，中药对补体活性的调节具有广泛的应用前景。
但目前的研究主要集中在体外实验和动物实验，临床应用还需要进一步验证。
此外，不同中药的抗补体活性也存在一定的差异和局限性，因此，需要进一步探磨发现新的中药活性成分和分子机制，为中药抗补体活性的应用提供更加可靠的理论和技术支持。
抗补体活性测定法
附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。
（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。
用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。
（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。
根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。
放冷后置4℃冰箱保存备用。
（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。
（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。
豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。
5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。
取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。
V f = V i×A————0.62式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；A为稀释前红细胞溶解液吸光度；V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。
中药抗补体活性研究进展
中药抗补体活性研究进展近年来，抗补体活性研究在中医药领域备受关注，越来越多的研究表明中药对抗补体活性具有显著的效果。
补体系统是机体天然免疫系统中重要的组成部分，对于维持机体内稳态和对抗病原微生物起着重要的作用。
当补体系统活性过高或异常时，会导致一系列炎症和自身免疫性疾病的发生，因此研究抗补体活性成为了一项重要的课题。
中药作为我国特有的传统药物资源，其抗补体活性研究在近年来得到了广泛的关注和深入的探讨。
本文将从中药对抗补体活性的研究进展进行综述，旨在为中药抗补体活性的研究提供参考和借鉴。
一、中药对抗补体活性的药理作用机制中药通过多种途径对抗补体活性，其药理作用机制主要包括以下几个方面：1. 抑制补体系统激活：一些中药具有直接或间接抑制补体系统激活的作用，如黄芩中的黄芩素具有明显的抑制C3、C5等补体活性物质的生成，从而抑制了炎症反应的发生。
2. 调节免疫功能：部分中药能够调节细胞因子的平衡，如甘草中的甘草酸具有调节Th1/Th2细胞因子平衡的作用，从而影响了补体系统的激活和免疫功能的调节。
3. 抗氧化应激：氧化应激是导致补体系统活化的重要原因之一，一些中药具有显著的抗氧化应激作用，如红枣中的多酚类成分能够清除自由基，减少氧化应激的损伤，从而抑制了补体系统的异常活化。
1. 黄芩2. 甘草3. 红枣随着对中药抗补体活性的研究不断深入，中药在抗炎和免疫调节方面的临床应用前景日益广阔。
中医药在治疗自身免疫性疾病、炎症性疾病等方面具有独特优势，其与现代药物的联合应用将成为未来的研究热点。
中药对抗补体活性的研究进展为中医药的临床应用提供了新的思路和方法，中医药与现代药物的结合将有望为我国传统药物资源的开发利用带来全新的发展机遇。
希望我们的中药抗补体活性研究能够为中医药的临床应用提供更多的有效药物和治疗方法，为维护人类健康作出更大的贡献。
免疫检验考试辅导：循环免疫复合物补体相关测定法
IgG和IgM类抗体与抗原结合后，重链CH2区的补体结合点暴露，可以固定C1q并激活补体的系列反应，这是利用补体有关技术检测免疫复合物的基础。
1.C1q结合试验：将待检血清先行加热56℃30min，以灭活其中的补体和破坏已与CIC结合的C1q，空出补体结合点。
CIC与C1q的结合可用多种方法进行检测，常用的有以下3种。
（1）液相法：先将同位素标记的C1q与灭活过的血清标本混合作用，再加入0.5%（终浓度）的PEG将结合了C1q的CIC沉淀下来，通过检测沉淀物中的放射活性来计算CIC的含量。
（2）固相法：先将C1q吸附于固相载体表面，加入待检血清使CIC与C1q结合，再加入同位标记的或酶标记的抗人IgG或SPA，最后检测其放射活性或酶活性。
（3）C1q偏离试验：先将同位素标记的C1q与灭活的血清标本混合，再加抗体致敏的绵羊红细胞，温育后离心，检测红细胞上的放射活性。
红细胞的放射活性与免疫复合物的量呈负相关。
2.补体试验本法的原理类似补体结合试验。
将一定量的补体（多为混合豚鼠血清）与灭活的待检血清混合温育，反应后加入致敏绵羊红细胞。
如出现溶血表示血清中没有CIC存在；不溶血说明标本中有CIC存在医`学教育网搜集整理。
将血清标本做不同稀释，并与已知的热聚合IgG作对照，可以计算出CIC的含量。
本方法的灵敏度较高，且易于在一般实验室开展，不足之处是特异性较差。
3.胶固素结合试验胶固素（conglutinin）是牛血清中的一种正常蛋白，能与C3d特异性结合；体内与补体结合的CIC都带有C3d，因此胶固素可与CIC结合。
用一定量的胶固素包被塑料管，往管中加入稀释的血清标本，温育后再加入同位素标记或酶标记的抗人IgG抗体，最后检测各管的放射活性或酶活性，计算CIC的含量。
补体含量测定实验报告
1. 学习补体活性测定的原理和方法。
2. 掌握补体活性的定量分析方法。
3. 了解补体含量在临床医学中的应用。
二、实验原理补体（Complement）是一组存在于人体血浆中的蛋白质，具有增强免疫应答、清除病原体等作用。
补体活性测定是评估机体免疫功能的重要指标之一。
本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
三、实验材料1. 试剂：溶血素、补体标准品、生理盐水、蒸馏水、抗人球蛋白抗体、酶标仪、微量移液器、比色皿等。
2. 仪器：离心机、恒温水浴箱、显微镜、离心管等。
四、实验方法1. 标准曲线的制备（1）将补体标准品稀释成不同浓度（如1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等）。
（2）将各浓度补体标准品与等量溶血素混合，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（3）加入等量抗人球蛋白抗体，混匀，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（4）加入生理盐水，终止反应。
（5）在酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。
（6）以OD值为纵坐标，补体浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品检测（1）取一定量待测样品，按上述步骤进行稀释。
（2）重复上述步骤，检测样品的OD值。
（3）根据标准曲线，计算样品中补体的含量。
1. 标准曲线制备：根据实验数据绘制标准曲线，如图1所示。
图1 补体标准曲线2. 样品检测：根据标准曲线计算样品中补体的含量，结果如下表所示。
表1 样品补体含量检测结果样品编号补体含量（U/ml）1 32.52 27.03 24.54 20.05 16.5六、实验讨论1. 本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
2. 实验结果显示，样品中补体含量在16.5～32.5 U/ml之间，说明样品具有一定的补体活性。
3. 补体含量测定在临床医学中具有重要意义，如评估机体免疫功能、诊断某些疾病等。
七、实验总结1. 本实验成功制备了补体标准曲线，为后续样品检测提供了依据。
降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察
降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察常娅莉,张艳荣,赵宜为,李振平,刘 燕,崔红宇兰州生物制品研究所,兰州 730046)摘 要:采用CH50试验法测定静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)抗补体活性(ACA),在中性p H条件下,比较了不同的Na+含量及不同种类的糖对ACA测定结果的影响。
结果表明,NaC1含量由0.2%上升至1.0%时,AC A呈逐渐下降趋势;用5%葡萄糖作稳定剂时ACA最低。
IVIG在37 条件下放置一月后,AC A有明显下降趋势。
在半成品配制过程中,p H及各种成份的加入顺序对ACA也有一定影响。
关键词:静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG);抗补体活性(ACA);稳定剂中图分类号:R392.11 文献标识码:A 文章编号:1005-5673(2003)03-0037-03Study and observation on reducing ACA of human immunoglobulin for intravenous injection C HANG Ya-li,Z HANG Yan-ron g,Z HAO Yi-wei,et al. (Lan z hou Institute o f Biological products,Lanzhou730046,China)Abstract:The ACA of human immunoglobulin for intravenous injection was determined by C H50test.The effect of different Na+ contents and sugars were studied to ACA determination.The resul ts showed that ACA was reduced if the Na+content increased from0.2%to1.0%;the ACA of IVIG i s lowest when the5%glucose is used as stabilizer,and the AC A were reduced when IVIG is stored at37 for one month.During preparation of final bulk,the order of adding stabilizers also effects the result of AC A de-termination.Key words:Hu man im munoglobulin for intravenous injection(IVIG);Anticomplement Acti ve(ACA);Stabilizer静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)是具有多种抗体活性的血液制品,因具有广泛的应用价值而受到临床重视。
抗补体活性测定法
5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。
我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。
”6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。
”7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。
8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。
9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。
附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。
（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。
用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。
（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。
根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。
放冷后置4℃冰箱保存备用。
（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。
（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。
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附录ⅨK抗补体活性测定法
本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。
（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。
用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。
（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。
根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。
放冷后置4℃冰箱保存备用。
（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。
（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。
豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。
5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。
取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。
V f = V i×A
————
0.62
式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；
A为稀释前红细胞溶解液吸光度；
V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。
溶血素滴定按表1稀释溶血素。
从1∶75稀释的溶血素开始，1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合，37℃放置30分钟后，取0.2ml，加明胶巴比妥缓冲液1.10ml，稀释的豚鼠补体溶液（如150倍稀释补体）0.2ml，37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）于波长541nm处测定各管吸光度。
每个稀释度做2管。
同时再做3管未溶血对照管（明胶巴比妥缓冲液1.4ml，加5%羊红细胞悬液0.1ml），3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞0.1ml)，同法操作。
按下式计算各管溶血率（Y），以Y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。
选择增加溶血素的量也不影响Y值的溶血素的稀释度，为每1ml含1个最小溶血单位（即每1ml含1MHU）。
最大溶血率应在
50%～70%范围，否则试验不成立。
Y =各管吸光度-未溶血对照管吸光度
______________________________ ×100%
全溶血管吸光度-未溶血对照管吸光度
最适敏化的羊红细胞（EA）的制备量取每1ml含2MHU的溶血素（A）适量，缓慢注入等体积的5%羊红细胞（E）悬液中，37℃放置15分钟后，2～8℃保存，6小时内使用。
滴定豚鼠血清中补体活性用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清，然后按表2滴定补体。
以补体用量的对数对Y/（1－Y）的对数作直线回归，从而求出直线回归方程的截距（a）、斜率（b）和相关系数（r），补体活性按下式计算
补体活性（CH50/ml）=(1/X)×(补体稀释倍数/5)
式中1/X为a值反对数的倒数。
抗补体活性测定根据测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释成每1ml 含100CH50溶液，按表3制备培养混合物。
表3中静注人免疫球蛋白(IVIG)是按每1ml含50mg浓度计算的。
如果IVIG的浓度不是每
1ml含50mg时，则按下式计算IVIG的加量(V)。
然后再根据IVIG的实际取量计算明胶巴比妥缓冲液的加量，但要保持供试品加缓冲液的总量为0.8ml。
将此混合物在37℃放置60分钟后，取0.2ml加9.8ml明胶巴比妥缓冲液(50倍稀释)，测定剩余补体活性。
V(ml)= 10mg
________________________________
供试品每1ml中IgG含量（mg）
表3供试品及补体对照管制备
供试品管/ml 补体对照管/ml
供试品(50mg/ml) 0.2 —
明胶巴比妥缓冲液0.6 0.8
补体(100CH50/ml) 0.2 0.2
按下式计算供试品抗补体活性。
D为每1ml含80 ～120 CH50时，试验成立。
供试品抗补体活性（%）= D-G
_____ ×１００％
D
式中D为补体对照管剩余补体活性，CH50/ml；
G为供试品管剩余补体活性，CH50/ml。
【附注】（1）洗红细胞时，务必将白细胞弃掉。
（2）敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。
（3）仅允许使用澄清明胶溶液。