嗜热脂肪芽孢杆菌
芽孢杆菌耐高温的原因
芽孢杆菌耐高温的原因
芽孢杆菌一般是指嗜热脂肪芽孢杆菌。
通常情况下，嗜热脂肪芽孢杆菌耐高温，并且耐热性比较强。
具体情况分析如下：嗜热脂肪芽孢杆菌为嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，耐热性是非常强的，在经过高温之后，也可能会残留一部分，是造成食品腐坏和变质的主要微生物之一，在食品保存方法不正确或者是存放的时间比较长时，可能会导致里面滋生很多嗜热脂肪芽孢杆菌，而且经过高温的烹饪之后，也不能达到完全杀灭的效果，可能会导致人体出现急性胃肠炎、食物中毒等不良反应，表现为呕吐、腹泻、腹痛等。
建议滋生了嗜热脂肪芽孢杆菌的食物即使加热也不要再吃，不利于身体健康。
嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶
嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），是一种广泛存在于自然环境中的细菌，其特点是喜好生长于高温环境，并且具有较高的耐热性。
淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌产生的一种酶类物质，具有重要的应用价值。
淀粉酶是一类在淀粉颗粒水解过程中起关键作用的酶类。
它能够催化淀粉分子内部的α-1,4-葡萄糖键断裂，从而将淀粉分解为较低聚的糊精、麦芽糊精和麦芽糖等产物。
由于淀粉是一种常见的多糖类物质，在食品工业、饲料工业和生物技术等领域具有广泛的应用前景。
嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶具有多种优点，使其在工业上得到了广泛的应用。
首先，嗜热脂肪芽孢杆菌的生长温度适应范围较宽，能够在较高的温度下生长，从而提高了淀粉酶的生产效率。
其次，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶在高温下仍保持较高的活性，能够在高温条件下进行淀粉的水解反应，提高了工业生产的温度范围。
此外，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶对底物的亲和力较高，能够高效地水解淀粉颗粒，提高酶的利用率。
淀粉酶的应用领域非常广泛。
在食品工业中，淀粉酶可以用于面包、饼干、饼子等面点制品的生产中，通过调控面团中淀粉的水解程度，改善产品的质地和口感。
在饲料工业中，淀粉酶可以用于动物饲料的加工中，通过降低饲料中的淀粉含量，提高饲料的消化率和营养价值。
在生物技术领域，淀粉酶可以用于生物燃料的生产中，通过将淀粉转化为可发酵的糖类物质，为生物燃料的产生提供原料。
除了在工业应用中，淀粉酶还具有一定的医学价值。
研究发现，淀粉酶对人体消化系统中的淀粉消化起到重要的作用。
通过补充淀粉酶，可以改善人体对淀粉的消化吸收，从而缓解消化不良等相关问题。
总结来说，嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶是一种具有重要应用价值的酶类物质。
它在工业生产中具有广泛的应用前景，在食品工业、饲料工业和生物技术领域发挥着重要作用。
同时，淀粉酶在医学领域也具有一定的价值。
未来的研究和应用将进一步拓展淀粉酶的应用领域，为人类的生产和生活带来更多的便利和效益。
嗜热脂肪芽孢杆菌使用说明
嗜热脂肪芽孢杆菌编号 名称北京华越洋生物NRR00390 嗜热脂肪芽孢杆菌基本信息：名称：嗜热脂肪芽孢杆菌规格：300ul甘油菌储存温度：-‐80℃基因组：嗜热脂肪芽孢杆菌简介：嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）属嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，细菌繁殖体为革兰氏阳性。
其细菌繁殖体对培养基要求低，在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨琼脂上生长良好，表面粗糙呈米黄色。
其最低生长温度为28℃，最高生长温度70～77℃。
最适生长繁殖温度为56～65℃，培养24h即可形成菌落，37℃下24h看不到菌落。
嗜热芽孢杆菌存在抗药性质粒；嗜热脂肪芽孢杆菌（60℃）含有多种抗药性隐蔽质粒。
操作说明：1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。
也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。
冷冻管开封：用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌株复溶：无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。
轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。
做好标识，在适宜温度下培养。
细菌在30-‐35℃培养箱中培养24-‐48h，真菌在23-‐28℃培养箱中培养24-‐72h （必要时，可适当延长培养时间）。
菌株传代：将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
注意事项：1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致菌种衰退；2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长；4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问；5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态；6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-‐10%CO2 促进生长；7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。
嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质
3武汉市晨光计划资助项目(985003077)1现在工作地址:四川涪陵师范学院生物系;2通讯作者作者简介:唐 兵(1968-),男,山东省济南市人,武汉大学生命科学学院副教授,博士,主要从事微生物生理及应用微生物学研究收稿日期:1998205208,修回日期:1998210219嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质3唐 兵 周林峰 陈向东 戴 玄1 彭珍荣2(武汉大学生命科学学院 武汉 430072)摘 要:对嗜热脂肪芽孢杆菌(B acillus stearothermophilis )WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在p H 值为715的Fd 培养基中振荡发酵培养48h 后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL 以上。
对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD ,最适作用p H 为810,最适作用温度为80℃,具有良好的p H 稳定性及热稳定性。
Ca 2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF 、DFP 及IAA 能强烈抑制酶活力,而DTT 对该蛋白酶活力无影响。
关键词:嗜热脂肪芽孢杆菌WF146,高温蛋白酶,性质中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2000)02-0188-92蛋白酶是一类广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面的重要工业用酶。
而高温蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点,有重要应用价值。
不仅如此,对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶,从而提高其稳定性提供理论依据。
人们已经从许多嗜热细菌中分离到高温蛋白酶[1～3],其中嗜热解朊芽孢杆菌(B acill us thermoproteolyticus )生产的嗜热蛋白酶(thermolysin )已在工业上用来生产二肽甜味剂(aspartame )[4]。
但是,高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。
我们筛选到一株高温蛋白酶的高产菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophil us )WF146[5],对其产酶条件及一些酶性质进行了研究。
嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达_纯化及其酶学性质的研究.kdh
中国科学C辑:生命科学 2008年 第38卷 第2期: 166~172 166 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究张敏①②, 赵丛①, 杜连祥①, 路福平①*, 高晨③①天津科技大学生物工程学院, 天津 300457;②沈阳农业大学工程学院, 沈阳 110161;③南开大学生命科学学院, 天津 300071* 联系人, E-mail: lfp@收稿日期: 2007-07-08; 接受日期: 2007-10-13国家高技术研究发展计划(批准号: 2007AA02Z212)资助项目摘要本文中嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)的高温中性蛋白酶基因在sacB基因启动子的调控下, 以蛋白酶自身或sacB基因的序列为信号肽, 分别实现了在枯草芽孢杆菌DB104中的高效表达. 表达产物经纯化后, 酶的比活力可达16530 U/mg, 纯化倍数达到3.8倍, 分子量约为35 kD. 对酶学性质的研究结果表明, 此酶的最适反应温度为65,℃最适作用pH为7.5, 在65℃下反应1 h后, 仍可保留约80%的活力. 关键词枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 高温中性蛋白酶表达纯化酶学性质工业用酶约占世界酶总量的60%, 而蛋白酶是工业用酶中最重要的组成部分[1], 它能够催化蛋白质水解. 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以分泌大量的胞外酶, 这些酶被广泛地应用于洗涤剂、食品、制药、皮革和化工等行业[2,3].许多种嗜热菌可以产生热稳定性高的胞外蛋白酶, 例如Bacillus stearothermophilus[4], Thermos aqua-ticus[5], Bacillus licheniformis[6], Bacillus pumilus[7]和Thermoanaerobacter yonseiensis[8]等, 其中有些种类在工业生产中具有非常重要的作用. 由于它们具有高的反应温度和良好的热稳定性, 因此能够加快催化反应速率, 提高非气态底物和产物的溶解性, 从而降低染菌的几率. 在嗜热蛋白酶中, 高温中性蛋白酶得到了广泛地研究[9∼11]. 例如, Fujii等人[12]报道了嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)高温中性蛋白酶基因的克隆与表达, 实验表明蛋白酶的作用pH呈中性, 于65℃下反应30 min后仍可保留约80%的活力. 同时, Huang等人[13]也报道了对嗜热枯草杆菌HS08高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质的研究, 所得蛋白酶在40~65℃间均具有较好的热稳定性, 于65℃下反应1 h后仍可保留75%的酶活力.本研究室从土壤中得到了一株高产高温中性蛋白酶的B. stearothermophilus, 将该菌于46℃下培养60 h并纯化后, 蛋白酶的比活力可达11240 U/mg, 蛋白酶表达产物的分子量约为35 kD, 最适作用温度和pH分别为65℃和7.5, 将该酶于65℃下反应1 h后仍可保留80%的酶活力. 但是, 由于 B. stearothermo-philus的培养温度较高, 限制了其大规模的生产, 因此有必要来构建一个能够在中温下进行表达的系统. 同时, 枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理想的异中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第2期167源蛋白表达系统[14], 其优点在于可以高效地表达具有生物学活性的异源蛋白并将其分泌至培养基中[15], 而且枯草芽孢杆菌也具有较高的生物安全性.因此, 本文将高温中性蛋白酶基因克隆入B. sub-tilis , 来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行诱导表达的系统, 使该基因处于sacB 基因启动子的调控下, 并分别以自身或sacB 基因的序列作为信号肽. 同时, 对高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质也进行了研究.1 材料与方法1.1 菌种、质粒和培养条件B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 作为蛋白酶的表达宿主[16]; 大肠杆菌(E. coli ) JM109是基因操作的克隆宿主[17], 2个菌株均于37℃下LB 培养基中进行培养. 重组大肠杆菌用LB 培养基(含30 µg/mL 氯霉素(Cm))进行培养和筛选, 而重组枯草芽孢杆菌用LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em))进行培养和筛选.pBSAT 质粒上含有sacB 基因, 由本研究室构建. 质粒pHP13PS 是由pHP13载体(E. coli -B. subtilis 穿梭载体)构建而来的, 其上含有sacB 基因的启动子和信号肽序列; 质粒pHP13P 也是由pHP13载体构建而来的, 但其仅含有sacB 基因的启动子序列.1.2 DNA 的操作本实验所采用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购自TaKaRa 公司; DNA 片段的分离纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA 连接以及对大肠杆菌的转化等操作均参照分子克隆实验指南[17].1.3 高温中性蛋白酶序列的克隆根据已发表的高温中性蛋白酶基因的全序列, 设计用于扩增高温中性蛋白酶基因(nprT )的一对引物, 此基因包括信号肽、前肽和成熟肽序列. 两个引物序列分别为5′-CCGGTCGACGGGAAAATTGGAAAA- TGAAAAGG-3′(Sal Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAG- TGGAGGAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). PCR 反应条件: 94℃, 5 min; 94℃, 1 min, 55℃, 1 min, 72℃, 2 min, 35个循环; 72℃, 10 min.根据nprT 基因序列, 设计用于扩增nprT"的2个引物, nprT"基因不包含信号肽序列. 2个引物序列分别为: 5′-CCCCCGGGGCCCAAGTATTTTTACCTTAC- AAT-3′(Sma Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAGTGGAG- GAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). 扩增的产物利用琼脂糖凝胶进行分离纯化, 并通过DNA 测序进行验证.1.4 诱导型表达载体的构建将用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1725 bp 的nprT 基因片段, 克隆入同样用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13P 载体上, 得到质粒pHP13PN, 该质粒上nprT 基因处于sacB 基因的启动子和自身信号肽序列的调控下(图1(a)); 将用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1651 bp 的nprT"基因片段, 克隆入同样用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13PS 载体上, 得到质粒pHP13PSN, 该质粒上npr T"基因处于sacB 基因的启动子和信号肽序列的调控下(图1(b)).1.5 高温中性蛋白酶基因的诱导表达将质粒pHP13PN 和pHP13PSN 按照Chang 等 人[18]的方法转化入B. subtilis DB104中, 分别得到重组子DB104/pHP13PN 和DB104/pHP13PSN. 再将重组子接入LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em)中, 于37℃, 200 r/min 的条件下培养2 h 后, 加入2%的蔗糖溶液诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 以未加蔗糖溶液的作为对照; 继续培养50 h, 将培养液于4℃, 14000× g 离心15 min 后收集上清以测定其酶活力. 同时, 用SDS- PAGE 法来检测高温中性蛋白酶基因的表达情况.1.6 高温中性蛋白酶(NprT)的纯化将培养物上清液用饱和度为80%的硫酸铵溶液进行沉淀后, 再加入20 mL 的Tris-HCl 缓冲液 (50 mmol/L, pH 7.5)溶解沉淀, 并于4℃下用同样的缓冲液透析12 h, 透析得到的溶液经DEAE-Sephadex A25柱层析后收集含有NprT 的部分, 再次用80%饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀后, 以0.3 mL/min 的速率用DEAE-Sephadex A50柱进行洗脱.1.7 蛋白酶NprT 酶活力的测定蛋白酶活力的测定是将1 mL 1%的酪素溶液(pH 7.5)与1 mL 的酶稀释液混匀, 于65℃下反应10 min张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究168图1 质粒的构建图谱(a) 质粒pHP13PN包含由sacB基因启动子和自身信号肽序列调控的nprT基因; (b) 质粒pHP13PSN包含由sacB基因启动子和信号肽序列调控的nprT"基因. Cm和Em分别为E. coli和B. subtilis中的筛选标记后, 加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA), 充分振荡后于14000×g下离心20 min, 取1 mL上清液采用Folin酚法测定酪氨酸的含量[19]. 蛋白酶活力单位定义为: l mL液体酶在65℃和pH 7.5的条件下, l min水解酪素产生l µg酪氨酸为1个酶活力单位.1.8温度和pH对NprT酶活力的影响将溶于Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L, pH 7.5) 的NprT分别于40~75℃下进行反应, 以测定纯化后NprT的最适反应温度. 纯化NprT的最适作用pH于65℃下分别在不同的缓冲体系中进行测定, 3种缓冲液分别为50 mmol/L乙酸钠溶液(pH 4.0~5.5)、50 mmol/L磷酸钠溶液(pH 6.0~7.0)和50 mmol/L Tris- HCl溶液(pH 7.5~9.0). 为测定NprT的热稳定性, 将溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的纯酶于65℃下作用不同的时间后, 测定其剩余的酶活力.2结果与分析2.1质粒pHP13PSN和pHP13PN的构建通过PCR扩增分别得到nprT和nprT"基因, nprT 基因包括信号肽序列(1~57 bp)、前肽序列(58~708 bp)和成熟肽序列(709~1656 bp)(图2)[20]. 为研究高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达, 构建了2个不同的表达载体. 其中, 质粒pHP13PN包含sacB 基因的启动子和nprT基因的信号肽序列(图1(a)), 而质粒pHP13PSN包含nprT"基因以及位于其上游的sacB基因的启动子和信号肽序列(图1(b)). 利用含Em的LB平板来筛选重组子, 每次筛选大约有20~30个转化子, 然后通过酶切和PCR扩增来验证插入基因片段的正确性.为确认质粒pHP13PSN和pHP13PN中sacB基因序列与高温中性蛋白酶基因序列之间的可读框连接正确, 我们分别测定了整个基因序列. 结果表明, 两个连接处的读码框均正确, 并且本实验克隆的高温中性蛋白酶基因序列与已报道的基因序列有99%的同源性(GenBank登录号: M21663).2.2高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达将构建的重组质粒pHP13PSN和pHP13PN分别转化B. subtilis DB104后, 向培养液中分别加入蔗糖溶液来诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 利用12% SDS-PAGE来进行检测. 电泳结果表明, NprT存在于培养物上清液中, 同时也表明NprT被成功地分泌到胞外(图3).在培养过程中, 定时取样测定上清液中NprT的酶活力(图4). 结果显示, 重组子pHP13PN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力达7020 U/mL, 而重组子pHP13PSN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力高达13580 U/mL, 表明sacB基因的信号肽序列对于nprT基因的表达效果更显著. 对含有NprT的粗酶液进行纯化(表1), 当纯化倍数为3.8时, 其比活力可达中国科学C辑: 生命科学 2008年第38卷第2期图2 nprT基因的核苷酸和氨基酸序列169张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究170图3 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: pHP13/DB104培养物的上清液(对照组); 2: pHP13PN/DB104培养物的上清液; 3: pHP13PSN/DB104培养物的上清液图4 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达情况的比较■: 质粒pHP13PN上含有nprT基因和自身的信号肽序列; ▲: 质粒pHP13PSN上含有nprT"基因和sacB基因的信号肽序列; ×: 质粒pHP13上未插入外源基因16530 U/mg, 提高了13.4%, 而Huang等人[13]的研究表明NprT的比活力仅为13172 U/mg, 提高 5.1%. SDS-PAGE分析的结果表明(图5), 有一分子量约为35 kD的特征蛋白带出现, 大小与出发菌株的一致.图5 NprT纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: 纯化NprT2.3温度和pH对NprT酶活力的影响将纯化的NprT分别于40~75℃温度下反应, 测定NprT酶活力. 结果表明(图6(a)), 酶的最适反应温度为65℃, 当反应温度超过65℃以后, 酶活力迅速下降; NprT的作用温度范围较宽, 为55~75℃, 并且在40~ 65℃之间, NprT具有较好的热稳定性; 在65℃下反应1 h后仍可保留约80%的酶活力, 因此, NprT可被定义为嗜热酶. 研究不同pH对NprT酶活力的影响, 结果表明(图6(b)), 当pH<5.5时, 酶活力较低, 当pH>5.5时, 酶活力迅速升高; NprT作用的最适pH为7.5, 在pH 6.5~9.0范围内均有较高的酶活力.3讨论由于 B. subtilis向胞外分泌高浓度的蛋白酶[21],中国科学 C 辑: 生命科学 2008年 第38卷 第2期171表1 NprT 的纯化结果步骤 体积/mL 总蛋白/mg 总酶活力/×104U 比活力/U·mg -1回收率/% 纯化倍数 粗酶液 500 525.5 228.6 4350 100 1 (NH 4)2SO 4盐析 300 387.2 195.1 5040 85.3 1.15 DEAE-Sepharose A25 167 74.4 92.6 12450 40.5 2.86 DEAE-Sepharose A5093 18.5 30.6 16530 13.4 3.8图6 温度(a)和pH(b)对高温中性蛋白酶活力的影响以致影响了表达产物的稳定性, 而B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 有助于提高分泌蛋白的稳定性. 同时在枯草杆菌表达系统中使用诱导启动子系统, 可以使外源基因在加入诱导剂之前并不表达, 从而不会影响到宿主菌的生长; 当加入诱导剂后, 就可以使外源基因得到表达, 从而保证了外源蛋白的稳定性和高产量. 蔗糖诱导系统是B. subtilis 两大天然诱导系统之一, 由sacA 和sacB 两个基因组成. 其中, sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶, 是一种受蔗糖诱导的胞外酶, 既具有蔗糖诱导表达所需要的诱导区域, 也具有使蛋白有效分泌的信号肽序列.对于中温菌 B. subtilis 的培养比高温菌 B. stearothermophilus 要容易得多, 将B. subtilis 作为高温中性蛋白酶基因的表达宿主会对酶的应用提供一个很有前景的方式. 本文中高温中性蛋白酶基因在 B. subtilis DB104中成功地实现了表达, 酶的比活力较出发菌株有所提高, 可达16530 U/mg. 实验结果表 明, sacB 基因的信号肽序列在引导高温中性蛋白酶进行分泌时所起的作用要优于蛋白酶自身的信号肽序列. 纯化酶的最适作用pH 和反应温度分别为7.5和65, ℃在65℃下反应1 h 后, 仍可保留约80%的活力. 实验结果也表明, 重组酶的性质与出发菌株的相同, 有必要对高温中性蛋白酶的动力学性质进行分析, 以确定蛋白酶的种类.本文首次利用sacB 诱导基因来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行高效诱导表达的系统, sacB 基因的表达不仅可以利用蔗糖来诱导, 其表达水平也可以通过一些多效调控基因来得到提高, 例如degQ , degU 和degS 基因[22∼24]. 目前, 本研究室正在构建含有多效调控基因的重组质粒, 这样将会使高温中性蛋白酶基因的诱导表达水平有更大的提高.张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究参考文献1 Nascimento W C A, Martins M L L. 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嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法原理与程序!
嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法原理与程序！嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法原理与程序！⒈原理：培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，并含有 pH 指示剂（溴甲酚紫）。
加入样品并温浴后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽孢将在培养基中生长并利用糖产酸，pH 指示剂的紫色变为黄色。
相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽孢不会生长，pH 指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。
⒉芽孢悬液：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56 ℃培养24 h 后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56 ℃培养24 h 后转入 36 ℃培养 3 d～4 d，镜检芽孢产率达到 95%以上时进行芽孢悬液的制备。
每块平板用 1 mL～3 mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液 10 mL～20 mL）。
将洗脱液 5 000 r/min离心 15 min。
取沉淀物加无菌0.03 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2）制成 10 ９ cfu/mL 芽孢悬液，置 80 ℃恒温水浴中 10 min 后，密封防止水分蒸发，置冰箱保存备用。
⒊测试培养基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽孢悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为 8×10 ５～2×10 ６ cfu/mL。
混合芽孢悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管 200 μL，密封防止水分蒸发。
这样配制好的测试培养基可以在冰箱保存 6 个月。
⒋培养操作：吸取样品100 μL加入含有芽孢的测试培养基中，轻轻旋转试管混匀。
每份检样作二份，另外再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为 100 μL 青霉素 G 参照溶液，阴性对照管为 100 μL 无抗生素的脱脂乳。
于 65℃水浴培养2.5 h，观察培养基颜色的变化。
嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理
嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理嘿，各位小伙伴，今儿个咱们聊聊那个既神秘又实用的东西——嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂。
这个小家伙可不得了，它就像是个小侦探，专门用来检测那些高温环境下的细菌问题。
那么，这个小侦探是怎么工作呢？别急，跟着我一起慢慢揭开它的神秘面纱吧！这个小侦探有个特别的地方，那就是它能变色。
想象一下，当环境温度升高到一定高度时，这个小侦探就会变得“红通通”的，就像吃了辣椒一样。
这可不是因为它喜欢辣，而是因为高温让它体内的某些物质发生了变化，导致颜色变深。
这个过程就像是一场小小的化学反应秀，精彩极了！接下来，我们来谈谈这个小侦探是如何工作的。
它其实是一种微生物，叫做嗜热脂肪芽孢杆菌。
这种细菌在高温下会迅速繁殖，产生一种叫做黑色素的物质。
黑色素是一种天然色素，它可以吸收光线，让整个小侦探看起来“红彤彤”的。
而当我们把这个小侦探放到不同的温度环境中去“探险”时，它就会展现出不同的颜色变化。
这种变化就像是在告诉我们：“嘿，伙计们，我现在正处在一个高温的环境中。
”当然啦，除了变色之外，这个小侦探还有别的本领。
比如，它还能发出“嗡嗡嗡”的声音，就像是在向我们报告它的“发现”。
而且，它还会根据不同的温度环境，释放出不同的化学物质，这些化学物质就像是它的“语言”，让我们能够更好地了解和应对高温环境带来的挑战。
说到这里，你是不是已经迫不及待想要试试看这个小侦探的本领了呢？别着急，咱们可以在家里或者实验室里做个实验，观察一下这个小侦探在不同温度下的变化。
记得哦，一定要保持耐心和细心，这样才能更好地掌握它的“秘密”。
我想说，这个嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂虽然小巧玲珑，但它的作用可不小。
它就像是我们生活中的一个小助手，帮助我们及时发现和应对高温环境带来的问题。
所以啊，大家在生活中一定要多多关注身边的环境温度，及时使用这个小侦探来帮助我们哦！好啦，今天的分享就到这里啦。
如果你对这个话题感兴趣的话，不妨也去探索一下这个小侦探的“秘密”吧！相信你们一定会有更多有趣的发现和收获哦！。
嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理
嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理1. 嗜热脂肪芽孢杆菌的基本概念在咱们聊这玩意儿之前，得先来个开门见山的介绍。
嗜热脂肪芽孢杆菌，听起来就像个高大上的名字，其实它就像那种总是爱在你身边的朋友，虽然不起眼，却能在关键时刻帮你一把。
这种菌儿可不是普通的细菌，它们特别耐热，能在高温下安然无恙地生存。
就好比在火锅里浸泡的豆腐，虽然被煮得咕噜咕噜的，但它还是屹立不倒。
它们常被用作生物指示剂，主要是帮助咱们检测消毒过程是否彻底，尤其是在高温高压的灭菌环境中。
1.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的特性说到嗜热脂肪芽孢杆菌，它们可真是个小能手，耐热性一流，能在121℃的高温下存活，这可不是随便什么细菌都能做到的。
想象一下，咱们在锅里煮东西，往往要调好火候，确保食物熟透。
可是，这小家伙偏偏能在火焰中如鱼得水，真是“火中取栗”的典型代表！这就让它成为了灭菌过程的“守护神”，帮助检测那些细菌杀不死的地方。
1.2 生物指示剂的作用提到生物指示剂，很多人可能会想，这到底是个什么神奇的东西？其实，它就是用来验证消毒或灭菌是否成功的一种工具。
就好比咱们用牙签戳蛋糕，戳出来没粘东西就说明熟了，戳出来粘乎乎的就得再烤一会儿。
而这嗜热脂肪芽孢杆菌就是这个“牙签”，通过观察它的变色来判断灭菌是否到位。
简单点说，它的变色就像是在给你发信号，“嘿，灭菌成功了，咱们可以放心用了！”2. 变色原理揭秘接下来，让我们揭开这神秘的变色原理吧。
这就像是一场化学魔法秀，究竟是怎样的“魔法”让这些小家伙在高温中变得五光十色的呢？2.1 pH变化引发的变色嗜热脂肪芽孢杆菌在高温下发酵时，会产生一些代谢产物，尤其是酸性物质。
这些酸性物质一旦进入培养基，就会导致培养基的pH值发生变化。
大家都知道，pH值就像是食物的酸甜口感，变化了自然就会影响颜色。
就像调料多了，菜的味道瞬间变了样，变得酸酸甜甜，特别美味。
而在我们的灭菌过程中，若pH值变了，培养基的颜色也会跟着变化。
这一变化就像是在向你招手，“灭菌成功，大家可以吃好料了！”2.2 颜色变化的信号说到颜色变化，真是让人兴奋。
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（一）食品工业应用的热杀菌方法分类与原理
2、从热源分类 1、从传热介质分类
电能 主要通过电能使发热器件发射红外或远红外（升温致死）
干热杀菌 干热杀菌介质一般为热空气（主要为氧化、蛋白变
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（二）食品热力杀菌技术
12、、食食品品热热力力杀杀菌菌技方术式
金属罐头 常压常杀温菌杀锅菌杀菌
预常装温食杀品菌的(Pa杀st菌eurization袋) 装食品 （巴氏杀菌60~100℃瓶）装食品
高压常水温浴杀锅菌杀菌 HTST杀喷菌淋隧(7道0~杀90菌℃,5~60S) UHT(1（38火℃焰,2杀~菌8S），效果属于
物理杀菌
非热力杀菌（主要采用电磁波、高静压、电场等方 法使食品中微生物致死的技术，目前大多还是处于 研发阶段的新技术）
食品除菌（采用膜分离手段将食品中微生物移除的 技术，已应用于液态食品如生啤、果汁饮料等除菌）
化学杀菌
通过发生化学反应达到杀灭微生物的方法。比较安 全的是臭氧杀菌、二氧化氯杀菌等方法。主要用于 水饮料的灭菌处理和工具消毒。属于非热力杀菌范 筹。
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二、食品的热力杀菌方法
热杀菌技术--将食品加热至可使蛋白质变性的温度(≥60℃)， 现代食品的热杀菌工艺由法国人Appert发明,已有200多
从而促使食品中的微生物体内酶系蛋白变性导致微生物死亡 年历史，经过各国长期的生产实践,拥有成熟的基础理论和 的方法。 装备。热杀菌工艺是现代食品工业发展的基础。
当利微用生穿物透被力紫很外强线的照α、射β时、，γ射其线细或胞电的子部束分辐氨照基食酸品和，核引酸吸 收起紫微外生线物，的产D 生N 光A 化损学伤作，用导，致引微起生细物胞死内亡成。分具特有别低是能核耗酸、、 原无浆污蛋染白、、无酯残的留化、学冷变加化工，等使优细点胞。质变性而电离导吸致收微单位生1物戈瑞死=亡1J/。kg
常温杀菌范畴)
利乐砖奶高、压饮高料温杀菌
无高菌温包杀装菌食(A品pp的eri杀zat菌ion) （阿氏杀菌＞100℃）
康美盒果(水汁蒸果汽冻杀菌) 耐热聚酯常瓶压饮高料温杀菌
管式杀菌 板式杀菌
(火焰或油浴杀菌)
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三、食品的非热力杀菌方法简介（非热效应）
12、紫辐外照线杀杀菌菌（（IrrUaldtriaatvioionleSttSerteilriizlaiztaiotnio）n ）
1）当细菌、病毒吸收超过3600~65000μW/c㎡剂量时，对 常用60Co-γ射线。当吸收剂量达到6~35 kGy时食品中的
细菌、病毒的脱氧核醣核酸（DNA）及核醣核酸（RNA）具 有病强原大菌破、坏腐力败。菌具有显著杀灭作用。已广泛用于肉类、水产、 果蔬2）、仅香适辛用料于的透保明鲜液或体杀食菌品处的理巴。氏目杀前菌全；国车已间建空成气和和投容产器的 表30面万消居毒里（以兼上有的形6成0C臭o辐氧照的中杀心菌有作5用8 座）。。
磁铁附近的磁感强度大约是0.4～0.7特 ） , 脉冲数15, 西瓜汁温度20 影℃响,微菌生落物总内数电和子大和肠离菌子群不数能可正达常到传果递汁；的2商）业影无响菌酶要分求子。构相 的扭曲和变形；3）食品分子形成电离效应，影响微生物代谢；
一、基本概念与分请或类列食举品一制些作生中涉活及中烹杀饪菌 操作的事例？
1、食品的杀菌—采用物理或化学手段处理食品，在尽量避免 降低食品品质和安全质量的前提下，使食品中污染的微生物完 全灭绝或部分灭绝的方法。
3
2、食品的杀菌方法分类
热力杀菌（通过升高温度使微生物致死的方法，是 目前最为普遍使用的常规方法，理论成熟、技术形 式多样）
广东省精品资源共享课程
食品工艺学
专题07
食品的商业杀菌 与商业无菌
主讲教师：钟瑞敏
英东食品科学与工程学院
学习内容 学习重点
第1、一热节力杀食菌与品非的热杀杀菌菌一与般除机菌理 方法 第2、二食节品酸度热、力水杀分菌活度微与生杀物菌工控艺制的理关论系 第三节 食品的商业无菌
2
第一节 食品的杀菌与除菌
将食品置于两个电极间产生的瞬间高压脉冲电场中， 由于国高内压外脉研冲究电人场员可使增用大高微压生脉物冲膜电电场位对差培，养使液膜中厚的减酵小母，、 各当类膜革电兰位氏差阴达性到菌临、界阳值性时菌，, 细细胞菌膜孢穿子孔在，苹改果变汁其、通香透蕉性汁，、 菠从萝而汁导、致牛微奶生、物蛋死清亡液。等进行了大量实验研究结果表明: 抑 菌效1果5～可1以00降k低V4/c~m6脉个冲lo电g,场其技处术理可时在间低一于般4在0℃几的个条微件秒下到实几 现 个对毫液秒体, 最物长料不的超灭过菌1。s, 处理后保鲜期提高到4~ 6周，并保持 食品原来的色、香、味及营养成。
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5、振动或脉冲磁场杀菌 （ Vibrating/Oscillating Magnetic Field Sterilization）
当磁力强度足够时 ，将食品放在N极与S极之间，经过连 续摆动西，瓜因汁磁：力最线佳切参割数导组致合食为品磁内场部强形度成7变. 5化9T的（感特应斯电拉流。，永1）
例如：在22~25℃下，100~450MPa可杀灭非芽孢菌（如 200MPa下荔枝汁可达到商业无菌的要求）；
但含有芽孢的低酸性食品却不易达到商业无菌的要求 （ 通常需在800~1000MPa下辅助热力杀菌方可）。
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4、高压脉冲电场杀菌（Pulsed Electric Field Sterilization ）
性和浓缩作用破坏微生物原生质致死）（如医用干 火焰 火焰主热要灭通菌过器加，热1空60气~1产70生℃的3热0-6空0m气in粒）子流传热
（升温致死）
湿热杀菌 湿热杀菌介质为水分子，或油脂等（主要为蛋白质变
微波
性致死） 微波主要通过食品吸收300-300,000MHz高频电磁波并在电场振
荡中引起介电分子运动产生热能（升温致死和电场致死）
放射物质核素的衰变活度单位(1居里= 3.7×1010次/秒原子核衰变)
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3、超on ）
采用100~1000MPa 的超高压对食品进行的杀菌处理。 超高压可影响物质的非共价键（氢键、疏水键），引起蛋 白质变性、脂肪结晶、淀粉糊化等而导致微生物死亡。