第五节加单氧酶系及其诱导作用

第五节加单氧酶系及其诱导作用在生物医学领域内，人们对药物在哺乳动物体内经由一定的生化机制进行的生物转化作用，已经给与了极大的关注，对来自哺乳类的细胞色素P450电子传递系统进行了广泛的研究。

该系统涉及许多类型药物的氧化作用，例如：芳香及脂肪族化合物的羟基化；N－，O－和S－去烷基化，以及S－和N－氧化作用。

Smith和Rosazza详尽地综述和比较了微生物和哺乳类地药物代谢系统，考虑了所有上述提取的反应以及还原和水解转化、结合作用。

目前，在微生物和哺乳类代谢系统中最引人入胜的相似点，或许莫过于它们各自的细胞色素P450均一蛋白加单氧酶系。

下面就简要地介绍微生物和哺乳类之间这种外线粒体电子传递系统的异同点，目的在于提供一种对于药物代谢研究中运用微生物模型的明晰的生物化学关系。

一、加单氧酶——细胞色素P450的重要性哺乳类生物转化过程中Ⅰ相反应的三种类型是最普遍最重要的。

在过去的二十年间，人们对各种类型化合物氧化机理的了解，取得了惊人的进展。

Hayaishi 的“氧化酶”一书对氧代谢的总体方面进行了详尽的讨论。

此后，围绕着氧的活化，氧化酶类的生理功能等机理研究方面研究了许多复杂问题，下面就是近期工作的小结。

大多数哺乳类氧化Ⅰ相反应，都是由细胞色素P450连接主要位于肝脏的加单氧酶，单也存在于肾脏、肺、胃肠道、脾脏和甾体生源器官，如肾上腺皮质、睾丸、卵巢及胎盘。

细胞色素P450实际上是一类涉及多种类型化合物氧化代谢活性体系的均一蛋白质，与这种均一蛋白有关的肝脏混合功能氧化酶。

在这一光谱基质的氧化作用中需要NADPH和分子氧。

通常肝脏的酶固结在膜上，它们出现在当组织消化和差速离心处理所得到的颗粒性的微粒体部分。

肝脏P450系统的颗粒本质和相当的不稳定性，使得难于分离，并在纯净状态下工作。

通过精巧的电子传递链，包括均一蛋白P450，一种类似于细胞色素P450还原酶的黄素蛋白的作用下，基质的氧化作用就发生了，也需要一种磷脂，如卵磷脂。

除肝脏外的细胞色素P450系统常常是水溶性的，在天然基质的氧化中需要一种非均一的铁硫蛋白和NADH，如：甾体化合物即是如此。

当分离得到的细胞色素P450，用连二亚硫酸钠处理，就被还原，再用一氧化碳处理，就在450nm的中心峰产生了一差别吸收峰。

这样，由Omura和Sato定名为“细胞色素P450”。

后来的研究证明了在多种有机化合物的羟基化期间，在分子氧的活化中均一蛋白质是功能性的。

存在着许多非常相关的细胞色素，它们可能彼此通过对一氧化碳的差别吸收谱而区别开，其精细差别出现在最大吸收值446和452nm之间，对所有这些均一蛋白质之间的确切功能差别还不完全了解。

人们已经付出了相当的努力来探讨通过这种加单氧酶系催化的、尚未揭示的电子传递过程所伴随的氧化作用。

细胞色素P450加单氧酶结合基质和分子氧，同还原酶先后两步相互作用到活化氧。

最终一个氧原子并入基质，另一个氧原子被还原成水。

图36就描述了由P450系统所涉及的基质氧化作用系列循环过程。

在这一循环中，形成的P450－外来化合物－O2三元络合物阐明从细胞色素P450加单氧酶给与的选择性，在该途径中NADPH－细胞色素P450还原酶涉及两步序列（二电子），如图所示，也发生了NADH的电子转移，NADH的协同作用、细胞色素b5还原酶和细胞色素b5也在图36表示出来。

人们提出这些系统的过氧化氢的偶联和解偶联作用。

看来NADPH（和NADPH发生系统）可能被过氧化氢和由某些微粒体混合物及某些纯化了的细胞色素，对某些外来化合物的氧化作用中产生的各种有机过氧化物所取代。

显然，这种观察还没有被同等的微生物体系所复现。

过氧化物的效应可能支持这种假定的P4502+－O2-络合物中间体（见图36）。

人们相信细胞色素P450加单氧酶系作用于哺乳类的脂肪合芳香族的羟基化，N－、O－和S－去烷基化和某些S－和N－的氧化作用。

一般而言，我们可设想它们由缺少电子的氧原子对基质起反应。

芳香族的羟基化经由芳烃氧中间体而完成。

在多数情况下，N－、O－和S－脱烷基化作用是不稳定的，以至于它们同时分解为去烷基基质和一种相应的醛。

二、微生物的细胞色素P450系统微生物的加单氧酶系也包括细胞色素P450均一蛋白和其它在基质氧化中起本质作用的有关因子。

在细菌发现的该酶系同在酵母和真菌中发现的具有很大差别。

原核生物看来具有加单氧酶系（即细胞色素P450，黄素蛋白还原酶，非均一的铁硫蛋白），它十分类似于在肾上腺线粒体发现的加单氧酶系，与此相反，真核微生物（酵母和真菌）具有的加单氧酶系更类似于哺乳类肝微粒体中所发现的该酶系。

许多微生物细胞色素P450相关本质的情报，已总结于表6。

微生物的这些加单氧酶系在如像碳水化合物、脂类、甾醇类和链烷类的中间代谢中起了重要的作用。

又如：在固氮过程，生物碱的合成，棒曲霉素的生物合成，O－和N－脱烷基作用，以及药物的羟基化过程中都起到了很微妙的作用，其奥秘正在一步步地被揭示出来。

三、细菌的细胞色素P450系统通常细菌的P450是可溶性的，需要NADH，具有一种黄素蛋白还原酶及一种非均一的铁硫蛋白，呈现很狭窄的基质专一性，类似于甾体生源器官肾上腺线粒体的P450系统。

细菌和哺乳类的细胞色素P450系统在其它方面也非常相似。

Pseudomonas putida细胞色素P450（P450nm）同苯巴比妥诱导的肝微粒体比较，提供催化活性的竞争性结合和抑制作用，证明了免疫交叉反应。

两种细胞色素P450具有相同分子量和氨基酸组成的亚单位。

然而，微生物和哺乳类具有不同的基质专一性、可溶性、P450cam系统需要一种铁硫蛋白，而肝微粒体的P450cam 系统需要磷脂。

已经知道，细菌在电子传递链中所需要的其它成分同肝外细胞色素P450系统是相似的，酵母和真菌细胞色素P450系统非常类似于在肝微粒体中发现的该系统。

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和PS.Putida是最规范的细菌细胞色素P450系统，可以把它们看作是典型的原核生物加单氧酶系。

其它研究过的P450都来自于Pseudomonas oleovorans，Nocardia和Corynebacterium。

PS.Putida的细胞色素P450cam从被莰酮诱导的微生物细胞中结晶出来。

它是一种选择性的氧－和基质*的莰酮次甲基―5•exo―羟化酶的再活化组分。

在基质存在的条件下，P450cam的纯化工作容易完成，该酶系统由两种不同的方法分离。

结晶的细胞色素P450分子量是44000～46000。

这取决于测定的方法。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳指出：蛋白质部分是由简单的多肽组成。

加单氧酶系也包括假单胞氧还蛋白。

这是一种分子量为12500的铁－硫氧还蛋白，含有铁和由无机硫化物两个原子和一个FAD－黄素蛋白，NADH－假单胞氧还蛋白氧还还原酶。

当黄素蛋白和铁硫蛋白供给还原剂时，细胞色素P450被结合和催化莰酮5－次甲基的氧化。

该铁硫蛋白也参加产物的形成。

脸儿硫酸钠和CO处理过的P450cam在446nm处出现一最大的索瑞氏吸收谱。

早些时候，Peterson等指出：P.Putida莰酮系统被甲吡酮所抑制。

这种抑制剂对均一蛋白的结合作用同基质莰酮和由偶联的加单氧酶系摄取的氧所抑制的甲吡酮是竞争性的。

已经指出，甲吡酮在肝微粒体P450中是一种典型的Ⅱ型基质。

假单孢菌系具有同P450Ⅱ型基质相互作用的特征，当存在或缺少莰酮的条件下，发现加入甲吡酮到细胞色素P450，就出现差光谱。

巨大芽孢杆菌P450行使脂肪酸氧化和甾体羟基化的功能。

发现一种需要NADPH的无细胞甾体15 －羟化酶系，并由一氧化碳、SKF－525A、咪唑和甲吡酮所抑制。

所有这些性质说明该系统是依赖于细胞色素P450的。

人们发现NaIO4和NaCIO2能够作为对铁酶的氧供体，结果形成一种活泼的细胞色素P450氧合作用类群。

在存在这些试剂下的羟基化反应，就可能是典型的依赖于细胞色素P450系统。

B.megaterium ATCC 13,368的这种复杂的加单氧酶系具有下述特征，包括NADPH，称为“巨大芽孢氧还蛋白还原酶”的黄素蛋白还原酶及“巨大芽孢氧还蛋白”非均一铁硫蛋白和细胞色素P450meg 。

图37表示涉及3―氧―∆4―甾体化合物羟基化的B.megaterium 电子传递系统，它同肾上腺线粒体的甾体11β－羟化酶和其它细菌的加单氧酶系形成对照。

有趣的是：该系统在组成上是如此的类似，以至于B.megaterium 和PS.putida 系统的组分名称都出自在肾上腺线粒体所发现的类似组分名称。

迄今为止，尚未发现任何同链霉素有关的细胞色素P450加单氧酶系。

这是令人意外的。

因为链霉素已被证明具有代谢宽泛基质专一性的倾向。

Rosazza 和Smith 研究了一株链霉菌（Streptomyces griseus ）的性质。

该菌表现出了对多种特殊基质令人惊叹的代谢能力。

使用抑制剂的初步实验表明：加单氧酶系就是中介性的细胞色素P450。

该菌株氧化基质的反应类型包括各种芳香化合物的羟基化，海罂兰、罂粟碱、10,11－二甲氧啊朴啡和苯甲醚的O －去甲基化、海罂兰和d －防己碱的N －去甲基化；对长春刀灵的烯胺及二聚体形成作用的研究，和对唐松茸卡品（Thalicarpine ）代谢物的制备。

利用S.griseus 的全细胞进行的初步分析实验表明，这种反应可能就是通过细胞色素P450。

因为利用苯巴比妥可明显地诱导酶活性，使用甲吡酮可部分抑制酶活性。

当然，对全细胞的抑制剂实验须得审慎解释。

据称：该菌的无细胞制剂实验有了进展。

值得关注的是S.griseus 的细胞可以在深度冷冻达6个月以上的贮放而无任何加单氧酶活性损失。

这种稳定性和表现出的广泛基质专一性，使得S.griseus 系统对研究工作具有特殊而实际的意义。

NHI-Fe四、真菌的细胞色素P450系统没有一种真菌的加单氧酶系像细菌或酵母一样给与确切的定义。

一般来说，它存在于细胞匀浆的微粒体部分，本质上是颗粒状的，需要NADPH，涉及宽泛的生理过程，包括链烷的氧化，生物碱和棒曲霉素的生物合成，以及存在有较广谱的基质氧化能力。

目前已鉴定的真菌系统类似于肝脏微粒体P450系统的性质。

下面提出关于真菌细胞色素P450系统的几个例证，以帮助理解。

Ambike 等人使用一氧化碳的差示光谱法从真菌麦角菌（Claviceps purpurea）表明生长培养物的微粒体制剂中证明了细胞色素P450的存在，该菌的加单氧酶系看来，对生物碱的产生有关系。

黑根霉（Rhizopus nigricans）含有一种细胞色素P450，它在孕甾酮的11α－羟基化中具有重要意义。

一氧化碳抑制该微粒体制剂，同时450nm的紫外光回复了这种抑制，并由CO差示光谱确证了细胞色素P450的存在。