沙门氏菌检验

实验六食品中沙门氏菌的检验

一、概述：

1.沙门氏菌的形态特征：革兰氏阴性，两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，周身鞭毛，运动力强，具菌毛。

2.沙门氏菌需氧或兼性，10-42℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH 为6.8-7.8。

3.沙门氏菌食物中毒的食品主要为动物性食品，特别是畜肉类及其制品，污染肉类食物的几率很高。冷冻对沙门氏菌无杀灭作用，即使在-25℃低温仍可存活10个月左右。

意义：沙门氏菌是引起食物中毒的重要病原菌。在世界各国各类细菌性的食物中毒中，沙门氏菌常居前列。因此，沙门氏菌的检测是各国检验机构对多种进出口食品的必检项目之一。

二、操作步骤：

1．前增菌——第一步使食物样品在含有营养的非选择性培养基中增菌，使受损伤的沙门氏菌细胞恢复到稳定的生理状态。

2．选择性增菌——在含选择性抑制剂的促生长培养基中间，样品进一步增菌的一个步骤。此培养基允许沙门氏菌持续增殖，同时阻止大多数其他细菌的增殖。

3．选择性平板分离——这一步采用固体选择性培养基，抑制非沙门氏菌的生长，提供肉眼可见的疑似沙门氏菌纯菌落的识别。

4．生化鉴定——排除大多数非沙门氏菌，提供了沙门氏菌培养物菌属的生理生化鉴定结果。

5．血清学技术——对沙门氏菌属培养物进行血清学分型鉴定，确定菌型。

主要沙门氏菌有2000多个血清型，可先用多价血清鉴定，再用单因子血清鉴定，先有常见菌型的血清鉴定，再用不常见菌型的血清鉴定。

三、实验过程：

1.前增菌将样品鸡蛋壳用灭菌棉签查拭蛋壳后，将棉签上部剪掉，下部放入前增菌培养基BPW中，5个棉签放入150mL前增液中，将制备好的预增菌液于37℃培养8-18h。（样品液变浑浊即可）

2.选择性增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取4mL前增菌液转种于40mL TTB选择性增菌液内，于42 ℃±1 ℃培养18h-24h。如果菌株生长过慢（TTB 培养基需现配现用，每组制备40ml增菌液，需加入816uL的碘液后再加入前增液）。

3.选择性平板分离混匀培养物，用直径3mm的接种环，1满环（10ul）分别划线接种于亚硫酸铋（BS）琼脂和HEKTONE氏肠道菌（HE）琼脂，每个培养基需3个平板，1个接沙门氏菌，另外2个平板接种自己培养的增菌液。（每组6个平板，3个BS，3个HE，其中2个平板接种），37℃培养48h后观察。

4.可疑沙门氏菌的观察BS 琼脂培养基上菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变；HE琼脂培养基上菌落蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。（具体图片参考ppt）同时挑取2个可疑菌落接种于BS和HE培养基中，进行可疑菌落的纯化培养，以进行后续的生理生化鉴定试验。

5.沙门氏菌生理生化鉴定可疑沙门氏菌的生理生化鉴定利用环凯生物的生化鉴定盒进行。其鉴定试剂盒详细使用方法如下：

（1）开启西林瓶前，用75%酒精棉消毒西林瓶表面，在无菌条件下，按铝盖上的箭头方向打开铝盖，撕开铝盖，打开西林瓶胶塞（如图1左），所有的西林瓶在使用后均高压灭菌后方可弃去。

图1 西林瓶的开启方法和放置培养方法

（2）生化鉴定盒的详细使用方法，见表1。

表1 生化鉴定试剂盒的培养基种类、接种方法及结果判定标准

（3）鉴定结果的判断

A．三糖铁和赖氨酸脱羧酶实验

在三糖铁琼脂内斜面产酸，底层产酸，同时赖氨酸脱羧酶试验阴性的菌株可以排除，其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。

三糖铁琼脂培养基的原理：本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

结果观察：志贺氏菌都能分解葡萄糖，产酸不产气，大多不发酵乳糖，不产生H2S。沙门氏菌，能分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S ，多数产气。大肠杆菌，能分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖，不产生H2S 。

具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺）和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显示出来。

•结果判读：阳性为试验管为绿色-蓝绿色，对照管变黄色；阴性为试验管和对照管均变黄色，或均不变色。

B．蛋白胨水(供靛基质试验)、尿素、氰化钾、甘露醇或山梨醇、ONPG实验

在接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供靛基质试验)、尿素、氰化钾培养基，于36±1℃培养18～24小时，必要时可延长至48小时。

靛基质试验：

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

结果判读：阳性为滴加靛基质试剂后液面立即变玫红色；阴性为滴加试剂后不变红色。

尿素酶试验：

具有尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养呈碱性，酚红指示剂在pH6.8时呈黄色，pH8.1呈粉红色。

•结果判读：阳性为玫红色；阴性为淡橙红色-淡黄色。

氰化钾利用试验：

氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂，可与呼吸酶作用使酶失去活性，抑制细菌的生长，但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长，以此鉴别细菌。

•结果判读：阳性为试验管和对照管都有生长变浑浊；阴性为试验管澄清不见生长，对照管生长浑浊。

甘露醇或山梨醇实验：

•绝大多数细菌都能利用糖（醇）类作为碳源和能源，但是它们在分解糖（醇）的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖（醇）并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。酸的产生可利用指示剂来断定。（指示剂为溴甲酚紫）

•结果判读：阳性为变黄色；阴性为紫色。

β-半乳糖苷酶试验（ONPG）实验：

有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下也可检出。

•结果判读：阳性为变黄色；阴性不变色。