慢性毒性试验最新研究进展

・综述・慢性毒性试验最新研究进展△黎运西1,2,金小宝2,曾爱华2,苏小茹3,朱家勇2(11佛山市顺德第一人民医院检验科,广东佛山528300;21广东药学院基础学院病原生物研究所,广东广州510006;31广州中医药大学实验动物中心,广东广州510006)摘要:为了优化慢性毒性试验的研究方法与方案,更好地评价临床新药安全性,提高慢性毒性试验结果与临床试验的符合率,本文就实验模型动物的选择、检测方法、结果评价等方面的最新研究进展以及应该注意的问题进行综述,以总结如何提高实验可靠性和效率的方法与方案,使慢性毒性试验的研究结果更加符合药物的临床试验结果。

关键词:慢性毒性试验;药物研究;临床前研究学科分类代码:350 中图分类号:R96512 文献标识码:A 文章编号:1004-5775(2009)08-0583-04△基金项目:广东省产业技术研究与开发项目,2008B080703065　作者简介:黎运西,男,汉族,副主任检验师,病原生物学硕士研究生。

The Latest Advancement of Chronic Toxicity TestsLI Y un -xi ,J I N X iao -bao ,ZE NG Ai -hua ,et al 1(Department of Clinical L aboratory ,The First People ’s Hospital of S hunde of Fushan City ,Fushan 528300,China )Abstract :This paper reviews the chronic toxicity tests in viv o and provides several Approaches to im proving concordance between animal toxicity test and clinical trial to av oid the error 1F or exam ple ,the animals should be reas onablely chosen in toxicological study 1M oreover ,the suitable methods and techniques for animal toxicity tests were als o should be cho 2sen 1At last ,the results of animal toxicity tests should be correctly avaluated 1Through these m othods ,the accordance between the chronic tests and clinical trials could be maintained 1K ey w ords :Chronic toxicity test ;Drug study ;Preclinical study 慢性毒性试验等体内毒性试验已经被广泛应用于新药开发领域,但还存在很多问题,如动物的浪费严重、动物模型之间的差异;一些毒理学试验方法的不完善之处;在毒理学结果的安全性评价中,分不清有害效应和非有害效应;由于动物与人类的基因差异性所致的对毒性反应的差异而造成的错误评价等。

这些问题影响了动物毒性试验的准确率与效率。

因此,必须应用一系列的技术去克服这些问题。

本文综述了慢性毒性试验的一些方法,并提出如何应用新技术提高慢性毒性试验的准确率与效率,使其更加符合临床试验的结果并提高动物的利用率。

首先,是在慢性毒性试验中选择合适类型和数量的动物;其次,是选择合适的检测方法及技巧;最后,对毒理学动物实验结果进行合理而科学的综合性安全评价。

通过这些方法,提高慢性毒性试验的可靠性与效率。

1　实验动物类型及其数量的确定更加严格111　动物数量的确定随着欧盟号召取消短期的动物体内毒性试验,为了更符合人道主义和减少动物浪费,应尽更大的努力去减少实验动物的数量〔1〕。

但要用体外试验取代动物毒性试验,目前尚未成熟。

本文认为,发展完善地取代动物试验的毒理学试验技术,才是根本的出路。

而弄清毒性作用的靶点的细胞或分子机制,才能做到有的放矢。

但目前还要用有限的动物试验去证实体外试验的可行性。

当前,可以改进的是在许可的情况下减少动物使用数量。

例如,借鉴急性毒性试验的方法〔2〕,先用1个剂量受试物去试,再根据这个剂量的结果增或减剂量做其它剂量组。

因为这样可减少动物方面的研究开支。

112　选择符合实验要求的遗传背景一致的动物由于对化合物的耐受性不同,因而从相同剂量耐受性分析可以显示不同的个体对化合物的敏感性不同〔3〕。

另外,测试动物基因型会影响代谢、生物利用率和靶器官的敏感性;株或表型则会决定免疫反应的改变指标是否能被检测。

因此,必须根据实验的要求选择不同的遗传背景的动物。

113　选择合适的动物类型本文总结了常见毒理学试验动物类型优缺点(见表1)首先,水生环境毒物评价常用的是鲤科小鱼。

可以根据敏感实验或慢性实验分别选用胚胎和成熟鱼〔4〕;其次,慢性毒性试验普遍用的是S D大鼠模型。

在毒理学领域应用时间已较长,是较为成熟的模型。

另外,较新应用的是狨猴,由于抗原决定簇和受体与人更为接近。

在欧洲许多国家,狨猴已经被用作药物毒性与安全性评价的非啮齿类动物模型的第二类物种选择。

表1　各种毒理学试验动物模型的优缺点动物模型优点缺点鲤科小鱼样本数量多种间差别大实验重复性好不代表自然种群遗传性成熟鱼可作慢性试验S D大鼠易繁殖,发育快〔5〕与人的亲缘性比狨猴差有雄性繁殖效果数据库繁殖量大狨猴关养繁殖率高取血量少〔6〕性成熟早不作人生殖毒性评价〔7〕个体小不同个体胎盘形成上较相似适合作基因畸变的研究〔6〕用于研究移植免疫反应成分与人类亲缘性比犬类更近有抗人或狨猴的抗体有狨猴来源的基因蕊片2　检测方法更为先进在传统方法方面,主要有以下方法:211　毒物病理学方法对于需要查明组织或器官的功能状态的信息数据,如是否梗阻或液体平衡紊乱,或看精致的细胞联系是否完整以及细胞间隙等,则适合用毒物病理学的方法〔8〕。

212　测动物体重、食物消耗量和白细胞计数在毒性试验中,如果是抗癌药,除了在用受试物后测动物体重外,还可测白细胞计数〔9〕。

食物消耗量方面,有人测平均每只动物30d中总的食物消耗量〔10〕,而有的是测不同的周龄中每天平均每只大鼠的食物消耗量〔11〕。

本文认为:后者更能反映每周的不同变化,因而更为科学。

不同周中的每天食物消耗量最好与体重测定在同一天进行,因为这样能更好地反映在同一天中的动物状况。

213　使用受体结合模型法受体结合模型是风险评估的重要指示物,它能反映低剂量的毒性反应〔12〕。

这种方法,比上面两种方法显得更为敏感和特异。

214　应用化学混合物法用混合物作毒理学研究时,要检查多靶器官的反应情况,并弄清各种成分的作用机制,区分各种成分的毒性作用〔13〕。

在毒理学研究中,由于有很多是采用混合化合物的。

因此,应用化学混合物法进行毒理学研究,有很大的需求和前景。

但近年来,随着人类基因组技术的迅速发展,新兴起来一个新的学科—毒物基因组学,这个学科中的一些新方法,促进了毒理学研究向微观领域的发展。

例如,检测与毒性反应相关的基因表达。

研究者将毒性反应的组织学以及细胞学改变与基因表达改变相关联,以基因表达的上调和下调预测毒性反应的类型和严重性〔14,15〕。

国际毒理基因组学中心(NCT),计划在未来5年制定组织特异的基因表达标记。

从肝毒性开始研究毒性的基因表达数据,去探讨已知的毒理学机制和通路,是否与特征性的基因表达相关。

由于遗传多态性的存在,动物各亚群的易感性不同。

因此,要鉴别出涉及的特定的毒理学反应的基因,并确定其在目标人群中出现的频率以及如何定量,目前还要分析复杂的数据〔16〕。

同时,这类研究涉及道德及法律等问题。

因此,利用基因表达的数据进行毒理学评价,还要做很多的工作才能使其走上完善并应用。

例如,动物毒性反应的上调基因与人类是否相同,都是需要研究的。

使用基因表达的方法,将使毒理学研究的机制更为明晰,而且研究更为特异和具体,具有很好的发展前景。

3　实验结果的安全性评价更为科学首先,必须搞清楚与对照组的差异性是有相关性还是偶然误差。

因此,测量的精确度,检测指标的参考范围等,都是必须考虑的。

其次,判为有差异的效应,要进一步鉴别是无害效应还是不良效应(见表2)。

无害效应定义为不引起足以影响动物的一般健康、生长、发育和寿命改变的生化上、形态、或生理学上变化〔17〕。

表2　无害效应和不良效应鉴别效应类型效应特征效 应无害效应不显著的结果明显的剂量反应,评价终点以下的测量值,无生物学真性的值;没实际意义的结果适应性反应,暂时性反应,非特异效应,可逆效应;无联系的结果孤立或独立效应,非连续性效应,次要效应(体重和器官重量成比例下降),离群值不良效应血液不调肝毒性肾毒性肿瘤 这两种情况均与正常对照有显著性差异,但只有后者是有毒理学价值并值得毒理学专家关注的。

通过这些鉴别,可以降低风险评估研究的误差。

没有剂量相关性和趋势性的个别结果不是显著性毒性结果〔10,11,18,19〕。

有差异的结果应与对照组、历史对照以及14d恢复期的结果综合考虑,要结合其它相关指标和另一性别的实验动物的情况综合考虑,还要考虑在停用受试物后是否可恢复正常范围。

同时,还要避免受试物污染,才能确定有无毒理学显著意义〔11〕。

A G Schauss指出,器官重量变化是否有毒理学意义,还要结合组织形态学检查的结果〔19〕。

如果体重或摄食量的变化上的差异是短暂的,或者它们的变化趋势同步,即使血液检查指标与对照组相比有统计学意义,但不超过参考范围,且偏差在5%以内,也不认为是有害作用,而是正常生物学变异〔20,21〕。

此外,据AD Dayan报道,还要鉴别出应激的和非特异的效应〔22〕。

这些都是非毒性特异的效应,不能判为毒性不良反应。

另外,毒理学动物实验应结合人的流行病学调查数据进行综合评价〔23〕。

从有机溶剂对动物的毒性试验数据可以推断它对人类公共卫生的影响。

因为物种不同,并不影响对有机溶剂的效应的敏感性。

如果已知一种化合物对动物与人的效应的剂量关系,则可以根据这种化合物对动物的毒性试验数据推知其对人的毒性数据〔24〕。

但是,LT Habe指出,低剂量的职业暴露调查中未发现致癌性,而在高剂量的大鼠实验中却发现了致癌性,这可能是由剂量不同所决定。

因而大鼠实验和流行病学调查在受试物的致癌性的毒理学研究中,缺一不可〔25〕。

由于毒理学动物实验与人的流行病学统计不一致〔26〕,而据Rafael M ore-Eras or的观点,目前还是支持要进行人体的接触研究,以确定对人体是否真的致癌〔27〕。