游离DNA的染色体水平拷贝数分析流程-用户手册
DNA测序技术的操作方法与注意事项
DNA测序技术的操作方法与注意事项DNA测序技术是现代生物学研究中最为重要的技术之一。
它通过读取DNA序列，揭示了生命的遗传密码，为疾病研究、基因工程、进化生物学等领域提供了强有力的工具。
然而，要想获得高质量的DNA测序结果，操作方法与注意事项是不可忽视的。
一、操作方法1. DNA提取：DNA提取是测序的第一步，要确保提取到足够纯净、高质量的DNA样品。
操作过程中需要注意以下几点：a. 样品的选择：样品可能是细菌、动植物组织、人类血液等不同类型。
不同类型的DNA提取方法有所不同，需要根据样品的特点选择适当的提取方法。
b. 样品的保存：为了避免DNA降解，样品在提取前应得到适当的保存。
冷冻保存是常用的方法。
c. 提取试剂的选择：市面上有多种DNA提取试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂。
d. 操作规范：注意无菌操作，避免外源DNA污染。
同时，注意各个步骤的时间控制和温度控制，以保证提取过程的高效和准确。
2. PCR扩增：PCR扩增是测序前的重要步骤，通过反复复制目标DNA片段，进行扩增并提高检测的灵敏度。
在PCR扩增过程中需要注意以下几点：a. 引物的设计：PCR扩增需要引物与目标DNA序列互补，引物设计应合理，尽量避免非特异性扩增。
b. 影响PCR反应的参数：反应体系中的温度、时间、酶浓度等参数需要精确控制，不同的目标DNA可能需要不同的PCR条件。
c. 循环数的选择：循环数太少可能导致扩增产物过少，循环数太多可能引起非特异扩增，需要根据实际情况选择合适的循环数。
3. PCR产物纯化：PCR产物纯化是为了去除引物、引物二聚体等对测序反应的干扰物质。
在PCR产物纯化过程中需要注意以下几点：a. 使用PCR纯化试剂盒：市面上有多种PCR产物纯化试剂盒可供选择，根据实验需要选择合适的试剂盒。
b. 操作规范：注意洗涤缓冲液的使用和洗涤次数的控制，以确保纯化效果。
4. DNA测序反应：将纯化后的PCR产物进行测序反应前，需要注意以下几点：a. 反应体系的准备：反应体系中需要添加适量的测序引物、缓冲液和酶，同时确保反应体系的最终体积和比例准确。
亲子鉴定DNA提取标准操作规程
DNA提取标准操作规程1. 目的：规范不同检材的DNA提取操作程序，确保DNA质量，保证STR分型结果准确性。
2. 原理：Chelex-100 是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。
在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去Chelex颗粒，使其结合的物质与DNA 分离。
磁珠法提取核酸是通过细胞裂解液裂解细胞，从细胞中游离出来的核酸分子被特异的吸附到磁性颗粒表面，而蛋白质等杂质不被吸附而留在溶液中。
反应一定时间之后，再在磁场作用下，使磁性颗粒与液体分开，回收颗粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脱液洗脱即可以得到纯净的DNA。
3. 操作者：具有法医物证检验资格的广西区妇幼司法鉴定所技术人员。
4. 标本：5％EDTA抗凝全血、8-10ml胎儿羊水、5％EDTA抗凝脐血、FTA纸血斑、口腔拭子、5-10根带毛囊的毛发、绒毛细胞。
5 试剂：5.1 试剂的厂家及规格：5.1.1 DNA抽提试剂 Chelex-100 伯乐公司（Bio-Rad Laboratories, Inc. CA U.S.A）。
5.1.2 DNA抽提试剂 Promega PP18或PP21 DNA System抽提试剂盒。
5.1.3 DNA抽提试剂口腔棉签制备基因组DNA试剂盒（G&T，U.S.A）5.1.4 无水乙醇分析纯5.1.5 异丙醇分析纯5.1.6 无菌的超纯水由实验室技术人员制备。
5.2 试剂的配制：5.2.1 5％Chelex-100的配制：称取5克粉状Chelex-100于试剂瓶中，加入灭过菌的超纯水至100ml。
5.2.2 灭菌超纯水的制备：用干净的试剂瓶装超纯水1升左右，经121℃灭菌30分。
6 仪器及设备：6.1 生物安全柜。
6.2 高速离心机。
6.3 超速冷冻离心机。
生物岛游离DNA提取试剂盒（柱式法） 说明书
版本号：11/2020游离DNA提取试剂盒（柱式法）说明书【产品名称】通用名称：核酸提取或纯化试剂商品名称：游离DNA 提取试剂盒（柱式法）英文名称：CWhipro Circulating Nucleic Acid Kit 本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的血清、血浆、淋巴液等无细胞体液中提取游离DNA 。
得到的游离DNA 用于PCR 、荧光定量PCR 和二代测序等分子生物学实验。
【预期用途】 本试剂盒采用可以特异性结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，样品裂解后，游离DNA 在高盐条件下与硅胶膜结合，在低盐、高pH 值时游离DNA 从硅胶膜上洗脱下来。
本品可以处理0.1-1 ml 的液体样本，配置的高效微量吸附柱洗脱体积可低至20 μl 。
纯化的DNA 产量高、质量好，最大限度去除蛋白、色素、脂类及其他抑制物，游离DNA 得率与样品的类型，储存条件、时间以及个体间差异有很大关系。
【检验原理】50次/盒；200次/盒【包装规格】【主要组成成分】50次/盒200次/盒试剂名称规格数量规格数量裂解缓冲液45ml/瓶1瓶200ml/瓶1瓶结合缓冲液（浓缩液）60 ml/瓶1瓶240ml/瓶1瓶漂洗缓冲液1（浓缩液）13 ml/瓶1瓶52ml/瓶1瓶漂洗缓冲液2（浓缩液）15ml/瓶1瓶60ml/瓶1瓶洗脱缓冲液10ml/瓶1瓶30ml/瓶1瓶蛋白酶K100mg/支1支400mg/瓶1瓶蛋白酶K保存液5ml/支1支20ml/瓶1瓶吸附柱50个/包1包50个/包4包收集管50个/包1包50个/包4包需要实验者自行准备的试剂：无水乙醇、异丙醇。
【储存条件及有效期】吸附柱2-8℃保存，其余组分0-35℃保存，有效期12个月。
可在0-40℃运输，运输时间建议不超过7天。
【样本要求】1．适用标本类型：新鲜或冷冻的血清、血浆、淋巴液等无细胞体液。
2．标本处理与保存：样本应避免反复冻融，否则影响提取的得率和质量。
3．样本运输：应采用冰壶或者泡沫箱加冰或干冰密封运输。
游离DNA产前筛查技术规范
附件1孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断是应用高通量基因测序等分子遗传技术检测孕期母体外周血中胎儿游离DNA片段，以评估胎儿常见染色体非整倍体异常风险。
为规范该类技术的临床应用，制订本规范。
本规范主要包括开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术的基本要求、适用范围、临床服务流程、检测技术流程以及质量控制指标等内容。
第一部分基本要求一、机构要求（一）开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的医疗机构应当获得产前诊断技术类《母婴保健技术服务执业许可证》。
（二）开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断采血服务的医疗机构(以下简称采血机构)应当为有资质的产前筛查或产前诊断机构。
开展采血服务的产前筛查机构须与产前诊断机构建立合作关系，并向省级卫生计生行政部门备案。
（三）开展孕妇外周血胎儿游离DNA实验室检测的医疗机构（以下简称检测机构）应当具备临床基因扩增检验实验室资质，严格遵守《医疗机构临床实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》等相关规定，相应检验项目应当接受国家卫生计生委临床检验中心组织的室间质量评价。
二、人员要求（一）从事孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的专业技术人员应当按照《产前诊断技术管理办法》要求取得相应资质。
（二）从事孕妇外周血胎儿游离DNA产前检测的实验室人员应当经过省级以上卫生计生行政部门组织的临床基因扩增检验技术培训，并获得培训合格证书。
三、设备试剂要求（一）在具备细胞遗传学实验诊断设备的基础上，同时具备开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断相应的主要设备，包括DNA提取设备、PCR仪、高通量基因测序仪或其他分子检测设备等。
设备的种类、数量应当与实际开展检测项目及检测量相匹配。
（二）设备、试剂和数据分析软件应当符合《医疗器械监督管理条例》和《医疗器械注册管理办法》等相关规定，经过食品药品监督管理部门批准注册。
染色体微阵列分析报告
染色体微阵列分析报告引言染色体微阵列是一种用于研究基因组改变的方法，它可以同时分析多个基因座的拷贝数变异。
本文档将介绍染色体微阵列分析的原理、实验流程以及结果分析。
方法样本准备从病人体内获取染色体样本，例如血液、组织等，进行细胞培养和染色体提取工作。
微阵列实验将提取得到的染色体样本进行荧光标记，并与已知引物探针进行杂交。
然后使用染色体微阵列芯片进行读取和扫描，获取到每个基因座的信号强度。
数据分析根据信号强度，使用专门的数据分析软件对微阵列数据进行处理和分析。
常见的分析方法包括拷贝数变异分析、基因座关联分析等。
结果拷贝数变异分析根据微阵列数据，可以获得每个基因座的信号强度，从而推断拷贝数变异的情况。
拷贝数增加或减少可能与一些疾病相关。
基因座关联分析通过比较不同基因座之间的信号强度，可以发现它们之间的关联性。
这有助于理解基因座之间的相互作用和调控机制。
结果解读根据拷贝数变异分析和基因座关联分析的结果，可以得出一些结论。
例如，某个基因座的拷贝数增加与某种疾病的发病风险增加有关等。
结论染色体微阵列是一种有效的分析基因组改变的方法。
通过对微阵列数据的处理和分析，可以获得有关基因座的拷贝数变异和关联性的重要信息。
这对于研究疾病的发病机制和个体的遗传特征具有重要意义。
参考文献： 1. Smith A, et al. (2005). Microarray analysis of human copy number variants. 2. Johnson B, et al. (2007). Association mapping in structured populations.。
血浆游离DNA(ctDNA)提取标准操作规程
血浆游离DNA提取标准操作规程1.目的：制定DNA提取标准操作规程，使尽可能多提取到血浆游离DNA。
2.适用范围：血浆提取。
3.术语及定义：无。
4.职责：4.1 文件编写：高通量实验室技术员。
4.2 文件审核：高通量实验室组长。
4.3 文件审批：实验室主任。
4.4 执行：高通量实验室的所有工作人员。
5.操作规程：5.1准备工作5.1.1紫外杀菌：打开超净工作台内的紫外灯，杀菌30 min，关闭紫外灯，打开抽风机，通风10 min。
5.1.2实验前准备：通风结束后，根据《实验室安全防护规程》中的相关规定，换好洁净服、洁净帽、防护镜等进入实验室；将恒温金属浴打开至56℃，将恒温水浴锅打开至60℃。
5.1.3准备物品：准备1.5 mL及2.0 mL的EP管，50mL离心管，96孔双面板，1000μL、200μL、100μL、20μL、和10μL移液枪和枪头，游离核酸提取试剂盒（离心柱法）。
5.1.4试剂准备及配制：5.1.4.1无水乙醇，异丙醇。
5.1.4.2每管Carrier RNA（干粉）中各加入1550μL的洗脱液（A VE），充分混匀，溶解。
-20℃保存（Carrier RNA为白色或半透明物质，请确保其完全溶解；反复冻融不可超过三次，可分装保存避免反复冻融）。
5.1.4.3每瓶AW1加入25mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。
5.1.4.4每瓶AW2加入30mL的无水乙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。
5.1.4.5每瓶ACB加入200mL的异丙醇，并在管盖及瓶身打勾，室温保存。
5.1.4.6 Buffer AL与Carrier RNA进行混合，配制成裂解工作液(现配现用)5.1.5真空泵准备依次将Luer slot of the QIAvac 24 Plus (closed with luer plug)、开关阀、连接器、吸附柱、扩展管装到真空泵底座上（装紧以防止漏气）。
5.2 DNA提取流程5.2.1在50mL的离心管内加入100μL的蛋白酶K。
DNA测序实验技术的使用教程与数据解读
DNA测序实验技术的使用教程与数据解读DNA测序，作为分子生物学中重要的实验技术之一，广泛应用于基因研究、疾病诊断以及进化等领域。
本文将介绍DNA测序实验技术的使用教程，并探讨如何解读测序数据。
一、DNA测序实验技术的使用教程1. 实验准备在进行DNA测序实验前，需要准备以下材料：待测序样本、DNA提取试剂盒、测序试剂盒、PCR仪、离心机等。
2. DNA提取首先，需要从待测序样本中提取DNA。
一般常用的DNA提取方法有酚-氯仿法和商业试剂盒法等。
在提取过程中，要注意避免DNA的污染，确保提取的DNA质量良好。
3. DNA扩增通过PCR技术对DNA进行扩增，以获得足够的DNA量。
根据不同的实验目的，选择不同的引物进行PCR扩增，如全基因组测序可以使用全基因组扩增引物，而目标基因测序则需要特定的引物。
4. DNA测序常用的DNA测序方法有Sanger测序和Next Generation Sequencing (NGS)测序。
Sanger测序适用于小规模的测序项目，而NGS测序则适用于大规模测序项目。
5. 数据处理进行DNA测序后，会得到一系列的测序数据。
这些原始数据需要进行质量控制、去除接头序列、提取有效序列等步骤。
可以使用一些常用的序列处理软件，如FASTQ Toolkit、Trimmomatic等。
6. 数据分析得到可靠的测序数据后，可以开始进行数据分析。
首先，可以使用一些基因组比对工具将测序数据与参考基因组进行比对，如Bowtie、BWA、STAR等。
然后，可以利用一些基因组浏览器软件对比对结果进行可视化，如IGV、UCSC Genome Browser等。
二、DNA测序数据解读1. SNP分析SNP (Single Nucleotide Polymorphism)是最常见的基因组变异形式之一。
通过对测序数据进行比对分析，可以鉴定出样本中的SNP位点，并进行进一步的功能注释。
2. Indel分析Indel (Insertion-Deletion)指的是DNA序列插入或缺失的变异形式。
拷贝数变异（CNV）
拷贝数变异（CNV）人类基因组由23对染色体中的60亿个碱基（或核苷酸）组成。
正常人类基因组成分通常是以2个拷贝存在，分别来自父母。
拷贝数变异（CNV）是由基因组发生重排而导致的，一般指长度为1kb以上的基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的缺失和重复，是人类疾病的重要致病因素之一。
异常的DNA拷贝数变化（CNV）是许多人类疾病（如癌症、遗传性疾病、心血管疾病）的一种重要分子机制。
作为疾病的一项生物标志，染色体水平的缺失、扩增等变化已成为许多疾病研究的热点，然而传统的方法（比如G显带，FISH，CGH等）存在操作繁琐，分辨率低等问题，难以提供变异区段的具体信息。
CNV，即拷贝数变异，一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。
CNV被定义为一段至少1kb大小DNA的拷贝数，与具有代表性的参考基因组拷贝数不同。
CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种：2条同源染色体拷贝数同时出现缺失；1条同源染色体发生缺失，1条正常；1条同源染色体出现拷贝数重复，另1条正常；1条同源染色体出现缺失，另1条出现拷贝数重复；2条同源染色体同时出现拷贝数重复。
染色体拷贝数变异（CNV）检测：NIPT技术目前医院临床应用的为普通NIPT技术，商业上还有通过增加测序数据的升级版的NIPT产品（可以检测染色体微缺失/微重复和某些单基因病）。
对于NIPT提示的CNV可以分为两种：母源性CNV，就是母亲存在CNV（此时胎儿50%可能存在相同的CNV，50%可能不存在该CNV）；第二种，胎儿CNV。
母源性CNV的阳性预测值（PPV）接近100%，因为母源游离DNA占比90%，因此阳性预测值（PPV）很高就不足为奇。
但是不同的检测机构或者有些已发表文献，并不提示母源性CNV。
对于母源性CNV，胎儿无非两种情况，和母亲一样拥有同样的CNV，或不含有该CNV。
在临床咨询中，对于这种来源于母源或父源CNV，如果父母本身没有任何表型，胎儿本身也不存在超声结构异常，我们大多认为偏良性。
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游离DNA 的染色体水平拷贝数分析流程
该分析流程基于Ion Torrent 信息平台Torrent Suite （TS ） 系统和T21 分析插件，对游离DNA 数据进行一站式的快速分析，包含数据质控、比对、以及游离DNA 的染色体水平拷贝数分析等重要生物信息学分析步骤。
目录
1. Ion Torrent 信息平台简介 (1)
2. T21插件的运行 (2)
3. 数据质量控制 (4)
3.1 reads 的碱基质量 (4)
3.2 基因组上的Unique mapping (4)
3.3 样品数据量控制 (5)
3.4 样品一致性 (5)
1. Ion Torrent 信息平台简介
Ion Torrent 测序技术平台，提供的不仅仅是一个测序仪器，而是包含数据分析流程在内的一整套解决方案。
Torrent Suite （TS ）系统主要负责测序和数据的常规分析，在此基础上由T21插件完成游离DNA 的染色体水平拷贝数分析。
其数据流如图1所示，测序过程经过信号处理（Signal Processing ）和碱基读出（Base Calling ）两个主要步骤获得序列数据；序列数据在TS 上可以完成比对（Alignment ），并在此基础上选择T21插件完成游离DNA 的染色体水平拷贝数分析。
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图 1：Ion Torrent 技术平台数据流，游离DNA 的染色体水平拷贝数分析流程及相关信息模块
2. T21插件的运行
Ion torrent 测序数据是以Run/Report 的形式进行组织的。
每次测序运行定义为一个Run,每个Run 可以设置不同的参数，进行多次分析。
Ion Torrent 在进行个性化分析的时候，采用Report 内插件运行的方式。
对于游离DNA 的染色体水平拷贝数分析，TS 系统可整合T21plugin 插件。
选择运行插件后，会弹出对话框，展示与此次测序Report 所设的barcode 、样品信息和相应的参数设置(图2)。
设置完成后提交运行。
图 2：插件运行对话框
在此插件运行过程中，其将自动完成如下步骤：
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A. 用TS 系统内置Mapping 软件TMAP 对人类标准基因组hg19进行mapping. 为保证所有mapping 结果在基因组上都输unique 的，Mapping 参数设为‐a 0，mapping quality>=10.
B. 对基因组上不同区域的reads 数进行计数，在计数的同时调整区域范围，使得每个区域的reads 数都在3000~5000左右。
C . 选取正常参照样本(>10)，计算上述相同区域内正常样本的reads 数目，并进行总体归一化，即保证检测样本和正常参照样本在22条常染色体内的reads 数目相等。
D. 计算检测样本与正常参照样本在上述区域内的reads 数目比值，并取以2为底的log 值。
E. 去除连续偏差较大(可能CNV 相关)的区域的log 值，评估总体的数据分布，并计算出log 值的均值和变异范围。
F. 根据均值和变异范围，计算每个染色体内所有log 值属于总体均值的概率(P value)。
同时，计算出变异区域的比例(SigRegion, Significant Region Percentage)。
G . 在划定显著范围的时候，对P 值范围进行多重统计校正，即显著范围为0.05/22, 0.10/22. 综合变异区域，对染色体是否是三体或者单体进行分级判定(+++,极显著；++, 显著; +, 存疑；‐，不显著)。
运行完成后，系统会输出如表1所示结果： SampleId Chr Ctrl
Reads Case
Reads P Value SigRegion SigDegree
IonXpress_001 chr13 172108 173567 0.00948 0 -
IonXpress_001 chr18 141448 141709 0.60242 0 -
IonXpress_001 chr21 64426 65023 0.08092 0 -
IonXpress_002 chr13 169849 170211 0.54333 0 -
IonXpress_002 chr18 138699 139124 0.41725 0 -
IonXpress_002 chr21 64098 64537 0.21819 0 -
IonXpress_005 chr13 144499 144296 0.74806 0 -
IonXpress_005 chr18 115631 117648 0.00043 0
+ IonXpress_005 chr21 53797 55929 5.86E-08 57.17 +++
表 1： 游离DNA 的染色体水平拷贝数检测结果示意图
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对于存疑的样本，进行数据质控查询和样品信息查询，以确定是否需要重做实验，或者进行其他临床检测。
3. 数据质量控制
3.1 reads 的碱基质量
在生成测序序列信息（以下称reads ）的过程中，Ion torrent 平台会用滑动window 法进行质控，即从reads 头部到尾部，以30bp 的window, 逐个碱基计算其平均quality 值，将平均值低于15的window 中间切断，只保留前端质量值较高的序列信息。
另外，针对测试所用adapter ，会采用“贪婪算法”从尾部尽可能的去除adapter 序列。
经过上述处理，Ion torrent 平台可以提供只包含用户建库序列，测序结果稳定的数据，以BAM 或FASTQ 文件格式的形式提供给客户。
图 3：测序结果的碱基质量分布图
3.2 基因组上的Unique mapping
为保证所有mapping 结果在基因组上都输unique 的，Mapping 参数设为‐a 0，即当一个reads 在两个位置可以得到最高的mapping 分值的时候，mapping quality 标记为0。
对于已经mapping 到基因组上的reads,要保证mapping quality>=10。
（图4）
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图 4：Mapping 结果示意图
3.3 样品数据量控制
为了保证足够数据量进行计算，推荐每个样品至少测得5M 个reads(平均unique mapping 率为80%, 即4M 个reads 参与计算)。
如果测得reads 数目低于3M, 将会以黄色进行警示标识。
如果reads 数目低于1.5M ，将用红色标识，提示检测结果很可能不可靠。
如果测得reads 数目低于0.5M ，则不会进行计算。
（图5）
图 5：样品数据量监控
3.4 样品一致性
为了获得检测样本和参考样品的一致性，首先要保证过滤后window 的频数接近正态分布；并尽量保证过滤后window 分布在qq ‐plot 呈一条线，Abnormal index<0.05.
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图 6：样品一致性监控图。