沉降菌测试方法..
洁净室沉降菌的测试方法
洁净室沉降菌的测试方法洁净室是用来生产和制造高品质产品的特殊环境，需要控制空气中的微生物污染。
沉降菌测试是衡量洁净室内微生物污染水平的重要方法之一、本文将介绍洁净室沉降菌的测试方法。
1.选择合适的培养基：根据待测试的微生物类型选择适当的培养基，如悬浮菌落培养基或接触菌落培养基等。
培养基的选择要根据标准要求和实际情况来确定。
2.准备培养皿：使用无菌的培养皿，通过高温高压或紫外线照射来消毒。
将培养基倒入培养皿，接种前将培养皿密封。
3.放置培养皿：将密封好的培养皿放置在洁净室内，放置时间通常为1小时或更长，以充分收集空气中的沉降菌。
4.培养：根据培养基的要求，在适当的温度和湿度条件下进行培养。
通常在30-37摄氏度下培养24-48小时。
5.计数和鉴定：观察培养皿中的菌落数量和形态，根据标准要求进行计数和鉴定。
沉降菌的计数应该进行按规则的网格方式或无规则的计数方式。
同时，需要鉴定潜在的病原微生物，并进行鉴定和分类。
6.数据分析：根据测试结果进行数据分析，比较测试结果与洁净室微生物污染的标准。
分析结果应该包括沉降菌数量、种类和类别等。
7.制定控制措施：根据测试结果和分析，在必要时制定相应的控制措施，如增加过滤器或消毒措施等，以减少洁净室内微生物的污染。
需要注意的是，洁净室沉降菌测试是一种单点测试，只能反映特定时间段和特定位置的微生物污染水平。
因此，对于一个洁净室来说，需要多次进行沉降菌测试，并在不同时间段和位置进行测试，以全面了解洁净室内的微生物污染情况。
此外，洁净室沉降菌测试还应注意以下几点：1.操作人员应具备微生物测试和洁净室操作的专业知识和技能，遵守操作规程和标准。
2.培养基的制备和培养条件的控制应严格按照标准要求进行。
3.培养皿的密封和消毒要做到无菌操作。
4.样品收集和出租的时间要有一定的规律和标准，以保证测试结果的准确性和可比性。
总之，洁净室沉降菌测试是评估洁净室内微生物污染水平的重要测试方法。
沉降菌的测试方法国家标准
ISC 13.040.30 C 30中华人民共和国国家标准GB/T 16294—2010代替GB/T 16294—1996医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法Test method for settling microbe in cleanroom (zone) of the pharmaceutical industry前言本标准参考了ISO 14698-1《洁净间以及相关环境控制第1部分：微生物控制》，ISO/TS 11133-1：2000（英文版）《食品和动物饲料的微生物学培养基制备和生产指南第1部分：实验室培养基制备的质量保证通用指南》。
本标准代替GB/T 16294-1996《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》。
本标准与GB/T 16294-1996的主要区别为：—增加了确定最少采样点数目的方法；—修改了原标准 4.8.3.2，改为“4.10.2 采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃~35℃培养箱中培养，时间不少于2d，采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20℃~25℃培养箱中培养，时间不少于5d。
”；—本标准增加了5.8“日常监控”的内容，增加了洁净室（区）空气微生物浓度控制的纠偏限度和警戒限度的设立和如何确定取样频次的内容。
本标准的附录A、附录B是规范性附录。
本标准的附录C是资料性附录。
本标准由国家食品药品监督管理局提出并归口。
本标准起草单位：上海市食品药品包装材料测试所、中国食品药品检定研究院医疗器械检验中心。
本标准主要起草人：陆维怡、徐敏凤、冯晓明、王志敏。
本标准所代替标准的历次标本发布情况为：GB/T 16294-1996。
医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法1 范围本标准规定了医药工业洁净室和洁净区中沉降菌测试条件、测试方法。
本标准适用于医药工业洁净室和洁净区，无菌室或局部空气净化区域（包括洁净工作台）的沉降菌的测试和环境的验证。
沉降菌测试方法
沉降菌测试方法1、把ф90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15m l。
3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。
制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。
4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。
打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。
6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。
被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。
测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10mi n后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30m i n 后开始。
8、平均菌落数计算：M 1+M 2+M 3 平均菌落数=.........21nMnM M ++ n —培养皿总数 M 1—1号培养皿菌落数 M 2—2号培养皿菌落数 M n —n 号培养皿菌落数用平均菌落数判断洁净空气中微生物。
沉降菌检测
微生物检测一、沉降菌：用标准提及的方法收集到的活微生物粒子，通过专用的培养基，在适宜的生长条件下繁殖到可见的菌落数。
二、测试方法：采用沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿（一般多采用90mm直径硼硅酸玻璃培养皿，俗称沉降碟），经若干时间，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
三、采集的沉降菌为静态检测。
四、所需物料：（1）90mm培养皿：72个；（2）棉拭子：10个；五、沉降菌检测步骤：1、检测布点：生物安全柜（6个）；水平层流台（6个）；调配间（8个）；一更（3个）；二更（3个）；清洗间（3个）；2、通常的检测应在风机开启至少30min以上，紫外线照射30min，关闭紫外灯后开始采样。
3、将培养皿按采样点布置逐个放置，从内向外放置，摆放距离地面不低于60cm，培养皿暴露时间不得少于30min，不得大于4h。
操作台调配间一更/二更/清洗4、全部采样结束后，将二批杨敏倒置放置，随后送至检验科进行培养（2小时内送检）；每批均应有培养基对照实验，检验培养基本身是否污染，可每批做对照实验，与采样皿同法操作但不需暴露采样。
5、注意事项：（1）布置采样点时，至少应尽量避免尘粒较集中的回风口，采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量减少走动；（2）采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除；（3）采样时摆放顺序为从里向外，净化台-调配间-二更-清洗间-一更。
回收培养皿时顺序相反。
（4）从检验科取来的培养皿不用时应在冷藏柜（2-8℃）保存。
（5）净化台沉降菌检测可轮流做，不必每个净化台都做检测；（6）二更和调配间均为万级，可轮流做检测；一更和清洗间为十万级，也可轮流做检测。
6、结果测定：（1）每个测点的沉降菌平均菌落数必须低于所选定评定标准的界限；（2）在静态测试时，若某测点的沉降菌平均菌落数超过评定标准，则应重新采样两次，两次结果均为合格才能判为符合；（3）洁净室沉降技术要求：洁净室沉降菌技术要求六、物体表面检测项目：1、物体表面检测：对静配中心洁净区内的各物体表面（操作台面、门把手、传递窗、大小推车、洁净服等）存在的病原微生物进行监控，达到规定标准，以保证所调配的输液质量。
车间洁净区沉降菌测试办法
5.0测试规则：5.1测试状态：5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在技术指标规定值内。
5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。
5.1.3测试状态有动态和静态两种，应注明测试状态。
5.2测试时间：5.2.1对单向流，如百级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。
5.2.2对非单向流，如万级、十万级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。
5.3采样点：5.3.1采样点数目：沉降法的最少采样点数可按表1确定。
表1 最少采样点数目面积m2洁净度级别100 10000 100000＜10≤≥≥10～＜20 ≥20～＜40 ≥40～＜100 ≥100～＜200 ≥200～＜400 ≥400～＜1000 ≥1000～＜20002000 2～3481640801604008002224102040100200222236133263注：表面的面积，对于单向流洁净室，是指送风面积。
对于非单向流洁净室是指房间的面积。
在满足最少采样点的同时，还宜满足最少培养皿数，见表2。
表2 最少培养皿数洁净度级别所需¢90mm培养皿数（以沉降0.5h计）100 10000 100000 14 2 25.3.2采样点位置：工作区采样点的位置离地0.8～1.5m。
6.0相关文件和记录：附表1：洁净室（区）技术指标监测项目技术指标监测频次10000级100000级300000级温度℃18~28 2次/班相对湿度% 45~65 2次/班换气次数，次/h ≥20 ≥15 ≥12 1次/月静压差Pa不同级别洁净室（区）之间＞5 2次/班洁净室（区）与非洁净室（区）之间＞5 1次/月洁净室（区）与室外大气＞10（最好不超过35）尘埃数个/m3≥0.5um ≤350000 ≤3500000 ≤10500000 1次/季≥5um ≤2000 ≤20000 ≤60000沉降菌数，个/皿≤3 ≤10 ≤15 1次/周。
车间洁净区沉降菌测试办法
4.1检验依据：GB/T16294-2010 医药工业洁净室(区)沉降菌的测试方法YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范4.2方法概述：采用沉降法，即通过自然沉降原理收集空气中的生物粒子于培养基平皿，经若干时间在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落进行计数，以平板培养皿中的菌落数来判定洁净环境中的活微生物数，并以此来评定洁净室（区）的洁净度。
4.3仪器和设备：高压蒸汽灭菌锅恒温培养箱培养皿，¢90mm×15mm硅硼酸玻璃培养皿培养基，大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）或沙氏培养基（SDA）4.4准备操作：将¢90mm培养皿置于121℃湿热灭菌20min或180℃干热灭菌2h。
按比例配置营养琼脂培养基，将其装入三角烧瓶，置于121℃湿热灭菌30min。
将加热溶化并冷却至45℃，在无菌操作要求下将培养基倒入培养皿，一般15ml/皿。
4.5采样方法：将已制好的培养皿按相关要求放置，打开培养皿盖（口向下），使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。
4.6培养：全部采样结束后将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。
大豆酪蛋白琼脂培养基，培养温度34℃，培养时间：2d；沙氏培养基，培养温度：24℃，培养时间：5d。
每批培养基选定3只培养皿做对照培养。
4.6菌落计数：用肉眼直接计数，然后用5~10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
计数时一般透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落。
4.7结果评定：用平均菌落数判断洁净室（区）空气中的微生物。
4.8注意事项：4.8.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
4.8.2对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4.8.3采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现破损或污染的应剔除。
5.0测试规则：5.1测试状态：5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在技术指标规定值内。
沉降菌测试方法
三、钙盐
1、配制标准溶液：
称取分析纯草酸铵3.5g，定溶至100ml容量瓶，贴标签。
2、分析：取样50ml平等样2份，倒入试管中，加2ml草酸铵溶液，均不得发生浑浊。
四、二氧化碳
1、配制标准溶液：
称取分析纯氢氧化钙0.3g，定溶至100ml容量瓶，用橡皮塞塞紧，用力振摇，放置1小时，用时取清液。
2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养48小时，应无菌生长。
改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。
一、氯化物
1、配制标准溶液：0.1mol/L硝酸银溶液。
称取1.6987g分析纯硝酸银，定溶至100ml容量瓶中，转入棕色试剂瓶中，避光保存，贴标签。
2、取样，量取50ml样品水平行样（2份）倒入试管中，加5滴硝酸，再加入1ml硝酸银。均不得发生浑浊。
二、硫酸盐
1、配制标准溶液：称取5±0.5g氯化钡（分析纯），定溶至100ml容量瓶，倒入试剂瓶，贴标签。（如果浑浊，把蒸馏水烧开，放凉再用）
临用前，精确量取铅标准贮备液稀释至所需浓度。
2、分析：取样40ml，加醋酸盐缓冲液2ml，加硫代乙酰胺试液2ml，摇匀，放置2分钟。取38ml样品水加2ml铅标液加醋酸盐缓冲液2ml加硫代乙酰胺2ml，对比颜色；40ml样品水的颜色不得比铅标液的对照管深。（铅的含量0.00005%）
八、不挥发物：
1、取干净蒸发皿200ml2个，分别标号放入105℃干燥箱中。
无菌室沉降菌测试标准操作规程
无菌室沉降菌测试标准操作规程一、目的：建立无菌室中沉降菌的测试标准操作规程，保证微生物检验在规定洁净级别内进行。
二、范围：无菌室的沉降菌的监测。
三、依据：国家标准GB/T 16294-1996。
四、职责：微生物检验人员对本制度的实施负责。
五、内容1、菌落：细菌培养后，由一个或几个细菌繁殖而形成的一细菌集落，简称CFU。
通常用个数表示。
2、测试方法：沉降法，即通过自然沉降原理收集在空气中的生物粒子于培养基平皿，经48小时以上培养，在适宜的条件下让其繁殖到可见的菌落数，来评定洁净环境内的活微生物数，并以此来评定洁净室的洁净度。
3、所用的仪器和设备1）高压灭菌锅锅2）恒温培养箱：必须定期对培养箱进行检定。
3）培养皿：一般采用中90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿。
使用前将培养皿置于121℃湿热灭菌20分钟。
4、培养基：普通营养琼脂培养基。
将培养基加热熔化，冷却至约45℃在无菌操作条件下将培养基注入培养皿，每皿约15m1。
待琼脂培养基凝固后，将培养基平皿放入30～35℃恒温培养箱中培养数小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可供采样用，制备好的培养基平皿应在2～8℃的环境中存放。
5、测试步骤1）采样方法：将已制备好的培养皿放置在预先确定的取样点，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上盖后倒置。
2）培养，时间不少于48小时。
每批培养基应有对照试验，检查培养基本身是否污染，可每批选定3只培养皿作对照培养。
3）菌落计数：用肉眼直接计数，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上的菌落计数。
6、注意事项1）测试用具要做灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。
2）采取一切措施防止人为对样本的污染。
3）对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。
4）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。
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平均菌落=
n—培养皿总数
M1—1号培养皿菌落数
M2—2号培养皿菌落数
Mn—n号培养皿菌落数
用平均菌落数判断洁净空气中微生物。洁净室内平均菌落数必须低于所选定的评定标准，（100级≤1个；10000级≤3个；100000级≤10个）。若某洁净室内平均菌落数超过标准，则必须对此区域先进行消毒，然后重新采样两次，测试结果均须合格。
沉降菌测试方法
1、把ф90mm×15mm硼硅酸玻璃培养皿包在报纸里，放入恒温烤箱中加热至180℃后，干烤2小时。
2、取X克培养基放入X克蒸馏水，放入高压消毒锅中加热溶化，冷至45℃时，在无菌操作要求下将培养基注入培养皿，每皿约15ml。
3、待琼脂凝固后，将培养基平皿倒置于33℃恒温培养箱中培养48小时，若培养基平皿上确无菌落生长，即可采样用。制备好培养皿宜在2—8℃环境中保存。
把细菌内毒素检查水4支外表擦净打开，倒入烧杯中，用移液管取25.8ml倒入装3只瓣膜烧杯中，用锡纸封口，放进提前打开升温至37℃恒温培养箱中，培养1.5小时。供试液贮存应不超过2小时。
注：V-浸提介质体积，单位为毫升（ml）
L-产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EV/ml）
≥0.3
换气次数——≥20 ≥15 ≥12 1次/月
静压差Pa 不同级别洁净室及洁净室与非洁净室之间≥5
洁净室与室外大气≥10 1次/月
沉降菌数 ≤1 ≤3 ≤10 ≤15 GB/T16294-1996 1次/周
附录C（资料性附录）洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净室（区）沉降菌技术要求
洁净度
级别
澳大利亚TGA
人员进出洁净生产区的一般程序：
进
出
人员进出无菌操作洁净生产区程序：
进
出
无菌医疗器具洁净室环境要求及监测：
监测项目技术指标监测方法监测频次
100级10000级100000级300000级
温度（℃）18℃—28℃1次/班
相对湿度% 45~65 1次/班
水平层流
风速m/s≥0.4——————JC
垂直层流1次/月
-
10000
C级
≤50
C级
≤50
≤5
≤3
100000
D级
≤100
D级
≤100
≤50
≤10
为培养皿暴露时间不超过4h，以平均菌落数表示。
无菌检查法试验步骤
无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。
1、器具灭菌：培养皿若干个（报纸所好）、试管、剪刀、镊子等装入盒中置电热干燥箱内180℃，2小时。
4、操作时，应用适当的消毒液对供试品表面或外包装擦拭消毒后，以无菌方法取内容物。取供试品3只接种于足以浸没供试品的适量培养基中。一只瓣膜接种于硫乙醇酸盐流体培养基中，轻轻摇动，使瓣膜与培养基混合，1支试管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1ml,作阳性对照，1支作空白对照。另取2只瓣膜接种于改良马丁培养基中，2支试管作空白对照。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养，改良马丁置24℃培养阳性对照管培养48小时后应有菌生长。
CGMP
(2002年8月16日)
欧盟EU CGMP
附录l
(2008年2月)
美国FDA
CGMP
（2004年9月）
药品生产质量管理规范
（1998修订）
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
φ90mm
CFU/4ha
沉降菌/皿，0.5h
100
A级
＜1
A级
＜1
＜1
≤1
-
B级
≤5
B级
≤5
≤3（1000级）
营养琼脂根据实际用量按一皿装15ml，分装几个皿来计算，灭菌。
0.9%氯化钠分装至7支试管，封口，灭菌。
3、把金黄色葡萄球菌用接种环刮一下，放入0.9%氯化钠试管中摇匀，作10倍系列稀释至10-7，然后从10-5、10-6、10-7试管各抽取1ml，分别放入标号5#、6#、7#培养皿里，倒入营养琼脂摇匀，（营养琼脂不能太烫，以不烫手为准）待营养琼脂冷却后倒置放入33℃培养箱中培养48小时，48小时中取出观察计数，根据菌落数小于100cfu来决定用几号。
4、采样时，一般在100级层流罩中放置3个培养皿，在100000级，10000级按面积大小一般放2个培养皿。打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5小时，再将培养皿盖上后倒置于恒温培养箱33℃培养，时间不小于48小时，采样点位置离地0.8m—1.5m左右。
5、将培养皿举起用肉眼直接计数，用记号笔点记然后用5—10倍放大镜检查是否遗漏，若培养皿上有2个或2个以上菌落重叠，分辨时仍以2个或2个以上菌落计数，不要漏计培养皿边缘生长菌落，并注意细菌菌落与培养基沉淀物区别。
试验所用器皿需经处理除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿置电热干燥箱内180℃干烤至少2小时。
细菌内毒素检查水10ml×4支
细菌内毒素工作标准品1支，每安瓿含内毒素10EU
鲎试剂 0.1ml×8支
同一批号3支瓣膜
浸提介质：细菌内毒素检查水
浸提介质体积计算公式：V= =8.6（ml）
8.6×3=25.8（ml）
5、结果判断：在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养14天后，若供试品管匀澄清，判供试品符合规定；若供试品管中任何一管显浑浊并有菌生长，判供试品不符合规定。
细菌内毒素试验步骤：
1、准备工作：
移液管：0.1ml1支，1ml10支
试管：10ml×4支，试管架2个（大小）
烧杯40ml2个，锥形瓶2个
2、硫乙醇酸盐流体培养基（细菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装至适宜的容器中，瓶塞封口，灭菌。硫乙醇酸盐流体培养基置33℃培养48小时，应无菌生长。
改良马丁培养基（真菌），根据试验实际用量取若干培养基和蒸馏水，煮沸，摇匀，分装，灭菌。改良马丁培养基置24℃培养72小时，应无菌生长。
6、沉降菌测试前，被测洁净室已消毒。被测洁净室温湿度须达到规定要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内，测试状态有静态和动态两种，测试状态选择须符合生产要求，并在报告中注明测试状态。
7、测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别工作服，静态测试时，室内测试人员不得多于2人。测试时间对单向流100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始，对非单向流，100000级以上净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。