抑制消减杂交的原理及应用
抑制性消减杂交(SSH)技术及其应用
抑 制 性 消 减 杂 交 技 术
（ｕｐ ｅｓｏ Ｓ ｐｒ ｓ ｉｎ
１３ 将 ｔ ｓ ｅ Ｄ Ａ分成 两组 （ 和 ２ ，分 别于其 ． ｅｔｒｃＮ １ ）
Ｓ ｂ ｒ ｃ ｉ ｅ Ｈ ｂ ｉ ｉ ａ ｉ ｎＳ Ｈ 是 Ｄ ａ ｃ ｅ ｋ ｕ ｔ ａ ｔ ｖ ｙ ｒ ｄ ｚ ｔ ｏ ，Ｓ ） ｉ ｔｈｎ ｏ
一
阳性率低 、 筛选效 率高 、 操作 简单等优 点 ， 别适用 于 特 克 隆分析造成 某种特 殊表型 的 目相 同但 在
短链 （ １ 约 ０余个核苷 酸 ） 组成 的双链 ＤＡ片 段 ， Ｎ 长
同， 内侧序 列与第二次 Ｐ Ｒ引物序列 相 同。 外 ， 而 Ｃ 此 在
［ 摘
要］ 制性消减杂交技术 （Ｓ ） 抑 Ｓ Ｈ 是一种高效检测差异表达基 因的方法 。 详细论述了抑制性消减杂交的基本原理及过程，
并简要介绍了其在工业生产菌种改 良中的应用 。 ［ 关键词］ 抑制性消减 中 ８ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章编 号 ］ １ ０ — ０ ５ ２０ ） ７０ ３ － ３ 文 ０ ３ ５ ９ （０ ８ ０ － ０ １０
５ 端接上 去磷酸 化 的接 头 １ 接 头 ２ （ｄ ｐｏ ， 和 ａ ａｔｒ １
等于 １９ 依据 消减杂 交和 抑制 Ｐ Ｒ发 展起 来 的 ９６年 Ｃ
一
种 分 离差 异表 达 基 因的新 方 法 ［３该 技术 具 有假 ， ２
ａａ ｔｒ２。 ｄｐ ｏ ） 两接头分别是具有一段反向末端重复序 列 的寡核苷 酸序 列 ， 由一长链 （ ４ 约 ０余个 核苷酸 ） 和
含有 目的基 因的样 品称 为试验方 （ｅ ｔ ｒ 。 Ｔ ｓ ｅ ）
除接 头不 同外 是完 全同源 的， 然形成 ａｂＣｄ但第 仍 ，、、，
抑制性减法杂交技术
抑制性减法杂交技术1996年，L. Diatchebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交（supression subtractive hybridization, SSH）技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题，如两者不能用于分离两组基因表达差异较小的基因，也不能用于研究存在上调表达的基因等。
(1) SSH的主要原理SSH的核心技术是抑制性PCR (suppression PCR )，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。
其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。
因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。
抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列(long inverted repeats)在复性时产生“锅柄样”(panhandle-like）结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。
同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致。
（2）SSH的基本过程如图所示，SSH的主要步骤包括：限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段。
②将检测cDNA分成均等的两份，分别接上接头1或接头2,接头（adaptor)由一长链(40nt)和一短链(l0nt)组成的一端是平末端的双链cDNA分子。
长链3′端与cDNA5′端相连。
长链外侧序列（约20nt）与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。
此外，接头上含有升启动子序列及内切酶识别位点（如Not I, Srf I, Sma I和Xba I等），为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。
抑制性消减杂交_SSH_技术及其应用
抑制性消减杂交技术（ＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎＳｕｂｔｒａｃｔｉｖｅＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＳＳＨ）是Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ等于１９９６年依据消减杂交和抑制ＰＣＲ发展起来的一种分离差异表达基因的新方法［１，２］，该技术具有假阳性率低、筛选效率高、操作简单等优点，特别适用于克隆分析造成某种特殊表型的目的基因及其功能。
而消减文库是使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料（如同类菌种的高产、低产品系），提取ｍＲＮＡ经反转录合成ｃＤＮＡ，在一定条件下用大大过量的不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），与含有目的基因的试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，连接到载体形成文库。
高等真核生物的所有生命现象，例如细胞生长、器官形成、恶性转化、特定代谢产物分泌等都是基因选择性表达的结果，要弄清这些生命现象的分子调节机制，就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析，然后研究其氨基酸组成，表达产物的结构功能。
抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具。
１ＳＳＨ的基本原理与过程［３，４］１．１提取样本ｍＲＮＡ，利用随机引物反转录为双链ｃＤＮＡ，将不含目的基因的一方作为驱动子（Ｄｒｉｖｅｒ），含有目的基因的样品称为试验方（Ｔｅｓｔｅｒ）。
１．２用识别四碱基的限制性内切酶ＲｓａＩ（或ＨａｅⅢ）酶切。
双链ｃＤＮＡ经酶切后，每个片段一般小于６００ｂｐ，可防止长链ｃＤＮＡ片段所形成的复杂结构干扰消减杂交。
１．３将ｔｅｓｔｅｒｃＤＮＡ分成两组（１和２），分别于其５′端接上去磷酸化的接头１和接头２（ａｄａｐｔｏｒ１，ａｄａｐｔｏｒ２）。
两接头分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，由一长链（约４０余个核苷酸）和一短链（约１０余个核苷酸）组成的双链ＤＮＡ片段，长链外侧２０余个核苷酸序列与第一次ＰＣＲ引物序列相同，而内侧序列与第二次ＰＣＲ引物序列相同。
抑制消减杂交(SSH)技术的研究与应用
Ｈ ｉ ｎ ｊ ｎ ｎｍ ｌ ｃ ｎ ｅ ｅ ｏ ｇｉ ｇＡ ｉ ａ Ｓ ｉ ｃ ｌ ａ ｅ
ａ ｄ Ｖｅｅｉ ａｙＭｅ ｉｉｅ ｎ ｔｒ ｒ ｄｃｎ ｎ № ２ ２０ ０８
近。 由于 Ｖ Ｐ 在 立 体 结 构 上 与 天 然 病 毒 相 同或 类 Ｌｓ 似， 因此 Ｖ Ｐ Ｌ ｓ能激 发 体 液 免疫 、 细胞 免 疫 和黏 膜 免 疫， 具有 安全 、 高效 的特 点 ， 是很 有发 展前 景 的候 选疫 苗 。但 是 ， 目前 Ｖ Ｐ 主要 通 过基 因工 程 手 段从 酵母 Ｌｓ 或感染重 组杆状 病毒 的昆虫细 胞 中制备 ， 这对操 作者 有 较高 的要求 和较复杂 的试验 操作 条件 。 ３ 利用 反 向遗传 操作 技术制 备的疫 苗
随着 人类 基 因组 计 划 的完 成 及后 基 因组 计划 的 启 动 ， 异基 因表达就 成 了一 项热 门 的技 术 。由于分 差
工程疫 苗及 反 向遗 传疫苗 并存应 用 的局 面。
参 考文献 ：
［ ］ 丁壮 ， １ 金宁一 ， 王兴 龙 ， 鸡 新城疫病毒 Ｈ 等． Ｎ基因亚单 位疫苗
诱导免疫保护 的试验 研究 ［ ］ Ｊ ．动物 医学进 展 ，０ ２ ２ （ ） ２０ ，３ １ ：
４ —５ ． ９ １
清学 方法 无 法 区 别 是疫 苗 株 还 是 野 毒 株 感 染 所 致 。 因此通过 改变免疫 原蛋 白的某 些 中和表 位 ， 构建一 个 能用 合适 的血 清 学 方法 鉴 别 的疫 苗 是 十分 必 要 的 。 Ｐｅｅ ｅｔｓＢＰ等人 通过 反 向遗传 操作 构建 了 Ｎ Ｖ感 染 ｒ Ｄ
３ １ 卵内免疫 疫苗 ．
其 表达外 源基 因 ， 诱 发 对 载体 和表 达基 因的 免疫 。 来 葛金英 等人利 用反 向遗传 操作 技术 以 Ｎ Ｖ 的 ＬＳｔ Ｄ ａｏ ａ 疫 苗株 为载体 ， 入 Ｈ ＡＶ 的 Ｈ Ｎ 插 ＰＩ ５ １株 Ｈ Ａ基 因 ． 研
抑制性消减杂交技术的应用[1]
![抑制性消减杂交技术的应用[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/a11ab97801f69e3143329423.png)
・技术与方法・生物技术通报B I O TECHNOLOGY BULL ET I N2009年第5期抑制性消减杂交技术的应用李小庆 景志忠(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046) 摘 要: 基因的差异表达是调控各种生命活动的核心分子机制,而分离、克隆并进一步研究差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,也是功能基因组学研究的重要内容。
在研究差异表达基因的诸多项技术中,抑制性消减杂交(SSH )技术具有特异性强、假阳性率低、灵敏度高和快速简便等优点,被广泛地应用于生命科学和医学领域的基因差异表达的研究中。
近年来,抑制性消减杂交(SSH )技术得到了相应的改进和完善,而在许多研究领域,该技术在广度和深度上都有了一些新进展。
主要就抑制性消减杂交技术的产生背景、原理、技术流程、特点及其最新应用研究进展等方面作简要综述。
关键词: 抑制性消减杂交 差异表达 功能基因 DS N 均一化技术 c DNA 微阵列Suppressi on Subtracti ve Hybr i di zati on Techn i que andProgress i n the Appli cati onL i Xiaoqing Jing Zhizhong(Lanzhou Veterinary R esearch Institute CAAS,Key Laboratory of Ani m al Parasitology of Gansu P rovince,Key Laboratory of Veterinary PublicHealth of M inistry of Agriculture,S tate Key Laboratory of Veterinary E tiological B iology,Lanzhou 730046) Ab s trac t: D ifferential exp ressi on of genes is the centralmolecular mechanis m of regulating all kinds of life acti ons 1Among all thetechnol ogies of identifying differential exp ressed genes,supp ressi on subtractive hybridizati on (SSH )is considered t o be with high s peci 2ficity,l ow backgr ound,high sensitivity,convenient mani pulati on,and had been widely app lied in life science and medicine research fields 1I n this paper,the p rinci p le,method,characteristics and the research p r ogress of SSH technique were intr oduced 1Key wo rd s: Supp ressi on subtractive hybridizati on D ifferential exp ressi on Functi onal genes DS N (dup lex 2s pecific nuclease )2nor malizati on method c DNA m icr oarray收稿日期:2008211211基金项目:国家自然科学基金项目(30871884),国家高新技术“863”项目(2006AA10A203),甘肃省支撑计划项目(0804NKCA076)作者简介:李小庆(19832),男,硕士,专业方向:畜禽疫病的分子生物学与免疫学通讯作者:景志忠,博士,研究员,主要从事病原与宿主的分子生物学与免疫学研究;E 2mail:zhizhongj@yahoo 1com 1cn 上世纪90年代以来,随着分子生物学技术的快速发展以及多物种包括人类的基因组全序列测定计划的陆续完成,分子生物学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能和表达调控的功能基因组研究,于是多种用于差异表达分析的基因克隆技术相继问世。
抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因
Ｋｔ 总 Ｒ Ａ中分 离 ｍ Ｎ 用 于灵 芝 抑 制差 减 文 库 的构 建 。 ｉ 从 Ｎ Ｒ Ａ，
１３ 抑 制差 异 文 库 的 构 建 与 差 异 基 因的 筛 选 以 液 体 静 置 ．
培 养 第 ２ 的 灵 芝 ｍＲ Ａ作 为 检 测 组 （ 时 开 始 形 成 气 生 菌 天 Ｎ 此 丝 和 无 性 孢 子 ）振 荡 培 养 第 ２ 的灵 芝 ｍＲ Ａ作 为 对 照 组 ， ， 天 Ｎ 构 建 差 异 表 达 文 库 。 文 库 的 构 建 依 据 Ｃｏｔｃ 公 司 的 Ｔ ｅ ｌｎｅｈ ｈ
异表达的克隆进行测序。
１ ． 灵芝 ＧＤ ｃ Ｎ ４ Ｄ Ａ的 克 隆 根 据 从 文 库 中 筛 选 获 得 的 一 个 克 隆 ３ 的 序 列 ， 用 ｃ Ｎ 末 端 快 速 扩 增 （ Ａ Ｅ 法 分 Ｇ８ 利 Ｄ Ａ Ｒ Ｃ ）
别获得 它的两端 序列 ， 终拼 接后获得 灵芝 Ｇ 最 ｂ基 因 的全 长 ｃＮ Ｄ Ａ序 列 。 Ｒ Ｃ Ａ Ｅ试 验 采 用 Ｔ ｋ ｒ公 司 的 ５一ａ ｄ３一Ｆ ｌ ａａａ ｎ ｕｌ Ｒ Ｃ ｉ进 行 。 扩 增 用 到 的 引 物 分 别 为 ： Ｒ Ｃ ｕｅ： Ａ Ｅ Ｋｔ ５一 Ａ Ｅｏ ｔ ｒ
Ｍａｍｉ Ｍ Ｓ Ｂ ｒｅ 定 量 Ｐ Ｒ试 剂 盒 进 行 测 定 。设 计 ｘ ｍａ Ｙ Ｒ Ｇ ｅｎ Ｔ Ｃ
个在灵 芝液体静置培养 中表达上调 （ 相对 于振荡培养 ） ＧＩ 的 ３
基 因 Ｅ Ｔ 列 ， 根据 Ｅ Ｔ 隆了这个基 因的全长 ｃ Ｎ Ｓ序 并 Ｓ克 Ｄ Ａ序 列 ． 用 实 时 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ的方 法 分 析 了它 在 两 种 不 同 培 养 采 Ｃ 方 式 下 的 动 态 表 达 情 况 ， 深 入 了解 Ｇ３ 白在 灵 芝 中 的 生 为 Ｉ 蛋 物 学 功 能 奠 定 了基 础 。
抑制性差减杂交技术_SSH_在植物学研究中的应用
抑制性差减杂交技术( SSH) 在植物学研究中的应用
阎爱华, 王冬梅
( 河北农业大学 生命科学学院, 河北 保定 071001)
摘要 : 抑制性差减杂交是一种基于转录水平的杂交技术, 能将差异表达 基因扩增 千倍后富集, 具有 高效、灵 敏、操 作简单, 假阳性率低等特点, 已经越来越多的被应用在植物学研究领域。就该 技术的原理、特点 及其在植物 学方面的 应用研究进展作一简要介绍。
DNA 微阵列技术 DNA microarray
巨克隆技术 M egaclone
将基因片段、寡聚核苷酸、cDNA 等固定 在硅质、塑料、玻 璃或尼龙膜 上, 用不 同组 织或 来源 的 mRNA 制 成探 针, 与芯片杂 交, 根 据信 号 查找 差 异 片段 并 进行 克 隆 和分 析。 cDNA 连上不 同的标签 ( tag ) , 与 带有 antitag 的 microbeads 杂交, 固定 cDNA, 并 且每 个 microbead 上 只与 一个 c。
基因差异表达分析方法
Methods of different gene expression techniques
基本原理
The basic principles of different gene expression techniques
优点 Advantage
缺点 Disadvantage
mRNA 差异显示 PCR mRNA differential display
收稿日期: 2008- 08- 11 基金项目: 国家自然科学基金资助项目( 30671244) ; 河北省应有基础研究计 划重点基础研究 项目资助( 08965505D) ; 河北省自然科 学基金
抑制差减杂交技术原理及常见操作结果分析
将RsaI酶切完全的cDNA用adapter1和adapter2R两 种接头连接。通过PCR扩增检测连接效率。 PCR的引物根据RsaI位点和adapter1、adapter2R 的序列设计。这一般要求扩增的片段中不含RsaI 位点序列。在扩增后琼脂糖胶电泳检测结果中, 如果用一个基因特异性引物和一个接头引物所得 到的带亮度与两个基因特异性引物所得到的带的 亮度一致,说明连接较好;如果用一个基因特异性 引物和一个接头引物所得到的带亮度只有两个基 因特异性引物所得到的带的亮度的25%,则说明连 接效率不到25%,应检查RsaI酶切效果并重新连接。
3 抑制差减杂交技术的优缺点
3.1 与其他几种方法相比,SSH技术具有较明显的优越性: (1)通过两步消减杂交和两次抑制PCR可DDRTPCR和cDNA-RDA法中,低丰度的 mRNA一般不易被检测到,SSH方法所做的均等化和目 标片段的富集,保证了低丰度mRNA 也可被检测出。 (3)速度快,效率高。一次SSH反应可 以同时分离几十或成百个差异表 达基因。
抑制差减杂交技术原理 及常见操作结果分析
摘要
抑制差减杂交 (SuppressionSubtractiveHybridization,SSH)是一种 高效鉴定和分离克隆差异表达基因的新技术。 目前,该技术在分子生物学研究的各个领域得 到了广泛的应用作了较全面的介绍,可为研究者们 提供参考。
2.4 第一次杂交、第二次杂交和PCR扩增
将经RsaI消化的drivercDNA和分别连接有adapter1、 adapter2R的testercDNA混合进行第一次杂交。再将第一次 杂交的两个样本混合在一起,同时加入新鲜的drivercDNA, 以进一步富集差异表达序列。在两端具不同接头的差异 表达的cDNA形成新的杂交分子。
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巢式PCR反应：巢式PCR是一种 变异的聚合酶链反应(PCR)，使 用两对（而非一对）PCR引物扩 增完整的片段。第一对PCR引物 扩增片段和普通PCR相似。第二 对引物称为巢式引物，结合在 第一次PCR产物内部，使得第二 次PCR扩增片段短于第一次扩增。 巢式PCR的好处在于，如果第一 次扩增产生了错误片断，则第 二次能在错误片段上进行引物 配对并扩增的概率极低。因此， 巢式PCR的扩增非常特异性
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抑制消减杂交的原理
杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产 生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在 丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR原理：利用链内退火优于链间退火的特点，使 非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡 的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制 了非目的基因片段的扩增。
大肠杆菌
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抑制消减杂交的实验过程
蓝白斑筛选示意图
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抑制消减杂交的实验过程
分子杂交
定义：确定单链核酸碱基序 列的技术。其基本原理是待 测单链核酸与已知序列的单 链核酸（叫做探针）间通过 碱基配对形成可检出的双螺 旋片段。这种技术可在DNA 与DNA，RNA与RNA，或 DNA与RNA之间进行，形成 DNA-DNA，RNA-RNA或 RNA-DNA等不同类型的杂 交分子。
PCR-TOPO 载体(T载体的一种)
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抑制消减杂交的实验过程
※ TA克隆构建原理： TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产 物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一 个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶 作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的 多克隆位点（MCS）中。
人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交
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抑制消减杂交的实验过程
1.探针的制备
探针是一段标记核酸序列，可与靶序列 互补形成杂交双链，通过检测杂交链信 号即可对靶序列DNA的存在及其分子大 小加以鉴别. 探针可以是克隆的，也可以是合成的。 用PCR扩增产物可制备探针。也可用提 纯的质粒进行标记制备探针
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抑制消减杂交的实验过程
driver准备:对于driver的ds cDNA只需经Rsa I或HacⅢ限制性内切酶
酶切成短片段，而不需添加接头。
消减杂交:分别向两个tester样品中加入过量的driver cDNA，于杂交缓
冲液中进行杂交反应。第一轮杂交反应完毕后，将两个tester样品混合， 再加入过量变性的driver cDNA继续杂交反应。获得作为PCR扩增模板 的差异表达序列。
斑点杂交点膜
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抑制消减杂交技术的优点
抑制消减杂交技术的优点
1
2
3
4
本技术对高、 低丰度的差异 表达基因都能 有效分离。主 要原因是该技 术利用了杂交 二级动力学原 理
简便易行及重 复性好：本技 术所采用的方 法简单、成熟、 易掌握，易操 作，且假阳性 率低
灵敏度高：用 抑制消减杂交 技术仅需要 1~2ug的 mRNA
tester准备:产生平头ds cDNA后，用Rsa I或Hae Ⅲ限制性内切酶将ds
cDNA酶切成短片段，将tester cDNA分为两组，在T4连接酶的作用下 分别在cDNA的5‘端连上两个不同的寡聚核苷酸接头(接头1和接头2).接 头1和接头2分别是具有一段反向末端重复序列的寡核苷酸序列，以利 于以后的选择性扩增。
抑制消减杂交
要了解人体各项生命活动的 分子调控机制，就必须将这 些差异表达的基因分离、 鉴定作深入研究
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抑制消减杂交的原理
抑制性消减杂交技术的定义：
是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术. 其原理是以杂交二级动力学和抑制性PCR反应为基础的 cDNA消减杂交技术.通过合成两个不同的接头，连接于 测试cDNA片段的5’末端，达到选择性扩增差异性表达 的cDNA片段，抑制非目的cDNA的扩增.该技术与其他 消减杂交技术相比 假阳性率低、敏感性高、效率高等 优点而得到广泛应用.
快速：应用 这种方法一 般3~4天即 可获得差异 表达基因片 段的cDNA
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抑制消减杂交技术的应用
肿瘤——大鼠高转移细胞株与低转移细胞株的比较
免疫学——T细饱杂交瘤比较获得一个新的TNF家族成员
TRANCE基因，编码产物能调节T细胞依赖免疫反应
应 用
器官发育——睾丸特异表达基因的研究 信号转导——NF-KB和IAP(凋亡抑制剂)参与TNF诱导细
巢式PCR示意图
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抑制消减杂交
杂交双方为tester和driver ,tester含有要寻找的差异表达基因
合成ds cDNA:提取待比较的两组细胞的mRNA，利用3‘端引物将
mRNA反转录为cDNA，根据真核生物mRNA序列3'端具有poly A结构 的特点，合成3'端引物.反转录体系中要加入T4 DNA聚合酶以产生平头 cDNA 。
核酸
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抑制消减杂交的实验过程
探针的种类
RNA探针 cDNA探针
探针种 类
合成寡核苷酸 探针
基因组探针
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抑制消减杂交杂交的实验过程
探针的标记方法
放射性同位素标记：常见的为32P,它能量高信号强。放射性同位素具辐射 危害和半衰期限制。 光敏生物素标记：标记简单，但是效率较低，对于短探针不宜使用。
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抑制消减杂交的实验过程
※蓝白斑筛选原理：
大肠杆菌（ β-半乳糖苷酶缺陷型菌株）β-半 乳糖苷酶可分成2部分即α肽段和C-段。α肽 段的基因位于载体上并含有不影响其ORF （open reading ）的多克隆位点（MCS）， 而C-段的基因位于工程菌E. coli DH5α上。 二者在同一菌株中表达时，菌株中的C-段与 载体上的α肽段互补而具有酶活性，能将无 色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛 蓝。在MCS上插入新基因将会改变其ORF而 使得载体上的α肽段不能与菌株中的C-段互 补而不能将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的 物质5-溴-4-靛蓝而产生白斑。选择转入的阳 性克隆即选择白斑。
PCR反应:杂交产物中两端连有不同接头的片段就是所寻找的差异表
达基因。经补平末端后进行巢式PCR扩增以获得所需要的差异表达基 因。
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抑制消减杂交的实验过程消减的克隆:经巢式PCR扩增得到所需要的差异表 达基因后，利用TA克隆法将 差异表达基因转化感受态大 肠杆菌，根据蓝白斑筛选原 理，筛选出转化成功的阳性 菌落。最后根据插入片段的 两端接头引物进行巢式PCR反 应对插入片段进行特异性扩 增。
抑制消减杂交的原理及应用
尚立娜
主要内容
1
抑制消减杂交的定义
2
抑制消减杂交的基本原理及实验过程
3
抑制消减杂交技术的优点
4
抑制消减杂交技术的应用
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抑制消减杂交的定义
人类基因组包括100000 个不同的基因，但对于每个 细胞而言一般只有15 000 种基因表达
基因的选择性表达决定 了生物体的各项生命活动 动
1 southern blotting
将DNA电泳转印到固相支持物上，用探针（DNA/DNA杂交）进行 检测的方法。是基因分离和鉴定的重要手段，广泛用于遗传多态性分 析 利用类似Southern印迹法的方法对蛋白质进行印迹分析，蛋白质经 单向电泳分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的 特异抗体来检测相应抗原的存在。 mRNA样品经电泳分离后，转移到硝酸纤维素膜上，与放射性标记 的DNA探针进行杂交，经放射自显影，即可检测特异性mRNA分子 在样品中存在与否及其长度大小
胞死亡信号转导的研究
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2 Western blotting 3 northern blotting
4 dot blotting
斑点杂交是将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后 与核酸探针分子杂交以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。
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抑制消减杂交的实验过程
※斑点杂交：
将核酸点在能与核酸结合的膜（硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯膜等）上， 经80℃烘烤或紫外光照等处理使核酸固定在膜上，然后与标记探针进行分子 杂交，用放射自显影或非放射性显色检测。并做定性或半定量分析。
荧光素标记：用荧光素标记核酸；用荧光素标记抗生物素蛋白或抗地高辛 抗体。 地高辛标记：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连。 酶促生物素标记：生物素与dUTP中尿嘧啶的C5相连，在聚合酶作用下掺 入DNA 生物素标记:将生物素链接在核酸探针上，利用亲和素对生物素有极高亲和 力的原理，分子杂交后用亲和素或链酶亲和素进行检测
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抑制消减杂交的实验过程
2核酸分子杂交方法的分类
PCRSouthern 杂交
dot blotting
Western blotting
Southern blotting
Northern blotting
In Situ Hybridization
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抑制消减杂交的实验过程
杂交主要方法及应用