专业实验III 临床免疫检验
临床免疫学和免疫检验
临床免疫学的重要性
01 02
疾病诊断与治疗
临床免疫学为许多疾病的诊断和治疗提供了理论基础和实践指导。例如， 通过对免疫系统的深入研究，开发出了针对肿瘤、感染性疾病、自身免 疫性疾病等的免疫疗法。
疫苗研发
疫苗的研发是临床免疫学的重要应用之一。通过了解免疫系统的应答机 制，可以设计和优化疫苗，提高预防传染病的效果。
实现免疫检测的远程监控和实 时反馈，提高检测的便捷性和 及时性。
发展新型免疫检测技术
探索新的免疫检测方法和技术，如量子点、纳米材料等新型标记物，提高免疫检测 的灵敏度和特异性。
结合生物信息学、基因组学等技术，开展多组学免疫检测，实现更全面的免疫功能 评估。
开发新型的免疫细胞分析技术，如流式细胞术、质谱技术等，对免疫细胞进行更深 入的分析和鉴定。
肿瘤的免疫诊断与治疗
肿瘤标志物检测
通过检测肿瘤标志物，有助于早 期发现肿瘤并监测治疗效果。
免疫组化染色
通过免疫组化染色技术，有助于确 定肿瘤的性质、来源和分化程度。
免疫治疗
利用免疫系统对肿瘤进行特异性攻 击，如免疫检查点抑制剂、CAR-T 细胞疗法等，为肿瘤治疗提供了新 的手段。
自身免疫性疾病的诊断与治疗
详细描述
化学发光免疫分析通过化学发光物质标记抗体或抗原，在催化剂的作用下产生化学发光，通过检测化 学发光强度对目标抗原或抗体进行定量或定性分析。该技术具有高灵敏度、高特异性和低背景干扰等 优点，广泛应用于临床诊断和生物科学研究。
免疫印迹技术
总结词
一种用于检测多肽、蛋白质和核酸等生物大分子的免疫分析 技术。
优化免疫检测方法，如采用信号 放大技术、酶联免疫技术等，以
提高检测的灵敏度和特异性。
临床免疫学检验 名词解释&重要知识点 (上)
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。
在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。
抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。
当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
临床免疫学检验(五年制医学检验专业适用)
绪论Δ基础免疫学理论相关内容：抗原、抗体、补体、细胞因子、HLA、免疫系统、免疫应答Δ临床免疫学抗感染免疫、超敏反应、自身免疫、肿瘤免疫、移植免疫Δ免疫学实验技术免疫学检验抗原抗体反应Δ抗原抗体反应：高度特异性体内：体液免疫效应体外：血清学反应(沉淀反应、凝集反应、补体参与的溶血反应、补体结合试验、中和试验、免疫标记技术)Δ原理内因：Ag、Ab能特异性结合外因：Ag、Ab结合的动力①静电引力（库仑引力）②范德华力（电子云力）小于静电引力③氢键大于范德华力④疏水作用力（作用最大）Δ盐析：在高浓度电解质（如NaCl）存在的条件下，NaCl可先与Ab分子结合（在Ab 未与Ag相遇时），排斥H2O分子，从而使Ab蛋白质优先沉降Δ特点：1.特异性：交叉反应（cross-reaction）：抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应。
先决条件：存在共同Ag表位意义：①免疫学诊断：外斐氏反应——用变形杆菌OX19、OX2、OXk做抗原查血清抗体，诊断斑疹伤寒（立克次氏体感染所致）②免疫病理损害（Eg：链球菌感染后易导致肾小球肾炎，原因是链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致）2.最适比例Ab过剩，前带（可溶性抗原抗体复合物）Ag过剩，后带（可溶性抗原抗体复合物）Ab、Ag合适比例沉淀物等价带（沉淀物）Δ抗体（等价带范围不同）R型抗体家兔免疫血清较宽大多数小动物H型抗体马免疫血清较窄人和多数大动物3.可逆性：Ag+Ab AgAb原因：非共价键结合，不是化学反应Δ影响因素自身因素：①Ag：理化性质、抗原表位数目及种类②Ab：来源（R型or H型）、特异性、亲和性、浓度外界环境条件：①电解质：0.9%NaCl，if浓度过高，会盐析②pH：6~8，if小于3，酸凝集；过高，碱变性③温度：37℃沉淀反应及免疫电泳Δ颗粒型抗原凝集反应eg：细菌、RBCΔ可溶性抗原沉淀反应eg：血清蛋白溶液、多糖抗原Δ沉淀反应（precipitation reaction）：可溶性抗原与相应抗体结合，在电解质存在，两者比例恰当时，可出现肉眼可见的沉淀现象Ag：沉淀原Ab沉淀素实验中为使抗原抗体比例（数量）恰当，应稀释AgΔ分类①液相沉淀：絮状沉淀、环状沉淀、免疫比浊测定②凝胶扩散：双扩、单扩③凝胶免疫电泳：免疫电泳、对流免疫、火箭免疫Δ絮状沉淀试验出现絮状/块状沉淀玻片法：检测病毒（定性）试管法：方阵滴定（半定量）Δ环状沉淀反应测抗原（法医血迹鉴定）Δ免疫透射浊度测定法检测IgG、IgA、IgM、C3Δ凝胶扩散（agar immunodiffusion）：可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下，在琼脂基质中扩散，当两者相遇，比例恰当时结合，可出现肉眼可见的沉淀线Δ双扩（double immunodiffusion）原理：可溶性抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自向四周凝胶中扩散，当二者相对应时即发生特异性反应，在浓度比例合适处形成可见的白色沉淀线方法：①制琼脂板（3ml 1.5%NS琼脂）②打孔（双孔型/三角孔型/梅花孔型）③加样（平孔沿加满）④扩散（37℃，24h观察结果）用途：①双孔型：已知Ag测未知Ab，or已知Ab测未知Ag②三角孔型：抗原性质分析③梅花孔型：测Ag有效稀释度优点：简单、易行、用途广缺点：敏感性低、出结果慢、只定性，不能定量Δ单扩（single immunodiffusion）原理：将一定量抗体混浇于琼脂内，置于凝胶孔中的定量抗原向四周扩散，抗原与相应抗体在比例合适处形成白色沉淀环，其大小与抗原浓度成正比方法：①已知抗体+琼脂制板，打孔②在琼脂板小孔中加梯度抗原③抗原向四周扩散形成沉淀环④抗原浓度与沉淀环直径呈线性关系，绘制标准曲线⑤从标准曲线上查出并计算出待测标本含量用途：定量测定IgG、IgA、IgM、C3等含量Δ影响电泳的因素①溶液的pH，常用8~9，蛋白质带负电②溶液的离子强度，越高，泳动慢，一般0.02~0.2M③电场强度，越高，越快，一般4~6V/cm（琼脂长），约40V左右④电渗作用：电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象，电渗方向与电泳方向相反Δ对流免疫电泳（counter-immunoelectrophoresis）原理：定向加速的免疫双扩（双扩+电场，使抗原、抗体相对泳动）方法：Ag、Ab分别在琼制板上不同孔内，Ag在负极，Ab在正极，电泳电压：4~6V/cm（琼脂长度）时间：45分钟~1小时pH：8.6用途：检测HBsAg、AFP优点：耗时短、反应敏感性强Δ免疫电泳（immunoelectrophoresis）原理：Ag区带电泳+双扩结合方法：①Ag电泳分出区带②Ag、Ab免疫双扩用途：分析复杂Ag的组分（人全血清组分的分析）、多发性骨髓瘤等疾病的测定优点：用样品量小，特异性高、分辨力强凝集反应Δ凝集反应（Agglutination）细菌、细胞等颗粒性抗原悬液加入相应抗体，在电解质存在下，两者特异性结合，出现肉眼可见得凝聚块Ag：凝集原Ab：凝集素凝集反应应稀释抗体Δ沉淀试验和凝集试验的比较抗原性质可溶性Ag 颗粒性Ag稀释对象抗原抗体结果现象沉淀现象凝集现象敏感性低高Δ分类：直接凝集反应玻片法试管法间接凝集反应（正向）间接（血、胶乳）凝集试验反向间接（血、胶乳）凝集试验间接凝集抑制试验协同凝集试验Δ直接凝集反应（direct agglutination）细菌、螺旋体、细胞等颗粒性抗原（抗原时细胞表面结构）在适当电解质参与下，直接与相应抗体结合，出现肉眼可见的凝集现象Δ玻片法与试管法的区别玻片法试管法原理已知抗体测未知抗原已知抗原测未知抗体的效价定性半定量用途ABO血型鉴定肥达氏反应菌种鉴定外斐氏反应Δ间接凝集反应（indirect agglutination or passive agglutination）将可溶性抗原或抗体吸附在某种载体微球上，使之成为颗粒性抗原或抗体，然后再与相应的抗体或抗原结合，出现载体微球的凝集现象载体的要求：不干预免疫反应、颗粒大小均匀常用载体种类：红细胞（绵羊、家兔、人O型）聚苯乙烯胶乳颗粒（人工合成高分子材料）等活性炭粒、、硅酸铝颗粒Δ致敏微粒/致敏颗粒：吸附有抗原或抗体的载体颗粒Δ间接凝集试验命名（根据载体不同）血凝试验（以RBC为载体）乳胶凝集试验（以胶乳颗粒为载体）Δ（正向）间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知的可溶性抗原吸附于颗粒性载体上，检测未知抗体Δ反向间接（血、胶乳）凝集试验原理：将已知抗体吸附于颗粒性载体上，检测未知抗原实例：检测HBsAg、AFP等Δ间接凝集抑制试验原理：待测样本（可溶性Ag？）+已知Ab +已知致敏Ag颗粒（已成为颗粒性Ag）观察是否有凝集现象（不凝集为阳性，凝集为阴性）实例：检测小便中绒毛膜促性腺激素（HCG）Δ协同凝集试验（coagglutination）原理：实质为反向间接凝集反应实例：葡萄球菌A蛋白（SPA）能非特异性地与IgG的Fc段结合，当与特异性抗原相遇时，IgG的Fab段与抗原结合，出现金葡菌的凝集现象（属特殊间接凝集试验）用途：用已知抗体检测未知抗原，用于多种抗原的检测免疫标记技术Δ免疫标记技术的原理用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少免疫标记技术=免疫技术+标记技术免疫技术：抗原抗体反应（特异性）示踪物标记：酶、荧光素、同位素（灵敏性）特点：高特异性、高灵敏性Δ分类免疫标记技术放射免疫技术酶免疫组化技术双抗体夹心法免疫酶技术竞争抑制法免疫荧光技术酶联免疫吸附技术双抗原夹心法其他标记技术间接法双位点一点法Δ常用标记物荧光素、酶、同位素、胶体金、可发光化学物质Δ免疫荧光技术（IF）免疫荧光显微技术（定性）免疫荧光测定技术（定量）原理：用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原Δ常用荧光素异硫氰酸荧光黄（FITC）黄绿色四乙基罗丹明（RB200）橘红色四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）橙红色Δ荧光显微镜主要组成A. 白炽光源（超高压汞灯）紫外光or兰紫光B. 两组滤光板激发滤板激发光谱抑制滤板抑制紫外光or兰紫光，只许荧光通过C. 显微镜普通光学显微镜or兰紫光——激发滤板——紫外光——被检物（荧光染色标本）—荧光——抑制滤板——荧光（我们肉眼见）Δ一般免疫荧光显微技术均标记抗体Δ片子制作：切片、涂片、印片Δ荧光抗体染色法①直接法：待测标本固定（Ag？）+*Ab——*AgAb用途：检测抗原优点：快，直接，干扰因素少缺点：每检测一种抗原要标记一种荧光抗体，较麻烦②间接法（用得最多）Step1：荧光素标记抗抗体（如荧光素标记的羊抗人IgG）Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）——洗，+荧光标记的抗抗体——洗，荧光显微镜镜检优点：①制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测②灵敏度高③补体法Step1：荧光素标记抗补体Step2：已知Ag固定+待测标本（Ab？）+补体——洗，+荧光标记的抗补体——洗，荧光显微镜镜检优点：灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多种检测缺点：干扰因素多，补体不稳定，易失活，该法少用④双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光Δ免疫荧光显微技术优缺点优点：①特异性、敏感性高②快速③可定位④既可测Ag又可测Ab缺点：①需要荧光显微镜②存在非特异荧光干扰（原因是自发抗体不纯，交叉反应、技术问题）③定性测定、判断结果不客观④制备片子难保存（荧光猝灭）Δ时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕（Eu）等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测标本中相应Ag或Ab的新技术特点：①利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光②灵敏度可达0.2~1ng/ml免疫酶技术Δ优点：较IF、RIA更优越，敏感、安全、稳定、易观察结果Δ原理：利用酶标记Ag或Ab后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ag、Ab）有无及含量多少Ag+AbE——AgAbE+底物呈色反应Δ特点特异性：Ag、Ab反应敏感性：酶的高效催化作用Δ分类酶免疫组织化学染色技术（免疫组化）酶免疫测定法（酶联免疫吸附试验，ELISA）Δ常用的酶辣根过氧化物酶HRP：铁卟啉蛋白质，能进入细胞内，酶活性强，酶结合物可长期保存，最适Ph为5.5左右碱性磷酸酶葡萄糖氧化酶Δ纯度：RZ：反映酶含量与蛋白含量之比（最好RZ为3.0左右）Δ活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mgΔ底物系统：供氢体、受氢体ΔHRP的底物邻苯二胺（OPD）反应体系中作为供氢体：DH2+H2O2D+2H2O供氢体受氢体有色产物特点：有色产物为黄色，空白对照接近无色，敏感度高，有致癌作用四甲基联苯胺（TMB）特点：有色产物为蓝色，无致癌作用酶联免疫吸附试验（ELISA）Δ原理将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量Δ有关术语及试剂包被（coat）：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附包被后不能被洗脱包被缓冲液：pH：9.6CB（碳酸盐缓冲液）洗涤（wash）：pH：7.2~7.4PBS（磷酸盐缓冲液）酶结合物：酶标抗体或酶标抗原终止液：2M H2SO4OPD（邻苯二胺）：酶催化后有色产物为黄色，H2SO4终止后橙色（棕色）TMB（四甲基联苯胺）：酶催化后有色产物为蓝色，H2SO4终止后黄色Δ步骤包被已知Ab——洗涤——加待测标本（测Ag？）——洗涤——加酶标Ab——洗涤——加底物——加终止液——观察结果Δ用途检测抗原，包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体，每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦Δ步骤包被已知Ag+待测标本（测Ab？）——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液，观察结果Δ用途测抗体，每标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测双位点一步法Δ步骤包被抗体A+待测标本+酶标抗体B——洗涤，+底物——终止液，观察结果Δ用途检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位竞争法Δ步骤待测管：已知Ab包被+待测标本（Ag？）——洗涤，+酶标Ag——洗涤，+底物——显色应用亲和素和生物素的ELISA亲和素（avidin）糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合生物素（biotin）维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定生物素生物素亲和素生物素生物素ΔELISA结果的判定①肉眼判定：与阳性、阴性对照颜色比较若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性若待检孔显色深于或等于阳性对照则判定为阳性若待检孔显色介于阴性与阳性对照之间则判定为弱阳性②酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法与阳性、阴性对照测定值比较P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性P：positive（待测吸光度值）N：negativeΔELISA试验的影响因素（一）固相载体常用：聚苯乙烯特点：吸附Ag或Ab的能力强，一旦吸附后，不能被洗脱形状多——试管、珠、微孔板（酶标板）、分软、硬板（最常用）一次性使用，不可回收酶标板要求：吸附性能好、空白值低、透明度高、板批间、孔间性能相近（二）抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化（三）试验条件1. 包被：一般用pH9.6CB，0.05M，有利于蛋白质吸附浓度：0.1~100ug/ml，常用10ug/ml时间、温度：4℃过夜或37℃，1~3h量：100ul封闭：用0.1~5%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时2. Ag-Ab反应的条件①微碱性有利于Ag-Ab结合，故用pH7.4PBS洗涤②去污剂有利于Ag-Ab形成，洗液中加0.05%Tween-20③Ag、Ab反应时间、温度：37℃、40min3. 洗涤采用pH7.2~7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡1~2min，拍干，共洗涤3~4次4. 酶促反应条件温度：37℃时间：10minpH：5.5底物量：一致5. 排除干扰：多设对照ΔElISA应设哪些对照，why？阳性对照：排除假阴性；阴性对照：排除假阳性；酶结合物对照：加酶步加入，无色；底物对照：步加入，无色；空白对照：只加终止液，无色Δ膜载体的酶免疫测定斑点-ELISA：特点，固相载体为硝酸纤维素膜，酶促反应后在膜上形成有色沉淀物免疫印迹法（IBT）Δ应用（所有标记技术）病原体的诊断及研究①病毒、细菌等传染病的诊断（测抗原或抗体）②病毒、细菌表面抗原的研究某些疾病的诊断①某些微量物质有关疾病的诊断②肿瘤的诊断及定位③自身抗体检测协助自身免疫病诊断④寄生虫疾病的诊断等免疫学方面的研究T、B细胞的发生、演化、表面抗原改变等的研究微量物质的检测体内：微量蛋白质、激素、酶等抗原；药物、糖等半抗原工农业：微生物、微量物质等化学发光免疫分析技术Δ发光免疫技术是将发光系统与免疫反应相结合，来检测抗原、或抗体的方法Δ化学发光免疫测定化学发光酶免疫测定（CLEIA）试验前部分与ELISA一样，改变所加底物，使产物能发光，用仪器检测发光强度，判断结果（如酶是用辣根过氧化物酶，常用底物是鲁米诺或其衍生物）化学发光标记免疫测定（CLIA）是用化学发光剂作为标记物直接标记抗原或抗体的免疫测定方法金免疫技术Δ采用胶体金作为标记物Δ胶体金：又称金溶胶，是金盐（氯金酸）被还原（还原剂：柠檬酸钠）成原子金后的金颗粒悬液Δ胶体金的特性①胶体性质：颗粒稳定均匀，分散悬浮，1~100nm②呈色性：颜色与颗粒大小有关2~5nm，橙黄色；Δ原理采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反Δ原理以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析Δ用金标记免疫法（斑点免疫层析试验）测HCG的原理对于HCG阳性标本，尿中HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体结合而聚集显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；对于HCG阴性标本，尿中无HCG与金标记的鼠抗人HCG单抗结合形成免疫复合物，随层析作用向上移动，至检测线与鼠抗人HCG抗体不结合而不显色，在检测线未结合的金标记鼠抗人HCG单抗（IgG）随着尿液上行，到达质控线与羊抗鼠IgG（二抗）结合而显色，作为质控对照；若试纸条无效，金标鼠抗人IgG单抗随层析作用向上移动，到达质控线，无羊抗鼠IgG（二抗）或破坏失效，不结合而不显色，作为质控对照免疫血清的制备Δ概述免疫血清：含有某种抗体的血清。
临床常用免疫学检验
〖临床意义〗 1. IgE增高：见于IgE型多发性骨
髓瘤、特应性哮喘、特应性皮炎、过敏 性鼻炎、寄生虫感染、热带嗜酸细胞增 多症、SLE、RA及某些霉菌病等。
2. IgE减低：一般无意义。可见于 原发性无丙种球蛋白血症、恶性肿瘤及 细胞毒药物治疗后。
〖注意事项〗 年龄、性别均可影响总IgE水平。一
〖参考值〗 依年龄、性别、地区等因素有 差异。
IgG： 6.94－16.18g/ L IgA： 0.68－ 3.78g/ L IgM： 0.60－ 2.63g/ L 〖临床意义〗 1. Ig 含量减低：一种或多种Ig 水 平减少，分原发性和继发性。见于各种先 天性或获得性免疫缺陷病。继发性常与免 疫抑制剂应用、射线、蛋白质丢失、营养 不良等有关。也可见于细胞毒药物治疗后。
一些专家认为，目前应用的实验室检查项 目，在临床应用前并未给予充分的评价。 Jaeshke等认为，判断一项诊断试验是否 有用的最终标准是：试验是否增加了有用 的诊断信息。Burke认为,如果一项试验主 要用于筛检，其敏感性一定要高，但易出 现假阳性。任何新的检验只有在充分评价 其可靠性、准确性后才能用于临床实践。 而现实是，由于制造商的热情提供试剂、 临床医师和检验人员的欣然接受含量因检测方法不同而有差别，各地 区参考值也不相同，在判断结果时应综 合考虑。如有“M 蛋白”，可进一步作 血清或尿液免疫电泳，检测轻链和重链。
二. 血清总IgE测定 IgE为血清中含量极少的一种免疫球蛋白，
与过敏性疾病和寄生虫感染有关。目前检测 方法有多种，包括 ELISA、间接血凝试验 （indirect hemoagglutination assay IHA ）、 RIA、电化学发光法 （electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA，）、IFA 等。 〖参考值〗 0.1-150IU/ml
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第三章免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
《临床免疫学检验》教学大纲
《临床免疫学检验》教学大纲课程类别：专业核心课程课程性质：必修英文名称：Clinical immunology examinations总学时：96 讲授学时：48 实验学时：48学分：4.5先修课程：仪器分析、人体解剖学、组织学与胚胎学、生理学、细胞生物学、病理学、病理生理学、药理学、生物化学、医学免疫学、病原生物学、医学遗传学、分子生物学、临床生物化学检验。
适用专业：医学检验技术开课单位：医学院一、课程简介临床免疫学检验是研究免疫系统功能异常与相应疾病发病机制及其诊断和防治措施的科学。
通过学习本课程，使学生获得免疫功能异常所致的病理过程及其机制以及免疫学理论和技术在疾病预防、诊断和治疗中的应用等方面的基本知识。
同时结合教学实践，培养学生分析问题和解决问题的能力以及严谨的科学作风。
二、教学内容及基本要求第一章临床免疫学与检验概论（1学时）教学内容：1.1 免疫学技术概论1.2 临床免疫性疾病及检验概论教学要求：1.了解免疫学技术在医学中地位和应用；了解免疫学技术的发展简史。
2.了解临床免疫学及其检验在医学中的作用。
授课方式：讲授第二章抗原抗体反应（1学时）教学内容：2.1 抗原抗体反应的原理2.2 抗原抗体反应的特点2.3 影响抗原抗体反应的因素2.4 免疫学检测技术的类型教学要求：1.掌握抗原抗体反应的原理。
2.掌握抗原抗体反应的特点。
3.掌握影响抗原抗体反应的因素。
4.掌握免疫学检测技术的类型。
授课方式：讲授第三章免疫原和抗体的制备（2学时）教学内容：3.1 免疫原的制备3.2 免疫血清的制备3.3 单克隆抗体的制备3.4 基因工程抗体的制备教学要求：1.掌握颗粒性抗原的制备和半抗原的制备；了解可溶性抗原的制备。
2.掌握免疫血清的制备。
3.掌握单克隆抗体的概念；掌握B细胞杂交瘤技术的基本原理。
4.掌握基因工程抗体的概念；了解基因工程抗体的制备。
授课方式：讲授第四章凝集反应（2学时）教学内容：4.1直接凝集反应4.2间接凝集反应4.3抗球蛋白试验教学要求：1.掌握直接凝集反应的原理和应用。
临床免疫学检验重点
一：名词解释1免疫学（immunology）：是研究免疫系统的结构与功能，并通过对其在免疫应答过程中所产生的免疫保护与免疫损伤机制的研究，探讨有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学科学。
2免疫球蛋白（immunoglobulin）：是B细胞经抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等液体中，约占血浆蛋白总量的20%，IgG能与相应抗原特异性结合，执行体液免疫功能。
3补体（complement）：是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组经活代后有酶活性的蛋白质，包括30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白，故称为补体系统。
4细胞因子（cytokine）：是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的总称。
大多数细胞因子是低分子量的蛋白或糖蛋白。
5临床免疫学（clinical immunology）：是将免疫学基础理论，临床疾病与免疫学技术相结合，用于研究疾病的免疫病理机制，诊断与鉴别诊断，评价治疗效果和判断预后的多个分支学科的总称。
6亲和性（affinity）：是指抗体分子上的一个抗原结合点与一个相应抗原表位之间的结合强度，抗原抗体的亲和性取决于两者空间构型的互补的程度。
7亲和力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，亲和力与亲和性，抗体的结合价，抗原的有效抗原表位数目有关。
8免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
9半抗原（hapten）：是指仅有抗原性而无免疫原性的物质。
10免疫佐剂（immunoadjuvant）：预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，简称佐剂。
11凝集反应（agglutination reaction）：是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原的颗粒性载机与相应抗体特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
检验科免疫室检验项目
检验科免疫室检验项目介绍免疫学是研究机体对抗感染、肿瘤和自身免疫疾病等相关免疫反应的学科。
在医学领域中，免疫学在临床诊断和治疗方面起到了重要的作用。
检验科免疫室是一种具备先进设备和技术，可以进行免疫学检验的专门实验室。
免疫学检验是通过检测机体的免疫反应、抗体和细胞因子等指标来评估机体的免疫状态和判断是否存在免疫相关的疾病。
在免疫室中，进行免疫学检验需要掌握一系列的技术和方法，以确保准确的检测结果并为临床提供可靠的依据。
检验项目分类1.免疫系统功能检测–淋巴细胞亚群分析：通过流式细胞仪等设备检测T细胞、B细胞和NK 细胞等亚群的数量和比例，评估机体免疫系统的功能状态。
–免疫球蛋白测定：检测血清中的免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM等）的水平，评估机体的免疫功能。
2.自身免疫病检测–自身抗体检测：检测血清中是否存在抗核抗体、抗磷脂抗体等，用于早期诊断和监测自身免疫疾病（如系统性红斑狼疮、抗磷脂抗体综合征等）的发展。
–自身抗原检测：通过检测血液或其他组织中的自身抗原（如RF、ANCA等）的水平，用于诊断和评估自身免疫性疾病。
3.传染病相关检测–病原体抗体检测：通过检测血清中的病原体特异性抗体，如HIV抗体、乙肝病毒抗体等，用于确认感染病原体和分析感染状态。
–免疫反应性蛋白检测：通过检测病原体特异性的免疫反应蛋白（如流感病毒抗原、白喉杆菌抗原等），用于早期诊断和监测传染病的发展。
具体检验技术1.免疫层析法–检测原理：利用抗体与抗原发生特异性结合反应，通过检测反应后的彩色条带来判断样本中抗原或抗体的存在与浓度。
–应用范围：常用于一些便携式检测仪器或试纸上，应用于快速检测一些常见的传染病等。
2.酶联免疫吸附试验（ELISA）–检测原理：利用酶标抗体或酶标抗原与待测物特异性结合，通过底物的化学反应生成染色产物，利用光密度计读取并判断待测物的浓度。
–应用范围：广泛应用于抗体和抗原的检测，如HIV抗体检测、肿瘤标志物检测等。
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可能作为名词解释来考的以红色标注抗血清的制备【原理】：用抗原刺激机体可以产生抗体，抗原的性质、纯度和活性影响其免疫动物后获得的抗体的的特异性和效价。
在体外有目的的制备抗原，经初次、再次免疫的过程可以获得高质量的抗体。
【注意事项】①制备佐剂时，一定要顺着同一方向用劲磨。
②检查油包水的方法：培养皿内加水，滴入混匀液，不散开即可。
如果第1次检查不合格，第2次检查必须重新倒水在平皿。
③免疫动物皮内注射时，可以在足垫、腋下、背部等处多点注射，总剂量1ml/只。
凝集反应颗粒性/ 可溶性Ag（Ab）与载体颗粒结合成的致敏颗粒，与相应Ab（Ag）发生特异性反应。
在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。
一、直接凝集反应：颗粒性Ag，与相应Ab直接结合。
在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。
（1）玻片法凝集反应：【原理】：颗粒性Ag（细菌、红细胞等）与相应Ab直接结合，在一定条件下，形成肉眼可见的凝集现象。
【意义】：①定性试验，可用已知抗体的诊断血清来测未知的抗原。
②可用于细菌分型、ABO 血型鉴定等。
【结果观察】：①对照区不发生凝集，为均匀浑浊的乳状液。
②试验区，伤寒菌液（Ag）与相应的Ab发生反应，出现肉眼可见的凝集块，为阳性。
如与对照相同则为阴性。
（2）试管法凝集反应：【原理】：用已知细菌作为一定浓度的悬液Ag，与一系列稀释的受检血清混合，经静置保温后观察每管内颗粒性Ag的凝集程度。
【结果观察】：①先看对照管，应无凝集现象，轻摇试管，细菌分散均匀，混浊。
再从第1管开始看。
②根据凝集度打“+”。
—：管底无沉淀,液体混浊，细菌分散均匀。
++++：管底有沉淀,上液澄清，细菌全部凝集。
+++：管底有沉淀,液体稍混, 细菌1/4不凝集。
++: 管底有沉淀,液体混浊，细菌1/2不凝集+: 管底仅少量有沉淀,液体混浊。
效价判断：以出现“++”凝集的最大稀释度，为该血清的凝集效价。
二、间接凝集反应：必须借助颗粒性载体，将可溶性Ag（Ab）致敏载体，成致敏颗粒，再检测标本中相应的Ab（Ag）。
间接凝集反应（胶乳凝集抑制试验）：【定义】间接凝集反应：将可溶性Ag挂在一个无关免疫的载体(聚苯乙烯胶乳)上，制备成颗粒Ag,与其相应的Ab相结合,为间接凝集反应。
以检测尿中HCG为例：阳性：尿含HCG+抗HCG →+HCG胶乳颗粒→不凝集阴性：尿不含HCG+抗HCG →+HCG胶乳颗粒→凝集沉淀反应【定义】：可溶性Ag + 相应Ab →形成肉眼可见的沉淀物质（Ag-Ab复合物）一、对流免疫电泳【原理】：利用电场的作用加强和加快双向扩散的一种方法。
在pH8.6的碱性缓冲液琼脂中进行电泳，带有较多负电荷的Ag泳向阳极，而Ab球蛋白等电点偏高（约为6--7），在pH8.6时带负电荷较少，加上分子量较大，泳动慢，受电渗（指电场中液体对固体支持物的相对移动）干扰后向阴极倒退，这样抗原抗体作相对运动，在较短时间内即可相遇，在孔间两者分子比例合适的地方形成沉淀线。
【意义】：对流免疫电泳主要用于检测标本中的抗原如AFP、HBsAg等。
本法较双向琼脂扩散时间大为缩短（一般只需30分钟到1小时），且灵敏度比双扩高约数十倍。
沉淀线的位置与Ag、Ab分子电荷情况有关，也与Ag、Ab比例有关。
有沉淀线为阳性，无沉淀线为阴性。
【特点】优点：操作简便，观察结果快，敏感度比双扩高8-16倍。
缺点：分辨率差，当有多种Ag、Ab 系统存在时，形成的沉淀线位置易重叠，难以分辨，所以用此目的时，不如双扩。
二、双向琼脂扩散实验【原理】：定性试验。
将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，抗原抗体从孔内向四周扩散，在两者对应比例适宜处形成沉淀线。
【意义】：可用已知抗原（抗体）来检测未知的抗体（抗原），同时检测抗原抗体的纯度。
临床上常用来检测甲胎蛋白（AFP），作为原发性肝癌等的辅助诊断。
【结果判断】：①在阳性对照孔与中间的抗体孔之间出现一条或多条白色沉淀线（一对抗原抗体系统即可出现一条沉淀线，如有多对抗原抗体可出现多条沉淀线）。
②观察标本孔与中间的抗体孔之间有无出现沉淀线，有即为阳性，无即为阴性。
以上两实验的注意事项：①浇琼脂板时注意动作要迅速，琼脂不要溢出玻片，成品琼脂板平整无气泡，打孔时，不要将琼脂划破；②加样时，不要溢出孔外；③加样用的枪头不要混用。
三、免疫电泳【原理】：区带电泳后进行双相琼脂扩散实验。
将待测标本置于琼脂凝胶中电泳，样品中各蛋白成分因分子量及电泳迁移率不同，被分成肉眼不可见的若干区带。
电泳结束后，沿与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清，置室温或37度使两者扩散。
18-24h后，各区带蛋白与相应的Ab在相应的位置上形成弧形沉淀线。
Ag越多，沉淀线越靠近Ab槽，其沉淀线越粗，可做细微的蛋白质组分分析，仅为定性实验。
【用途】：定性实验，主要用于纯化Ag和Ab成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别和鉴定等方面。
【注意事项】：①开槽处距玻片边缘>5mm,开孔处>7.5mm。
②槽中加抗血清时，加满即可，切忌溢出。
四、单向琼脂扩散电泳【原理】：单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定量试验。
一般是用已知抗体测定未知量的相应抗原。
定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适条件下，形成乳白色的沉淀环。
沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体）的量。
【意义】：单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定。
以上两实验的注意事项：制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制。
温度太低会导致琼脂凝固，太高将影响所加抗体的活性。
加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。
ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）该技术基础是抗原或抗体固相化和酶标记的抗体或抗原，固相化和酶标记的抗原抗体仍保持其免疫活性。
在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量有一定的比例，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
常用的ELISA的方法有：间接法、夹心法、竞争法乙肝两对半：乙型肝炎病毒抗原→人体产生的相应抗体HBsAg →HBsAb 、HBeAg →HBeAb 、(HBcAg) →HBcAb大三阳：HBsAg，HBeAg，HBcAb阳性。
小三阳：HBsAg，HBeAb，HBcAb阳性。
【实验目的】：定性或定量测定人血清或血浆中乙型肝炎病毒表面抗体（抗HBs),可用于判断乙型肝炎疫苗接种效果和乙型肝炎病毒感染的治疗效果和预后情况。
【实验原理】：双抗原夹心法检测人血清或血浆中的抗-HBs（一步法）。
采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP进行孵育，当标本中存在抗-HBs时，该抗体与包被HBsAg结合并与酶结合物形成HBsAg—抗HBs—HBsAg—HRP复合物。
洗去游离反应物，加入显色剂后，将有明显颜色变化。
若标本中无抗-HBs时，加入底物后没有或只有很轻微的颜色变化，在一定范围内，颜色的深浅变化与标本的含量呈正比。
【结果判断】未加终止液前，阳性孔呈蓝色，阴性孔和空白孔无色，标本孔如呈蓝色即为阳性，颜色深浅与标本中的抗HBs量呈正比。
加终止液后，蓝色转为黄色，放入酶标仪中检测，使用OD450-492nm波长测定OD值，计算cutoff值，读数需在终止反应后１０分钟内完成。
cutoff值：COV=阴性对照平均OD值×2.1标本OD值≥COV为阳性，标本OD值≤COV为阴性。
阴性对照OD值低于0.05，作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。
免疫荧光色素技术许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。
只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。
常用的荧光色素有：①异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。
分子量为389.4，最大吸收光波长为490-495nm，最大发射光波长520-530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，是应用最广泛的荧光素。
其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
②四乙基罗丹明；③四甲基异硫氰酸罗丹明等。
【实验原理】：利用荧光标记第二抗体检测未知Ag或未知Ab的方法。
以检测人血清中抗核抗体（ANA）为例。
小鼠肝细胞作为抗原片，将病人血清加到抗原片上。
如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分发生特异性结合，再加入荧光素标记的抗人IgG又可与ANA结合，在荧光显微镜下细胞核部位呈现荧光。
以检测血清中ANA(抗核抗体)为例。
鼠肝细胞+ ANA（1：5血清），一抗+ 抗人IgG-FITC，二抗→荧光显微镜下观察→无荧光为阴性，有荧光为阳性【实验结果】细胞核发黄绿色荧光为“+”，阳性待检血清作进一步稀释后可测定效价。
不发荧光为“-”。
根据细胞核着染荧光的图像，可区分为：①均质性：细胞核呈均匀一致的荧光。
②周边性：核周呈现荧光。
③斑点型（颗粒型）：核内呈现斑点状荧光。
④核仁型：核仁部分呈现荧光。
⑤混合型：两种以上核染色。
【注意事项】：抗原片要新鲜，厚薄一致，要尽量薄。
待检血清要新鲜。
冲洗时要干净，动作要轻柔。
观察结果要及时，以免荧光湮灭。
补体CH50实验【实验原理】：补体与抗体（溶血素）致敏的羊红细胞接触后，被激活（C1途径），从而使致敏的SRBC溶解，其溶血程度与补体量呈正比。
因此，将新鲜待检血清做不同稀释后，与致敏红细胞反应，测定溶血程度，以50%溶血时的最小血清量判定终点，可测知补体总溶血活性。
以50%溶血判断结果比100%溶血灵敏、准确。
溶血素+SRBC，在补体的作用下→溶血【实验结果】①对照管不溶；②目视比较，最接近标准管的一管。
根据U管中加入的血清量，求出总补体值：补体活性（u/ml）=1/血清量（ml）×稀释倍数（20）③无法目测的，用722在542nm处读T值也可。
大小吞噬实验【实验目的】：体内具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，主要包括血液中的中性粒细胞、单核细胞和组织中的巨噬细胞。
通过测定细胞的吞噬率、吞噬指数可了解吞噬细胞的吞噬功能。
一、小吞噬试验【实验原理】：中性粒细胞具有很强的吞噬杀菌功能，当与颗粒性物质（细菌等）混合孵育一定时间后，颗粒性物质被吞噬杀灭。
根据吞噬率、吞噬指数可反映该细胞的吞噬功能。
【结果观察】：镜下可见RBC被染成红色，其它为蓝色，找到中性粒细胞，计算吞噬率及吞噬指数。