生化技术课件第二章沉淀
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
达到平衡为止
• “保留液” • “渗出液”或“透
析液”
• MwCO
• 扩散压(透析的动力)
• 透析的速度:
膜的厚度 溶质的浓度梯度 膜的面积 温度
• 检查透析效果的方法是：用 BaCl2检查
(NH4)2SO4，用 AgNO3 检查NaCl、KCl等
制备核酸
• DNA-蛋白质(DNP)
• RNA-蛋白质(RNP)
脱盐
• 常用方法：凝胶过滤法和透析法
• 透析法：
有机溶剂沉淀法
⑴基本原理 ①降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小 ②有机溶剂脱水作用
有机溶剂沉淀法的优点是：
①分辨能力比盐析法高
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易
其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引 起变性失活，操作需在低温下进行
有机溶剂的选择和浓度的计算
• 以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，
即可得到盐析曲线
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度％
盐析的影响因素：主要盐析常数Ks
1) 蛋白质的浓度： 较适中的浓度0.2 %～ 2.0%
2) pH值对盐析的影响：pI
3) 温度的影响：离子强度 0℃～4℃
•pH值：pI附近
•离子强度：盐浓度<5%，V<2倍
蛋白质沉淀法
• 仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用 • 碱性蛋白质、凝集素、种金属
有机聚合物沉淀法
聚乙二醇
[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)] (Polyethylene Glycol , PEG )
➢亲水性强，溶于水和许多有机溶剂 ➢对热稳定 ➢有广范围的分子量
用过滤方法
• 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中
查出。
盐析曲线的制作
• 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和 度。具体操作方法如下：
• 取待分离样品溶液(已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度)，
冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次 分别加入不同量的硫酸铵
• 与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。
• 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂
浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下 式计算：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
有机溶剂沉淀的影响因素
•温度：
一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高
•样品浓度：蛋白质初浓度：
5mg/mL～20mg/mL
• 第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚开始出现沉淀时，记下
所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点
• 继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得
到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第 二个级分，如此连续可得到6～10个级分
• 按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱
和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力
DNP／RNP复合物的解聚
• 去污剂 • 有机溶剂 • 蛋白水解酶
(1)去污剂
• 十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40 …… • 乙酸钾溶液 • 离心除去沉淀物 • 上清液即为初步纯化的核酸制品
(2)有机溶剂
• 苯酚、氯仿 • 上层水相(含核酸)和下层有机相 • 界面：变性凝聚蛋白 • 收集水相
• 中性盐沉淀法（盐析法） • 有机溶剂沉淀法 • 蛋白质沉淀法 • 有机聚合物沉淀 • 选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） • 结晶沉淀法
中性盐沉淀（盐析法）
• 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过
程称为“盐析”。
在蛋白质领域应用最广，其突出的优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
注意点 ：
①水相和有机相的位置 ②充分接触，速度适当 ③苯酚重新蒸馏 ④异戊醇混合液
• 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
沉淀法
• 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
• 基本原理：溶解度的不同 • 不同溶解度的产生的原因：亲和力的差异
溶解度的大小与下列因素有关：
✓ 溶质和溶剂的化学性质及结构 ✓ 加入某些沉淀剂 ✓ 溶液的pH值、离子强度和极性
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
结晶沉淀法：
在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。 不等同于等电点沉淀法
透析
• 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有近150年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术 之一
作用:
• 除盐 • 除少量有机溶剂 • 除去生物小分子杂质 • 浓缩样品
• 半透膜：纤维素 • 将半透膜制成袋状 • 袋内外两边的浓度
18.9
NaH2PO4
1.6
7.8
95.3
103
43.3
42.2
93.8
101
2) 分离效果好 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4) 价格便宜，废液不污染环境
•缺点：需要一定时间脱盐
盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法
• 最常用的是固体硫酸铵加入法 • 原则：缓慢均匀少量
• 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常
• 在生物大 分子制备 中 ，用的 较多的是 分子量为 400 ～
6000 的 PEG
本方法的优点：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性
②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当 多的生物大分子
③沉淀后有机聚合物容易去除
选择性变性沉淀法
原理：利用理化性质等方面的差异 ⑴ 热变性 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ⑶ 选择性酸碱变性
中性盐沉淀Baidu Nhomakorabea白质的基本原理
盐分级沉淀：多次盐析的应用
中性盐的选择： 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它
与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4)2SO4 70.6
75.4
Na2SO4
4.9
第二章 生物大分子的纯化方法
概述 • 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题
• 达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题 。
常用的分离纯化方法和技术有：
• 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性
沉淀等）
• 离心 • 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲
和层析
• “保留液” • “渗出液”或“透
析液”
• MwCO
• 扩散压(透析的动力)
• 透析的速度:
膜的厚度 溶质的浓度梯度 膜的面积 温度
• 检查透析效果的方法是：用 BaCl2检查
(NH4)2SO4，用 AgNO3 检查NaCl、KCl等
制备核酸
• DNA-蛋白质(DNP)
• RNA-蛋白质(RNP)
脱盐
• 常用方法：凝胶过滤法和透析法
• 透析法：
有机溶剂沉淀法
⑴基本原理 ①降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小 ②有机溶剂脱水作用
有机溶剂沉淀法的优点是：
①分辨能力比盐析法高
②沉淀不用脱盐，过滤比较容易
其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引 起变性失活，操作需在低温下进行
有机溶剂的选择和浓度的计算
• 以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，
即可得到盐析曲线
蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫铵饱和度％
盐析的影响因素：主要盐析常数Ks
1) 蛋白质的浓度： 较适中的浓度0.2 %～ 2.0%
2) pH值对盐析的影响：pI
3) 温度的影响：离子强度 0℃～4℃
•pH值：pI附近
•离子强度：盐浓度<5%，V<2倍
蛋白质沉淀法
• 仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用 • 碱性蛋白质、凝集素、种金属
有机聚合物沉淀法
聚乙二醇
[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)] (Polyethylene Glycol , PEG )
➢亲水性强，溶于水和许多有机溶剂 ➢对热稳定 ➢有广范围的分子量
用过滤方法
• 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中
查出。
盐析曲线的制作
• 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据
可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和 度。具体操作方法如下：
• 取待分离样品溶液(已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度)，
冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次 分别加入不同量的硫酸铵
• 与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮 。
• 进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂
浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下 式计算：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
有机溶剂沉淀的影响因素
•温度：
一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高
•样品浓度：蛋白质初浓度：
5mg/mL～20mg/mL
• 第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚开始出现沉淀时，记下
所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点
• 继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得
到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第 二个级分，如此连续可得到6～10个级分
• 按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱
和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH 缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力
DNP／RNP复合物的解聚
• 去污剂 • 有机溶剂 • 蛋白水解酶
(1)去污剂
• 十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40 …… • 乙酸钾溶液 • 离心除去沉淀物 • 上清液即为初步纯化的核酸制品
(2)有机溶剂
• 苯酚、氯仿 • 上层水相(含核酸)和下层有机相 • 界面：变性凝聚蛋白 • 收集水相
• 中性盐沉淀法（盐析法） • 有机溶剂沉淀法 • 蛋白质沉淀法 • 有机聚合物沉淀 • 选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀） • 结晶沉淀法
中性盐沉淀（盐析法）
• 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过
程称为“盐析”。
在蛋白质领域应用最广，其突出的优点： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
注意点 ：
①水相和有机相的位置 ②充分接触，速度适当 ③苯酚重新蒸馏 ④异戊醇混合液
• 快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
沉淀法
• 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
• 基本原理：溶解度的不同 • 不同溶解度的产生的原因：亲和力的差异
溶解度的大小与下列因素有关：
✓ 溶质和溶剂的化学性质及结构 ✓ 加入某些沉淀剂 ✓ 溶液的pH值、离子强度和极性
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法：
结晶沉淀法：
在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。 不等同于等电点沉淀法
透析
• 自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有近150年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术 之一
作用:
• 除盐 • 除少量有机溶剂 • 除去生物小分子杂质 • 浓缩样品
• 半透膜：纤维素 • 将半透膜制成袋状 • 袋内外两边的浓度
18.9
NaH2PO4
1.6
7.8
95.3
103
43.3
42.2
93.8
101
2) 分离效果好 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用 4) 价格便宜，废液不污染环境
•缺点：需要一定时间脱盐
盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法
• 最常用的是固体硫酸铵加入法 • 原则：缓慢均匀少量
• 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常
• 在生物大 分子制备 中 ，用的 较多的是 分子量为 400 ～
6000 的 PEG
本方法的优点：
①操作条件温和，不易引起生物大分子变性
②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当 多的生物大分子
③沉淀后有机聚合物容易去除
选择性变性沉淀法
原理：利用理化性质等方面的差异 ⑴ 热变性 ⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性 ⑶ 选择性酸碱变性
中性盐沉淀Baidu Nhomakorabea白质的基本原理
盐分级沉淀：多次盐析的应用
中性盐的选择： 常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它
与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
1) 溶解度大：
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4)2SO4 70.6
75.4
Na2SO4
4.9
第二章 生物大分子的纯化方法
概述 • 蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的
研究是探求生命奥秘的中心课题
• 达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题 。
常用的分离纯化方法和技术有：
• 沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性
沉淀等）
• 离心 • 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲
和层析