基因工程育种

2、特点
(1)有λ噬菌体的高效感染能力。 (2)有质粒的高效复制特性。
(3)有更广泛寄主。 (4)有较大的容量(35~45kb)。
3、主要用途：用于DNA 序列分析
酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA， 称为2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个 自主复制功能区域（ARS片段）。 特点： ①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转 到酵母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。 ②含有酵母的筛选标记，这样当重组质粒转入相应的酵 母细胞后，可用来筛选重组体。 ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
重组DNA导入到受体细胞
(基因转移)
重组DNA导入到受体细胞（基因转移）
外源基因与载体在体外连接形成重组DNA后，
需要将其导入到受体细胞进行扩增和筛选以得到 大量的，单一的重组体分子即外源基因的无性繁 殖或称为克隆。
所谓的受体细胞就是接受外源DNA的细胞，也称为宿主 细胞。用于克隆的宿主细胞主要有两大类：
宿 主 细 胞
原核生物受体细胞——主要是大肠杆菌 另有枯草芽孢杆菌，假单胞菌，链球菌， 放线菌
真核生物受体细胞—— 细胞，昆虫细胞
酵母菌，动物
基因转移的方法
转化(transformation) 转染(transfection) 电转化(electrotranformation ) 显微注射技术(microinjection) 基因枪技术(geneblaster technique ,微弹技术 microneblast technique） 脂质体介导法(liposome mediated gene transfer)
目的基因的制取的主要方法
（1）直接分离法
（2）反转录法
（3）聚合酶链式反应（PCR)
目的基因的制取的主要方法
（1）直接分离法
（2）反转录法
（3）聚合酶链式反应（PCR)
模板DNA
PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
PCR的基本原理
Taq酶
衔接物连接法
衔接物是指用化学方法合成的一段由 10-12 个核苷酸 组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平头末端的 双链寡聚核苷酸片段。 将衔接物的 5' 末段和待克隆的 DNA 片段的 5' 末端 用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4 DNA 连 接酶使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有 衔 接物的 DNA 分子和克隆载体分子，结果使二者都 产生出了彼此互补的粘性末端。随后按常规的粘性末 端连接法，将待克隆的 DNA 片段同载体分子连接起来。
黏性末端连接 3.不同限制酶切位点的黏端连接
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具 有相同类型的黏性末端，彼此称匹配末端，也可以产生类 似单酶切位点的黏端连接方式一样的末端连接 1 2 同尾限制酶 同裂限制酶
除影响连接反应的一般因素外，黏性末端的长度、 互补碱基的稳定性是影响连接效率的重要因素
质粒载体 细菌质粒 (plasmid) 载体是基因工程中最 常用的载体, 它必须包括三种组成部分： 1 复制必须区 2 选择标记基因
3 限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点，
MCS)
常用质粒载体
1. pSC101
2. pBR322 组成：
来自pSC101的四环素抗 性基因Tetr 来自ColEl的衍生物pMBl 的松弛复制起点ori 来自RSF2124的氨苄青霉 素抗性基因Ampr。

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
Taq酶
PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 Taq PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理

PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
质粒pUC19的分子结构
噬菌体载体 （一）λ噬菌体载体
1.特点：
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长 48502bp，两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链 （粘端），称为cos位点。 λ噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其裂解性 生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插 入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体 可作为基因载体的依据 。
M13噬菌体属丝状噬菌体，其基因组为闭合环状 正链ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都编码蛋白质， 有10个基因，有两个较长的间隔区，是外源基因插入
的部位。
噬菌粒载体（科斯质粒
1、构建
cosmid ）
由质粒和λ噬菌体的粘性末端构建而成的。借用cos-（粘 性尾巴）作字头，质粒的-mid作字尾，故称Cosmid，也叫粘 粒载体。
载体分类： 来源：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体； 性质：温度敏感型载体、融合型表达载体、非融合 型表达载体；
受体细胞：原核细胞载体、真核细胞载体
用途：克隆载体、表达载体；
原核细胞载体：细菌质粒 、噬菌体、噬菌粒、 科斯质粒
真核细胞中的载体
病毒类（杆状病毒、SV40、逆转录病毒等）
非病毒类（酵母菌载体、穿梭质粒、Ti质粒等）
割后的黏端不能互补结合：
平—黏端连接
（1）添补法：即对5’-突出黏性末端补齐
（2）消除法：即对3’-突出黏性末端削平
人工接头连接
将人工连接器（即一段含有多种限制酶切 点的DNA片段）连接到载体和目的基因上，即 有可能使用同一种限制酶对载体和目的基因进 行切断，得到可以互补的粘性末端。 优点：可以用同一种限制酶回收目的基因
同聚核苷酸末端连接（同聚物加尾连接）
当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切 断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在 末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸 添加于载体或目的基因的3‘-端 如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添 加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘 合，再由DNA连接酶连接。
缺点： （1） 高背景 （2） 双向插入 （3） 载体自身环化
黏性末端连接 2.双酶切片段的定向克隆
优点： （1）外源DNA只能以一个方向定向插入到重组质粒，以便 目的基因的正确转录和表达； （2）质粒载体与外源DNA结合处的限制酶切位点仍然保留， 可随时从重组载体中通过相应的限制酶切割后分离和 获得目的基因； （3）由于不会发生自身环化，转化率高，转化后的细菌 克隆大多数携带有目的基因的重组质粒。
第2轮结束
载体的选择构建与体外重组
载体的选择构建与体外重组
Title
载
体
Title
载体的选择与构建 基因与载体的连接（ 体外重组）
Title
载体
载体： 在基因工程操作中，常常把外源DNA 片段利用运载工具送入生物细胞，我们把携 带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载 体。
理想载体必须具备的条件： 1.具有自主复制能力； 2.具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样 可将多个外源DNA片段插入其中； 3.具有一个或多个选择性遗传标记； 4.载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又 可在受体细胞内扩增较多的拷贝； 5.在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而 不易丢失。
2.λ噬菌体的缺陷与改造
λ噬菌体的缺陷：
⑴ 基因组太大（49kb）；
⑵ 酶切点太多，它有5个BamH1位点（G↓GATCC），6 个BgⅠ位点（A↓GATCT），5个EcoRⅠ位点 （G↓AATTC）。 ⑶ 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于λ噬菌体的 75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA。
平端连接 一些内切酶如HaeIII 和 Hpa I 切割产生的DNA 片段没有黏性末端，而是平末端。 平端连接比黏性末端连接困难得多，其连接效 率很低，只有黏性末端的1% 多联体连接中，常常增加DNA的浓度，同时用 数倍于黏性末端的连接酶处理
如果靶序列和载体上没有相同的限制性内 切酶位点可以利用，用不同的限制性内切酶切
1
目的基因的概念
2
目的基因的制取的方法
1.概念 ：
准备导入受体细胞内的，以研究或应 用为目的所需要的外源基因 。
2.目的基因的制取的方法主要有
（1）直接分离法 （2）反转录法 （3）聚合酶链式反应（PCR)
限制性内切酶
一类能识别双链DNA分子特异核苷酸序列的DNA水解 酶。
它是体外剪切基因片段的重要工具，广泛应用于基因 片段的体外切割重组、转化菌重组子的筛选。 分类：限制性内切酶I、限制性内切酶II、限制性内切 酶III
（2）替换型载体 在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取
代的DNA片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，
安排在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复 序列，因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间
的DNA片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源
DNA片段的能力。
（二）M13噬菌体载体
克隆载体：都有一个松弛型复制子，能带动外 源基因在受体细胞中复制扩增 表达载体：是适合在受体细胞中表达外源基因
的载体，它必须有强启动子和终止子，能够高
效转录产生稳定的mRNA
基因与载体的连接（体外重组） 载体的连接方式 1 黏性末端连接
2 平端连接
3 人工接头连接
4 同聚核苷酸末端连接（同聚物加尾连接）

其他方法（例如：超声波介导法 ，碳化硅纤维介导法等
转化
将重组质粒DNA导入受体细胞， 使受体细胞遗传性状发生改变的方 法。一般情况下转化指的是重组质 粒对大肠杆菌的转化。