微生物检查方法验证培训)
微生物限度检测方法验证操作指导书
微生物限度检测方法验证操作指导书1.0目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。
2.0适用范围适用于公司所有需进行微生物限度检测的产品。
3.0职责化验室负责人：对本规程的实施负责。
检验人员：严格按照本规程执行检验操作。
4.0参考文件4.1 验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。
4.2 验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。
5.0程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。
5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。
6.0内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。
根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。
6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。
取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。
微生物检验知识培训试题
微生物检验知识培训试题一、填空题1、微生物(microorganism, microbe) 是一些肉眼看不见的（微小生物）的总称。
2、微生物按其结构、化学组成及生活习性等差异可分成三大类:（真核细胞型）、（原核细胞型）、（非细胞型）。
3、细菌的基本结构由:（细胞壁）、（细胞膜）、（细胞质）、（核质）四部分组成。
4、细菌的主要生长繁殖方式为:（无性二分裂法）。
5、对（微生物）和（尘粒）进行更加严格的控制对于生产洁净室非常重要。
6、在细菌鉴定方面，被国际公认的参考书是:（《伯杰氏手册》）。
7、细菌内毒素的主要化学成分是:（0-特异链）、（核心多糖）、（类脂A）。
.8、影响制剂生产的四大污染源:（空气污染）、（用水污染）、（人员污染）、（器具污染）。
9、灭菌从机理上看，可分为:（物理灭菌法）、（化学灭菌法）、（无菌操作法）。
10、影响微生物细胞化学组成的因素有（微生物种类），（菌龄），（培养基）的组成。
11、酵母菌生物氧化在（线粒体）内进行，而细菌生物氧化部位在（细胞质）。
12、根据微生物生长与氧的关系，可分为（需氧微生物），（厌氧微生物），（兼性厌氧微生物）三大类。
枯草芽孢杆菌属于（需氧）微生物，肉毒芽孢杆菌属于（厌氧）微生物，大肠杆菌属于（兼性厌氧）微生物。
二单项选择题1、真菌属于（A）型微生物。
A.真核细胞型B.原核细胞型C.非细胞型.D.多核细胞型2、下列不属于原核细胞型的是（D）A.细菌B.衣原体.C.放线菌D.病毒3、杀灭芽胞最可靠的方法是（C）A.干热灭菌法B.流通蒸汽灭菌法C.高压蒸汽灭菌D.巴氏灭菌法.4、下列那个是构成细胞的重要物质（B）A.水B.碳源C.细胞核D.无机盐5、滤过除菌法要求最终过滤的滤膜孔径为（A）A. 0.22μmμmμmμm6、低温间隙灭菌:将物品先用（C）加热1h,然后置20-25℃保存24h (或常温过夜),使其中残存的芽孢萌发成繁殖体，再用以上条件灭菌，如此反复三次。
微生物检测培训
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过免疫学技术检测微生物，如酶联免疫吸附试验（ ELISA）、免疫荧光技术等。这些方法具有灵敏度高、特异性强等优点，但需要特定的抗 体和标记物。
02
样品采集与处理
样品采集原则及注意事项
代表性原则
确保所采集的样品能够真实反 映被检测对象的微生物状况， 避免选择受污染或异常的区域
微生物检测广泛应用于食品工业、医药工业、环保、农业等领域，如食品中的 致病菌检测、药品中的微生物限度检查、环境中的微生物污染监测等。
常见微生物检测方法简介
传统检测方法
包括显微镜观察、平板计数法、生化鉴定法等，这些方法操作繁琐，耗时较长，但成本相 对较低。
现代检测方法
如PCR技术、基因芯片技术、生物传感器技术等，这些方法具有灵敏度高、特异性强、自 动化程度高等优点，但成本较高。
电子显微镜观察
利用电子显微镜的高分辨 率，观察病毒的精细结构 合，进行病毒的鉴 定和分型。
病毒培养技术要点
细胞培养
选择适当的细胞系，进行病毒的 培养和繁殖。
病毒接种与收获
将病毒接种到敏感细胞上，经过一 段时间的培养后，收获病毒。
病毒滴度测定
通过空斑试验、TCID50等方法，测 定病毒的滴度，即病毒的感染力。
细菌计数方法及其优缺点比较
显微镜直接计数法
简单快速，但误差较大
平板菌落计数法
准确度高，但操作繁琐，需时较长
光电比浊法
快速简便，但受细菌种类和悬液浓度影响较 大
滤膜法
适用于水样和空气样品，但需特殊设备支持
04
真菌学检测方法
真菌形态学观察与鉴定
显微镜下的真菌形态
利用显微镜观察真菌的菌丝、孢子等 结构特征。
微生物检验技术培训PPT课件
第17页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•无菌检查法包括
• 薄膜过滤法 • 直接接种法
•只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。 •供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与方法适 用性试验确认的方法相同。 •无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂 等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。
3d
培养基
生孢梭菌
空白
1支
枯草芽孢杆菌
各2支 胰酪大豆胨液体
白色念珠菌 黑曲霉
培养基
20～25℃
5d
【10版：改良
马丁培养基】
结空果白判定:
1支
空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏
度检查符合规定。
16
第16页/共80页
二、无菌检查
3.方法适用性试验（方法验证试验）
•当 进 行 产 品 无 菌 检 查 法 时 ， 应 进 行 方 法 适 用 性 试 验 ， 以 确 认 所 采 用 的 方 法 适 合 于 该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进 行方法适用性试验。 •验 证 时 ， 按 “ 供 试 品 的 无 菌 检 查 ” 的 规 定 及 下 列 要 求 进 行 操 作 。 对 每 一 试 验 菌 应 逐一进行验证。 •方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行 。
24
第24页/共80页
二、无菌检查
4.供试品的无菌检查
•结 果 判 断
• 当符合下列至少一个条件时方可判试验结果无效： • （1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果 不符合无菌检查法的要求。 • （2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的 因素。 • （3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌 试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。
微生物检验方法验证
试验组菌数回收率
试验组平均菌落数 - 供试品对照组的平均菌 菌液组平均菌落数
落数
五、控制菌检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域 培养基和培养基试验： 无菌性 促生长能力——在最短时间内观察到明显生长 抑制能力——在培养的最长时间内不能观察到微生物的生长 指示能力——在规定的时间内必须和以前检验过并已接受的培养基在
外观和指示反应都具备可比性。 Nhomakorabea、控制菌检查方法验证
方法验证： 按照各品种项下规定检查的控制菌选择验证菌株。 规定量供试液+10~100cfu试验菌+增菌培养基 合格标准：检出试验菌
六、无菌检查方法验证
环境条件：B级下的局部A级的单向流空气区域 培养基： 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基
四、总菌落数检查方法验证
方法验证——对细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证：
——进行3次独立的平行试验，分别计算各组回收率。
（1）试验组
最低稀释级供试液1ml +
试验菌50~100cfu
平皿法计数 2个琼脂培养基平皿
薄膜过滤法计数
取规定量的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中 加试验菌50~100cfu，过滤。
降低抑菌剂的浓度以消除抑菌性。 三、薄膜过滤法
抑菌性产品通过滤膜时，微生物被截留在膜上，检品被过滤掉。 ——微生物检查法准确与否的核心是对抑菌性的有效消除
四、总菌落数检查方法验证
环境条件：C级下的局部A级的单向流空气区域
培养基种类：
细菌计数
营养琼脂培养基
霉菌和酵母菌计数
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证
微生物限度方法学验证是一种用于确定化妆品和药品中微生物污染水平的方法。
这种验证方法用于确定产品是否符合微生物限度规定，并确保产品的安全性和质量。
微生物限度方法学验证的步骤包括：
1. 根据相关规定选择适当的微生物限度测试项目。
常见的微生物测试项目包括总生菌数、霉菌和酵母菌、大肠菌群等。
2. 准备适当的培养基和培养条件，以促使微生物在培养基上生长。
3. 从样品中获取适当的微生物培养物。
样品可以是产品中的一部分或整个产品。
4. 在适当的培养基上接种微生物培养物。
5. 在适当的环境条件下孵育培养基，以促进微生物生长。
6. 定期检查培养基的生长情况，包括观察菌落形态和计数菌落数量。
7. 将菌落转移到适当的检测方法中，如涂抹法、膜过滤法等。
8. 使用适当的培养基和培养条件，在适当的温度和pH条件下，观察和计算培养基上的微生物生长数量。
9. 比较结果与规定的微生物限度标准，确定产品是否符合要求。
微生物限度方法学验证可以帮助制药和化妆品行业确保产品的微生物质量，并确保产品在使用过程中不会对消费者的健康有害。
这种验证方法需要严格的实验室操作和合理的测试标准，以确保结果的准确性和可靠性。
微生物限度方法学验证PPT课件
养基上， 23～28℃培养5～7天，加3～5ml0.9％无菌氯 化钠溶液洗下霉菌孢子，吸出菌液，取 1ml菌液加0.9％ 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-
4～ 10-6，使菌数约为50～100cfu/ml。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
菌液组：测定所加的试验菌数。 平皿法：取试验用的1ml菌液（约50～100cfu），分别注 入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，按平皿法测定其菌落数。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定 供试品本底菌数。（和试验组采用同法）
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌 计数所规定的方法及要求进行。对各试验菌的回收率 应逐一进行验证。验证试验至少应进行3次独立的平行 试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
细菌计数验证用菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化，中和、 离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组， 以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时， 可用相应的稀释剂替代供试品，加入试验菌，使最终菌 浓度为每1ml 供试液含50～100cfu，按试验组的供试液 制备方法和菌落计数方法测定其菌数。
样品稀释级的选择：最低稀释级，1g或1ml。
培养基：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、改良马丁培养基、 营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基。
细菌、霉菌、酵母菌计数方法的验证
微生物限度检查知识指导
精心整理微生物限度检查知识培训1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。
答：没有上限。
但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。
按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。
（本所控制在110%以内）。
2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作似？答：3答：计数，超过204阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。
5、微生物限度检查法中所用的培养基如：营养琼脂、EMB 、Macl 等培养基其分装容器需要预先灭菌吗？答：不用。
只要是洁净的就行，因为分装后还要灭菌。
6、具有抑菌性的供试品，细菌、霉菌、都是用薄膜过滤法来检查的，那么沙门菌可以用常规法来检查吗？就是可以不经过过滤直接接种到营养肉汤中吗？答：这要看你验证的结果。
如果通过验证，你的品种是对沙门菌有抑制作用，且用培养基稀释法不能消除其抑菌性，则就必需考虑用薄膜过滤法。
7、微生物限度检查中，稀释剂对照组，是在稀释液中加入50~100cfu的菌，还是把稀释液制成含量50~100cfu的浓度呢？答：是把稀释液制成含50~100cfu/ml菌的浓度。
（在这里，我对上次讲课时关于稀释剂对照组操作的PPT进行纠正，对于离心薄膜过滤法的稀释剂对照组的操作应该是：含50~100cfu/ml菌的稀释89、10答：11、答：报告书不需要显示第一、第二天的结果，只需报告最终结果。
理由请见第9题答复。
或者是在营养琼脂中加入TTC试剂（每100ml加入0.1%）12、由于微生物检验的特殊性，对于样品的微生物限度检查计数数据是否可登记在表格内（此表格仅含样品名称、批号及检查结果）。
之后再将检测结果移至详细记录中？答：原始记录应该只有1份。
如果你说的详细记录是属于一般记录，是没有必要的，如果是指报告书，就应该没问题。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
根霉属（RhizopusEhrenberg）
根霉属广泛应用于发酵工业，在潮湿的粮食及食品上能迅 速蔓延生长，引起粮食及食品的腐烂。
根霉 A：1．营养菌丝 B：2. 匍匐菌丝 3. 假根 4. 孢囊柄 C ：孢囊放大图 1. 囊壁 2. 囊轴 3. 囊托
方法验证
试验全方面验证 如试验环境，培养基，供试液的制备，灭菌方法等全部进 行验证。 当验证试验符合要求时，就可认为在该试验条件下该供试 品对微生物无抑菌作用或抑菌作用可忽略不计，供试品检 验结果可真实的体现。
验证方法
菌液制备 50～100cfu/ml。 验证方法 试验组、菌液组、供试品对照组、释剂对照组。 结果判断 供试品组、对照组、稀释剂对照组的菌回收率
检查方法的验证
试验环境 无菌检查应在环境洁净度 10 000 级下的局部洁净度 100 级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全 过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污 染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 检验依据 单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁 净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的 现行国家标准进行洁净度验证。
曲霉属（Aspergillus）
曲霉属的菌丝无色、淡色或表面凝聚有色物质，为有隔的多 细胞。本属的常见产毒霉菌有8个种，具有强烈的致癌性。
曲霉 1．双层小梗分生孢子头 2. 单层小梗分生孢子头 3. 分生孢子梗基部足细胞 4. 双层小梗的细胞微结构
青霉属
菌丝无色或有色，为有隔的多细胞。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞， 顶端不膨大，无顶囊，产生一轮至数轮分叉，在最后一级分枝的小梗上，长 出成串的分生孢子，形似扫帚状，称为帚状枝。本属的常见产毒霉菌有9个 种，其中展青霉可产生展青霉素，是一种神经毒素，并具有致畸、致突变和 致癌性；
常见青霉分生孢子梗
霉菌菌落形态
霉菌在孟加拉红培养基上的形态
酵母菌显微镜下形态
微生物检查法
微生物限度检查方法系检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。 检查项目包括 细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 检查方法 多用平皿法、薄膜过滤法、涂抹法和 MPN 法， 国家药典规定应用经验证合格的方法。
微生物检查方法验证
介绍内容
一、微生物的基础知识 二、微生物检查方法验证
微生物基础知识
微生物（microorganism, microbe）是一些 肉眼看 不见的微小生物的总称。 微生物（microorganism）包括细菌、支原体、螺旋 体、衣原体、立克次体、病毒及真菌霉菌、酵母菌和放 线菌）等。
-2010版药典
隔离系统的应用
应用隔离系统重要的目的 - 是保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及
外包装等的污染，保证无菌实验结果的可靠性，实现一次 检出的要求。 - 是保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染。 隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度 须符合无菌检查的要求。 日常检验还需对试验环境进行监控。
细菌的形态
真菌的形态具有多样性，大小不一，大的用肉眼可以看到， 小的用普通光学显微镜放大数倍乃至千倍方可观察到。其 形态分单细胞、多细胞，单细胞呈圆形或卵圆形，如酵母 菌（yeast）。多细胞由菌丝和孢子组成，并交织成团。
药品污染常见的真菌
毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属、木霉属 - 毛霉属（Mucor Micheli ex Fries） 毛霉属在自然界分布很广，常用于发酵工业。并引起水分 高的粮食及食品的霉烂变质。
微生物的特点
适应强 易变异 多数细菌能耐0～－196℃的低温； 硫细菌可在250～300℃的高温条件下正常生长； 一些嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活； 产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能保藏几十 年、几百年。
微生物的类群和形态结构
微生物按其结构、化学组成及生活习性等分为三大类： 原核细胞型：细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次 氏体、螺旋体等 真核细胞型：真菌 非细胞型：病毒 噬菌体
- 一般以微米（µm）作为测量单位。 - 在细菌学中，按其形态可分为球菌、杆菌、弧菌和螺杆菌。
经革兰染色法（Gram stain）可将细菌分成两大类： 革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）。
细菌cetes） 是具有真核和细胞壁的生物。种类很多，已报道的种超过10 万个。大多是由纤细管状菌丝构成的菌丝体。许多菌丝在一 起统称菌丝体。菌丝体在基质上生长的形态称为菌落。
均不低70% 。
方法验证
微生物的特点
种类多 分布广
迄今为止，我们知道的微生物约有10万种，只占地球上 实际存在的微生物总数的20%。
微生物的特点
各体小，表面积大 物体的表面积和体积之比称为表面积， 大肠埃希菌 的表面积是人的30万倍。
微生物的特点
吸收多 转化快 如大肠埃希菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于 自身重量2000倍的数量，而人体则需要40年之久。
方法验证的必要性
- 为保证检验结果的可靠性，真实性，选择正确的检验方法 是至关重要的。因此试验前必须对选择的方法进行验证。
- 证明所采用的方法是适宜的，确认所采用的方法适宜于被 检供试品的微生物污染的检验。
检验结果的影响因素
供试品的组分 环境影响
抑菌剂、增溶剂、乳化剂及抗氧化剂，这 些 组分在一定浓度下对微生 物起一定的抑制作用也可对污染菌造成损伤。 不同类型的微生物及不同的存活状态对环境的 抗性是不同的。 如培养基的质量、检验人员的操作误差等。
细菌的繁殖
细菌（bacterium）属于原核细胞型微生物，其特点是具 有细胞壁、原始的核质，以二分裂方式繁殖。 了解细菌的基本特性、细菌的鉴别，对新药的研发和防止药 品污染，保证药品质量具有重要的意义。
细菌的形态
- 细菌体积微小，是无色半透明的，用肉眼直接观察难以看到， 其结构和形状须经过显微镜放大数百倍至上千倍才能 观察。