人源性单克隆抗体和基因工程抗体
人源化单克隆抗体研究进展
人源化单克隆抗体研究进展人源化单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的生物药物，通过杂交瘤技术将鼠源单克隆抗体的可变区与人类抗体的恒定区进行交换，以减少免疫原性，提高治疗效果。
近年来，随着科技的不断进步，人源化单克隆抗体研究取得了显著的进展，为肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等治疗领域提供了新的思路和方法。
研究现状：人源化单克隆抗体方法、成果与不足人源化单克隆抗体研究主要包括抗体库的建立、抗体筛选和优化、以及抗体生产等多个环节。
目前，研究人员已成功建立了多种人源化单克隆抗体，并应用于临床试验，取得了一定的疗效。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物能够特异性地识别肿瘤细胞，并通过激活免疫反应来杀死肿瘤细胞。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
研究方法：人源化单克隆抗体研究实验设计与数据分析人源化单克隆抗体研究的实验设计主要包括建立人源化抗体库、筛选和优化抗体，以及进行药效和毒理试验等。
在实验过程中，需要采集和处理大量的实验数据，并进行深入的统计分析和比对，以获得抗体的最佳配对组合和最佳治疗剂量等参数。
成果和不足：人源化单克隆抗体研究的成果与不足人源化单克隆抗体研究在肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等多个治疗领域取得了显著的成果。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物已经成功应用于临床试验，并显示出较好的疗效和安全性。
在自身免疫性疾病和神经系统疾病治疗领域的人源化单克隆抗体药物也在研发和试验阶段。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
同时，抗体药物的生产成本较高，限制了其在临床上的广泛应用。
尽管人源化单克隆抗体研究取得了一定的成果，但仍存在许多问题需要进一步解决。
未来，研究人员需要进一步探索人源化单克隆抗体的作用机制和优化方法，以获得更高效、安全、低成本的药物。
同时，需要加强抗体药物的工艺研究，提高生产效率和降低生产成本。
基因工程抗体名词解释
基因工程抗体名词解释基因工程抗体是利用基因工程技术对人工合成抗体进行定制和改造的一种生物工程技术。
抗体是一种由免疫系统产生的蛋白质，它可以识别和结合体内外的异物，从而协助机体进行免疫防御。
基因工程抗体通过选择性克隆和定制抗体基因序列，可以产生特异性更强、稳定性更好、生产成本更低的抗体。
基因工程抗体包括以下几种：1. 单克隆抗体（Monoclonal Antibodies）：基因工程技术可以使得单个淋巴细胞克隆产生大量相同的抗体，从而获得具有高度特异性的单克隆抗体。
这种抗体广泛应用于医学诊断、疾病治疗和科学研究等领域。
2. 重链抗体（Recombinant Antibodies）：重链抗体是利用基因工程技术使抗体重链蛋白的编码基因与其他蛋白的编码基因相融合，生成融合抗体。
这种重链抗体可以通过改变其结构和功能来提高其生物活性和稳定性。
3. 组合抗体（Bispecific Antibodies）：基因工程技术可以将两种不同的单克隆抗体的编码基因进行融合，产生具有双特异性的组合抗体。
这种抗体可以同时结合两个不同的目标分子，从而实现更强的疗效和更多样化的应用。
4. 人源化抗体（Humanized Antibodies）：由于小鼠源抗体和人类抗体在体内效价和安全性方面存在差异，基因工程技术可以通过改造抗体的基因序列，使得抗体具有更接近人类抗体的结构和功能。
这种人源化抗体更适合在治疗和预防疾病时使用。
基因工程抗体的应用广泛，其中的一些常见应用包括：1. 肿瘤治疗：通过基因工程技术，可以定制针对特定肿瘤抗原的单克隆抗体，用于治疗癌症。
2. 自身免疫性疾病治疗：基因工程抗体可以定制具有特异性和高效的抗体，用于治疗自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等。
3. 传染病治疗：通过基因工程技术，可以改造抗体的结构和功能，用于治疗传染病，如艾滋病、流感和乙肝等。
4. 分子诊断：基因工程抗体可以用于检测和诊断疾病，如癌症标志物的检测和感染性病原体的检测等。
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则
人用单克隆抗体质量控制技术指导原则本要点适用于供治疗的体内诊断用的利用杂交瘤技术制备的单克隆抗体,适用于在人体内应用的利用重复DNA技术制备的基因工程抗体一、杂交瘤技术制备的单克隆抗体一杂交瘤细胞1．亲本细胞1骨髓瘤细胞SP2/0或其他适宜的骨髓瘤细胞系;应为不合成或不分泌免疫球蛋白链型,具有符合骨髓瘤细胞的染色体特征,并有明确的来源历史及符合要求的保存条件;2免疫亲代细胞经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞或外周血B淋巴细胞;应有明确的免疫原来源、性质及动物种系,免疫原详细的制备过程;适宜的免疫方案及免疫淋巴细胞制备的方法;2．细胞融合与克隆化采用适宜的方法进行融合、筛选及克隆化;3．杂交瘤细胞检定1抗体分泌稳定性连续克隆化后抗体阳性率达100%,经体外连续传代3个月以上和反复冻存、复苏,细胞系能保持稳定分泌特异性抗体;2细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体,应符合杂交瘤细胞特征;4．鼠源病毒检查按附录要求检测鼠源病毒;5．支原体检查按现行中国药典生物制品无菌试验规程进行;6．无菌试验按现行中国药典生物制品无菌试验规程进行;二单克隆抗体的检定1．免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法或其他适宜的方法测定;2．亲和力用可靠、准确的方法测定单克隆抗体以下简称为单抗的亲和常数或相对亲和力;一般情况下,对于免疫原为可溶性的单抗,测其亲和常数,对于免疫原为颗粒性抗原的单抗,测其相对亲和力;3．特异性测定单抗对靶抗原的特异性；对多株单抗识别的抗原决定簇进行相关性分析; 4．交叉反应按附录要求;免疫组织化学法测定单抗与人体组织交叉反应,用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定;来源于肿瘤相关抗原的单抗应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验; 5．效价测定用适宜方法测定;三其他原材料1．细胞培养用小牛血清支原体检测应为阴性;经小量试验适于杂交瘤细胞生长;2．培养液应有培养液来源,质量指标;3．化学试剂规格应达到分析纯以上;二、基因工程抗体参考人用重组DNA制品质量控制技术指导原则和本指导原则中的有关要求进行;三、细胞库的建立应分别建立原始细胞库、主细胞库、工作细胞库的三级管理细胞库,一般情况下主细胞库来自原始细胞库、工作细胞库来自主细胞库;各级细胞库应有详细的制备过程、检定情况及管理规定等;四、单抗生产包括用小鼠腹水法和细胞培养法制备;一小鼠腹水法1．小鼠制备腹水必需使用合格的SPF级BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠杂交子一代; 2．动物实验设施动物实验设施应有相关部门颁发的二级以上合格证;3．腹水制备取适量扩增培养的杂交瘤细胞注射小鼠腹腔制备腹水,小鼠可以预先用液体石蜡或降植烷等处理;二细胞培养法可以采用发酵罐培养,亦可用细胞培养瓶培养收集上清液制备单克隆抗体;培养基用无牛血清或低牛血清培养基,不能用-内酰胺类抗生素;三抗体纯化可采用盐析法、分子筛层析、离子交换亲和层析等适宜的方法;1．尽可能选用一些不引起免疫球蛋白聚合、变性等的纯化方法及条件;2．应验证所用的纯化方法能去除可能存在的非目标产物污染,如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、其它热原质、培养液成分或层析柱析出成分等;3．应验证所用的纯化方法能有效的去除/灭活病毒;4．连续产生的各批产品必须符合质检要求,批间具有良好的重复性;5．纯化后处理必要时对纯化后抗体采用适宜方法进行处理;四半成品、成品制备五、检定包括原液小鼠腹水、细胞培养上清液、纯化抗体、半成品及成品的检定等;一物理化学检测1．外观液体制剂应为接近无色微带乳光的澄清液体,不应含有异物、浑浊或摇不散的沉淀; 2．pH值电位法测定3．蛋白质含量的测定用Lowry法或其它适宜的方法测定;4．纯度测定1电泳法用还原和非还原条件SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法;扫描后免疫球蛋白含量应达到95%以上,二聚体≤10%;2HPLC法纯度应≥95%;3多聚体测定用FPLC或HPLC法,用适宜的分子筛层析,多聚体应≤10%;5．DNA含量测定用DNA分子杂交法;每一剂量残余鼠骨髓DNA含量不高于100pg;6．水分产品如为冻干制品,应进行残余水分测定,其含量应≤3%;二生物学检定1．活性及效价测定用适宜方法进行;2．鼠源病毒检定同上鼠源病毒检查;3．无菌试验同上无菌试验;4．支原体检定同上支原体检定;5．安全试验用小白鼠和豚鼠进行试验;6．热原质试验按照现行版中国药典生物制品热原质试验规程进行;采用家兔法时,家兔注射剂量=人用剂量/5020家兔体重kg;也可用鲎试剂法,1mg/mL蛋白浓度不应检测出有凝集活性;7．异常毒性实验三非免疫球蛋白杂质分析包括来源于细胞基质、培养基和下游工艺的相关杂质,采用适当的技术和方法进行分析检测;六、经修饰的单克隆抗体为了提高单克隆抗体在治疗和体内诊断中的作用,常用单抗与毒素、药物、放射性核素或其它物质偶连形成免疫结合物,或在同一段多胎链包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重组蛋白来获得;研究者除对前面提到的有关未偶连单克隆抗体未修饰单克隆抗体的要求外,还应提供下列内容：一免疫结合物的构建应提供构建免疫结合物所用试剂和过程的详细资料,包括：1．描述与单克隆抗体连接的成分如：毒素、药物、酶及细胞因子,包括：所有成分的来源、结构、制法、纯度及特征;2．制备免疫结合物所用化学试剂的描述,如连接剂和螯合剂;这些资料应该包括试剂来源、制备方法,以及合成或纯化时残留杂质的测定等内容;还应提供合成反应途径的图解,以及与免疫结合物中所用化学试剂毒性相关资料;3．在确定成品的标准时应首先确定该原料与抗体的平均结合率及每个抗体被结合部分的数量,并揭示免疫球蛋白置换数量、效力和稳定性间的关系;4．用重组DNA技术制备的制品如来源于转染细胞系或微生物培养基,嵌合的、易形的,互补决定区CDR接合的及单链Fv抗体,以及重组免疫结合物应提供构建和置备过程的全部资料;重组免疫结合物的稳定性应认真研究;因聚合物形成构形改变或变性而减弱了特异免疫反应性如通过重组Fvs形成"双抗"可能导致药代动力学的改变和/或与非靶组织结合;二免疫结合物的纯度1．应采取特殊措施保证抗体尽可能无外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染,因这些污染物质在构建免疫结合物过程中,能与核素、毒素或药物发生反应;2．应规定最终产品中游离抗体或游离组分的限量;活性中间体应被灭活或去除;三免疫结合物的免疫反应性,效力及稳定性毒素或药物偶联至抗体上会改变其中任一成分的活性;1．应采用适当的方法；评估偶联前后的免疫反应性;2．免疫结合物非免疫球蛋白成分的活性应在适当的时候用效力试验来进行评估例如,毒素、细胞因子或酶等,用于造影的放射性免疫结合物除外;3．免疫结合物构建后,应确定免疫反应性变化的百分率限值,并作为产品规格的组成部分;4．应通过在合并的人血清中37℃无菌条件下孵育,来检测免疫结合物在体外的稳定性;假如所用抗凝剂不会影响免疫结合物的稳定性,血浆可以用来代替血清;经过规定间隔时间分析样品中完整免疫结合物及分解产物的浓度;应详细说明评估产品的稳定性的条件及所用阴、阳对照;四与放射性核素偶联单克隆抗体的特殊问题放免结合物应用标准化的、严格控制并经过验证的方法制备;应建立检测游离同位素、结合单克隆抗体、标记的非免疫球蛋白物质的放射性百分率的方法;1．放射性标记单克隆抗体的初始研究用新药申报包含连续3次放射标记试生产的分析结果,应证明所制备的产品未改变免疫特异性、无菌、无热原质;放射性标记试生产应由在研究中对单克隆抗体进行放射性标记及使用试剂的同一组人员进行;2．制备免疫结合物时应使用放射性药品及同位素并应提供其无菌及无热原质的分析证书及横向参比的信涵;3．在标记试生产过程中,应测定最终产品中共价结合的和游离的同位素的浓度,以及标记试剂及其分解产物的残留水平;4．应描述给每一个病人应用前后进行的质控试验;5．适当的时候,应检测免疫结合物形成胶体的情况,并对其进行限定;6．有关单抗制备中放射性标记物的质控标准参考国家关于放射性药品规定;七、产品稳定性产品稳定性应满足临床方案制定的要求;加速稳定性试验资料可作为产品审批及标定用,但不能代替实际的稳定性资料;一应制定稳定性检定规划,包括在规定效期全过程中,每间隔一定时间进行制品的物理化学完整性试验如断裂或聚合,效力试验,无菌试验,以及水分、pH和防腐剂的稳定性测定;二确保制品生物活性的稳定性试验例如定量体外效率试验应包括厂内参比品;如可能在试验的全过程中只使用一批试验抗原如：纯化的抗原、细胞或组织;应用定量效力试验使对生物活性进行有意义的比较成为可能;三加速稳定性试验,既将制品储存在温度高于常规储存温度后的稳定性试验,可能有助于鉴定及建立稳定性指示试验;表示稳定性的特定参数应通过对每一批制品用趋向分析方法进行监测;八、临床前研究由于生产条件或配方的改变可引起制品生物活性的明显变化;因此,建议在临床前研究中所使用的单抗应与临床试验中拟使用的单抗的生产工艺一致;一交叉反应性试验当相同或相关抗原决定簇在人的非预定的细胞或靶组织表达时,可观察到抗体与它们结合;非靶组织结合可能具有严重后果,特别是使用药理活性抗体或细胞毒性免疫结合物时;因此,一般在Ⅰ期临床试验前应经过用人组织或细胞进行交叉反应性或非靶组织结合的实验室检测;对于双特异性抗体,除检测双特异性产品外,还应对每株亲本抗体进行逐个评估;1．检测交叉反应性的体外试验目前,用人细胞或组织进行免疫细胞化学及免疫组织化学技术检测,应使用有效的并被确认的新技术参照1．2．4;2．测定交叉反应性的体内试验当有适当模型时,单克隆抗体与非靶人组织的交叉反应性应在动物中进行一次综合的体内试验;试验结果,特别是对具有溶细胞性的免疫结合物或具有ADCC活性的抗体,通常要求进行更广泛的临床前试验,包括用一种以上动物超剂量及重复剂量进行动物试验;设计临床试验时应考虑对非靶组织的定位;二临床前药理学和毒性试验1．设计单克隆抗体临床前安全试验是为了预测在人体中可能的毒性评估在人体中潜在不良反应副作用的可能性和严重程度,并可能确定安全初始剂量和逐步提高剂量;有关单克隆抗体的临床前试验,包括免疫原性、稳定性、组织交叉反应性和效应功能;2．动物毒理学研究当设计单克隆抗体的毒理学试验时,应考虑如下：1若被试样品为未偶联抗体,且无合适的动物模型或无携带相关抗原的动物,且与人组织交叉反应性试验明显阴性,则毒理学试验不是必须的;2动物体内相关抗原的性质与人体内相关抗原的生物学分布、功能及结构应具有可比性;但是,对于所用的动物模型,不必要求对单克隆抗体的抗原密度或亲和力绝对相等;例如,结合力差异可通过增加剂量或服药频率来弥补;应鉴定动物和人之间存在的抗原数,单克隆抗体的抗原亲和力或对单克隆抗体结合的细胞应答反应等方面存在的差异;这可以更精确的推断人用的安全初始剂量,并评估安全范围;3对单克隆抗体通常不要求进行常规诱变性的评估;4拟给育龄妇女反复或长期使用的产品,应该用适当的动物模型进行反复的深入的研究包括致畸试验;3．药效学和动物药代动力学1当有动物模型时,则应尽可能证明药理学效应与剂量的依赖性,以及有效剂量的范围,可以更好地预测治疗指数；当无适合动物模型时,则应尽可能以人外周血、组织器官等进行体外药效学研究;当有动物模型时,药代动力学的有关资料生物学分布,半衰期等可以从动物模型中得到；当无适合动物模型时,动物药代动力学可以考虑不做,加强临床试验时药代动力学方面的监控;2下列方面可以指导药代动力学几药效学试验动物种类的选择：①最好选择与人有交叉反应或相同靶抗原的动物模型来进行试验;对于仅抗人而未在动物模型中表达的人抗原或外源抗原细菌,病毒等的未偶联单克隆抗体,可以不必用缺乏靶抗原的动物做试验;②当有抗原结合资料表明灵长类为最相关种属时,则对未偶联的单克隆抗体的试验采用非人灵长类动物是适宜的;③应对使用正常啮齿类动物和鼠异源移植模型精确预测单克隆抗体在人体的药代动力学行为的可能性进行严格评估;异源移植模型对评估单克隆抗体与人体内肿瘤结合的能力更有意义;3鼠源抗体对于小鼠为非免疫原性物质,但在人体内具免疫原性,这就使得在鼠内所得的重复剂量结果难以推至拟在人体内使用的重复剂量;使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"单克隆抗体将出现相应的问题,在这种情况下用啮齿类动物进行重复剂量的研究意义不大;4．用免疫结合物进行的临床体内研究1应在体内试验免疫结合物的稳定性①应测定免疫结合物中每个组分在动物体内药代动力学和组织分布,并且与未偶联抗体的分布相比较;②不同组分的靶组织和他们能引起的潜在的毒性应被证实;2由于免疫结合物可能被降解或作用位点的活性不是单克隆抗体与靶抗原结合的结果,应对含有放射性核素、毒素或药物的免疫结合物进行动物毒性实验,尽管该种动物不存在靶抗原;根据免疫结合物组分的性质和其偶联的稳定性,对组分分别进行试验是有道理的;应充分描述每个组分的毒性情况、副反应的发生和严重程度;所得结果应与结合物稳定性试验密切相关;如可能,应用具有相关靶抗原或疾病模型动物体内进行免疫结合物试验,如果不存在靶抗原阳性动物就在啮齿类动物体内进行;游离毒素或核素的毒性试验可在不同类动物中进行;3对于放射性核素的免疫结合物：①动物生物分布的资料可被用于对初始人用剂量的评估;②如可能,表达靶抗原的动物模型更有可能发现抗原"减少"或带有在生物分布和/或毒性方面表现意外抗原的组织;③异源移植模型可以组织定位和抗原非特异放射性免疫结合物分布问题,但对确定一般组织交叉反应范围没有帮助;④应研究适宜的动物数量以用一个可接受的变异系数通常小于20%对放射性剂量进行评估;⑤对于使用放射性总量的新陈代谢和测定从早到晚清除期时间点的适当数值应有完整计算;⑥放射性免疫结合物应通过在血清或血浆中孵育检测体外稳定性;应建立方法来评估游离表位,偶联单克隆抗体,标记的非单克隆抗体三种中每成分存在的放射性百分比;说明：对局部外用和制备体外诊断试剂盒单克隆抗体要求参照上述相关部分执行,但其生产条件、小鼠清洁级别、抗体纯度和安全试验可根据实际需要降低或减少要求;附录：鼠源性病毒检测1．被检病毒人用鼠源性单抗制品中可能含有潜在污染的病毒见下表;───────────────────────────────────────组病毒受影响动物───────────────────────────────────────Ⅱ出血热病毒大鼠,小鼠淋巴细胞脉络从脑膜炎病毒LCMV大鼠3型呼肠孤病毒REO大鼠,小鼠大鼠轮状病毒大鼠仙台病毒大鼠,小鼠Ⅱ脱脚病病毒小鼠KITHAM氏大鼠病毒KRV大鼠小鼠腺病毒MAV小鼠小鼠肺炎病毒PVM小鼠逆转录病毒大鼠,小鼠TOOLAN病毒HI大鼠───────────────────────────────────────前五种病毒属Ⅰ组,为能够感染人与灵长类动物的病毒,后六种属Ⅱ组,为目前尚无迹象表明感染人,但对人类具有潜在危险性,能在体外培养的人和猿、猴源性细胞中进行复制,这些病毒应作为重点进行检测;2．样品包括细胞株、腹水、动物血清、单抗半成品和成品等,用适宜方法预处理;3．试验方法包括细胞试验、动物抗体产生试验、鸡胚感染试验等;3．1细胞实验细胞及培养上清液分别接种人2BS、Vero细胞,培养,传两代后制片,用间接免疫荧光法检测病毒抗原;3．2动物抗体产生试验样品接种出生24小时以内乳鼠10只i．m；15~20g成年小鼠20只i．mti．p：10只接种样品,10只作为对照；小鼠20只i．c：10只接种样品,10只作为对照;观察4周存活率应在80%以上,用ELISA或其他适宜的方法检测血清中病毒抗体;3．3鸡胚感染试验应用鸡胚接种进行检查,可用9~11天龄的鸡胚,将样品注射于10个鸡胚的绒毛尿囊膜、尿囊腔及卵黄囊中;接种后鸡胚至少在5天后才能进行检查;并用豚鼠、鸡或其它禽类的红细胞检查尿囊液中是否含有血凝素;4．检测范围───────────────────────────────────────样品细胞实验动物抗体产生试验鸡胚感染试验备注原始细胞库+-+每批检查主细胞库+-+每批检查工作细胞库+-+每批检查鼠群-+-定期抽查腹水-+-+每批检查细胞培养法制备每批检查单抗的上清液───────────────────────────────────────。
单克隆抗体和基因工程抗体
谢谢大家！
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实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗，
如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
三、基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或 修饰，导入受体细胞表达的抗体。
二、单克隆抗体
（monoclonal antibody, McAb）
由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别 抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。
特点：具有高度均一性。 杂交瘤细胞：
骨髓瘤细胞 --- 无限增殖； 免疫B细胞 --- 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 --- HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。
第六节 单克隆抗体和基因工程抗体
一、多克隆抗体（polyclonal antibody）： 指由不同B细胞克隆产生的针对抗
原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混 合物。
如:免疫血清（含多种特异性抗体）
实际意义：
（1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 --- 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。
基因工程抗体的例子
基因工程抗体的例子
基因工程抗体是通过基因重组技术将特定抗体基因导入至其他生物细胞中，使其具备产生抗体的能力，从而实现大规模生产高效、高纯度的抗体。
以下是一些基因工程抗体的例子：
1. 重组抗体药物：例如，重组人源单克隆抗体药物，如阿达木单抗（Adalimumab）和帕尼单抗（Panitumumab），用于治疗自身免疫疾病和某些癌症。
2. 基因工程抗体治疗疫苗：例如，COVID-19疫苗中使用的mRNA 疫苗，通过基因工程技术将病毒的抗原编码序列导入到人体细胞中，诱导免疫系统产生抗体来抵抗病毒感染。
3. 重组抗体诊断试剂：例如，基因工程技术可用于生产特定病原体抗体，如新冠病毒SARS-CoV-2抗体，用于开发快速诊断试剂盒，帮助早期检测和诊断疾病。
4. 基因工程抗体治疗：例如，CAR-T细胞疗法，通过基因工程技术将患者自身T细胞中的受体基因改造，使其能够识别和杀死癌细胞，用于治疗某些血液恶性肿瘤。
5. 基因工程抗体生产：基因工程技术可用于大规模生产特定抗体，如重组人源单克隆抗体，用于研究和治疗领域。
这些基因工程抗体的例子说明了基因工程技术在抗体研究、生产和
应用中的重要性和广泛应用性。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。
具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。
一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。
PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点
比较三代抗体在制备和应用方面的优缺点摘要：抗体技术的发展主要经历了三个时期，相应产生了三代抗体：多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体。
多克隆抗体技术即免疫血清制备技术较简便，但免疫血清特异性较低。
自从第一个单克隆抗体产生以来，单抗已广泛地应用于疾病的诊治上。
为了克服传统的鼠源性单抗存在的弊端，随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，基因工程抗体技术取得了比较大的进展，包括对鼠源性单抗的改造、人源性单抗的研制及对抗体分子结构和功能的改造，尤其是以噬菌体抗体库技术、核糖体展示技术和转基因小鼠技术为代表的人源性单抗制备技术的研制最为瞩目。
本文就三代抗体在制备及应用方面的优缺点作了简单的比较。
关键词：多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。
抗体技术的发展主要分为三个时期，1890年Emil A. V. Behring等发现白喉抗毒素，并用于人工被动免疫，第一代抗体——多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)，继而产生。
第二代抗体于1975年，Köhler和Milstein创建杂交瘤技术制备出针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体(Moclonal antibody, McAb)，单克隆抗体是均质的异源抗体。
20世纪80年代采用基因工程的手段研制抗体及其与功能的关系，并对抗体基因进行改造和重组等，而制备出的抗体为基因工程抗体（Genetic engineering antibody, GEAb），即第三代抗体。
[1]一、多克隆抗体(Polyclonal antibody, PcAb)1、免疫血清的制备（1）抗原的制备制备多克隆抗体对抗原纯度要求十分严格。
抗原越纯，获得抗体的特异性越高，要求至少达到电泳纯或色谱纯。
（2）佐剂（Adjuvant）的应用对可溶性抗原而言，为了增强其免疫原性或改变免疫反应的类型、节约抗原等目的，常采用加佐剂的方法以刺激机体产生较强的免疫应答。
单克隆抗体和基因工程抗体
疾病诊断和治疗
基因工程抗体可以用于疾病的 诊断和治疗，如肿瘤免疫治疗 、自身免疫性疾病治疗等。
药物研发
基因工程抗体可以作为药物研 发中的靶点筛选、药物设计和 优化等环节的重要工具。
基因工程抗体的优缺点
优点
基因工程抗体具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定抗原进行高灵敏度检测和靶向治疗；同时， 基因工程抗体可以通过基因工程技术进行改造和优化，提高其稳定性和功能。
抗体的分类和发展历程
天然抗体
由免疫系统自然产生的抗体，类型多样，特异性各 异。
单克隆抗体
通过杂交瘤技术制备的单一抗体，具有高度特异性 ，可用于治疗和诊断。
基因工程抗体
利用基因工程技术改造的抗体，如人源化抗体、小 分子抗体等，具有更好的治疗潜力和应用前景。
抗体的分类和发展历程
单克隆抗体技术最初诞生于20世纪70年代，由两位科学家Kohler 和Milstein发明。该技术通过将具有特定抗体的B淋巴细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出能够持续稳定产生单 一抗体的细胞系。单克隆抗体在临床治疗和诊断领域发挥了重要 作用，如治疗癌症、自身免疫性疾病等。
100%
生物治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫病、感 染性疾病等，通过与药物结合或 直接作用于靶点发挥作用。
80%
免疫学研究
用于研究免疫应答机制、细胞信 号转导等。
单克隆抗体的优缺点
优点
高度特异性、易于制备和纯化、 可大量生产、稳定性好等。
缺点
制备过程复杂、成本高、可能引 发免疫反应等。
03
基因工程抗体
挑战
机遇
单克隆抗体和基因工程抗体的研发和生产成 本较高，同时存在免疫原性和副作用等问题， 需要进一步研究和改进。
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(二)、基因工程抗体
基因工程抗体是利用基因工程 的手段获得人源性抗体，主要包括 以下几个方面：人－鼠嵌合抗体、 改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体 技术、表位印迹选择技术等。7
1. 人－鼠嵌合抗体：
抗体的重轻链构成的可变区(V区)与识 别抗原有关，具有特异性；而恒定区(C区) 与效应功能有关。人－鼠嵌合抗体就是通 过人工改造使抗体的V区是鼠源的，而C 区是人源的。如此改造的嵌合抗体保留了 原来鼠源单克隆抗体的特异性和亲和力， 人抗小鼠抗体反应(HAMA)也明显减弱。
技术同鼠－鼠杂交瘤，亲本骨髓瘤细 胞主要有来自小鼠的骨髓瘤653、SP2/0、 NS-1，来自大鼠的骨髓瘤Y3Ag1.2.3等； 亲本B细胞来源于人外周血淋巴细胞、淋 巴结细胞、脾细胞。但人－鼠杂交瘤的单 克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由 于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分 泌抗体的能力。
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3. 人－人杂交瘤单克隆抗体：
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14
5. 表位印模选择 抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可 变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从 而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体， 将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染 到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人 单克隆抗库的抗体库， 从中筛选所需要的抗体。利用PCR扩增重链和轻 链的cDNA，并插入到噬菌体外壳蛋白的编码基 因中，然后感染E. coli，使抗体基因的表达产物 和外壳蛋白一起融合展示在噬菌体表面，成为噬 菌体抗体。通过固相化的抗原进行筛选，不能结 合抗原的噬菌体被洗去，结合的噬菌体被洗脱下 来再次感染细菌进行扩增，多次吸附－洗脱－扩 增后可获得所要的抗原特异性的噬菌体抗体。这 些抗体可以做到全部为人源的。
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单克隆化
扩大培养 有限稀释
单克隆化
由单一细胞 长成
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Fab抗体分子的制备
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利用基因工程制备单链抗体(ScFv)
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5. 严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：
SCID小鼠具有严重免疫缺陷，对外源 组织无免疫排斥反应，故这种小鼠可接受 人体组织或器官移植，形成人－鼠嵌合体 小鼠。将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体 内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种 小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细 胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进 一步进行细胞融合或制备抗体库。
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人－鼠嵌合抗体的制备
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2. 改型抗体：
也称CDR移植。用鼠源的CDR(可 变区中和抗原互补结合构成抗原结合部 位的部分）取代人抗体中相应的CDR部 位，使得抗体中除构成抗原结合部位的 3个CDR是鼠源以外，其余均为人源。 这种抗体在人体内免疫性大大降低。
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改型抗体（CDR移植）
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3. 抗体片段：
Fab抗体：抗体Y形的两个臂称为Fab，它由 可变区和小部分的恒定区组成，利用基因工 程的方法构建具有可变区和小部分恒定区的 Fab抗体，这样的抗体仍具有特异结合抗原的 特性。 单链抗体(ScFv)：用短肽接头[常用(Gly4Ser)3] 将重链可变区和轻链可变区相连，使其分子 变小，更有利于穿透组织和清除，而且易构 建表达；但亲和力会出现一定的下降。
人－人杂交瘤操作步骤基本上与小鼠－小鼠 杂交瘤技术相同，使用人的骨髓瘤细胞与人的B 淋巴细胞融合；但可供利用的人骨髓瘤细胞种类 非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型 方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠 那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周 血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合； 故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及 融合细胞分泌抗体方面仍不理想。
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4. 构建转人Ig基因组小鼠
▶ 将改造过的人的抗体基因组导入小鼠胚胎，得 到在免疫后能产生人抗体的转基因小鼠。改造 过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的 三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部 分均是人源的。
▶ 用人Ig基因组取代小鼠Ig基因组获得转基因小鼠， 以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的 是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但 已有成功的报道。
四、人源性单克隆抗体 和基因工程抗体
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(一) 、人源性单克隆抗体 1பைடு நூலகம் EB病毒转化技术：
利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体 外直接感染人外周血淋巴细胞（来源于淋 巴结、扁桃体、脐带血、外周血等），使 之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系， 这些细胞可在体外分泌人抗体。
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2. 人－鼠杂交瘤单克隆抗体：