生物技术综合实验报告(原生质体相关)
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养
综合实验一：植物原生质体的分离、融合与培养植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义,在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。
它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。
植物原生质体培养方法起源于植物单细胞的培养方法。
1954年，植物单细胞培养才获得成功。
Mllir培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上得到了它们的单细胞克隆，并建立了看护培养的方法；I960年Jones等建立了微室培养法。
同年，Cocking 应用酶法分离原生质获得成功，从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。
随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现，原生质体的培养方法也得到了不断地改进，现在常用的原生质体培养方法有：液体浅层培养法、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等。
实验目的了解植物原生质体分离、融合和培养的基本原理及其过程实验原理植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞。
是开展基础研究的理想材料。
其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。
许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。
高Ca高pH法和电融合法：PEG作为一种高分子化合物，20〜50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗.使原生质体融合得以完成。
PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醛键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当PEG分子足够长时，可昨为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。
生物实习报告
生物实习报告实习时间，2021年7月1日-2021年7月30日。
实习地点，XX大学生物实验室。
实习内容：在本次生物实习中，我主要参与了实验室的日常工作和研究项目。
实验室的研究方向主要集中在细胞生物学和分子生物学领域，我有幸参与了一些有关细胞培养、PCR技术和蛋白质分离等方面的实验工作。
在细胞培养方面，我学习了细胞的处理、培养和观察技术。
通过观察细胞在培养皿中的生长和形态变化，我对细胞的生长特点有了更深入的了解，并学会了如何进行细胞的传代和冻存。
在PCR技术方面，我参与了DNA提取、PCR扩增和凝胶电泳等实验。
通过这些实验，我学会了如何从细胞中提取DNA，并且掌握了PCR技术的操作流程和原理。
在蛋白质分离方面，我学习了蛋白质的提取、纯化和鉴定技术。
通过实验，我了解了不同的蛋白质分离方法，掌握了SDS-PAGE凝胶电泳技术，并学会了如何使用Western blot技术检测目标蛋白质。
实习收获：通过这一个月的实习，我不仅学到了大量的实验操作技能，还深入了解了细胞生物学和分子生物学的理论知识。
在实验室的指导下，我学会了如何认真细致地进行实验操作，如何分析实验结果，以及如何与同事合作共同完成研究项目。
此外，实习还让我对生物科学研究有了更深入的了解，也增强了我对科学研究的兴趣。
在实习期间，我还参与了实验室的讨论和学术报告，与老师和同学们进行了深入的交流和讨论，这让我受益匪浅。
总结：这次生物实习是我大学生涯中非常宝贵的经历。
通过实习，我不仅学到了专业知识和实验技能，还培养了团队合作意识和科学研究的思维方式。
我将会把这次实习所学到的知识和经验，运用到今后的学习和科研中，为将来的发展打下坚实的基础。
感谢实验室的老师和同学们在我实习期间的悉心指导和帮助，让我收获颇丰。
植物原生质体的分离与纯化
实验材料：
菠菜、油菜等。
实验用品：
用具：尼龙过滤网（ 400 目）、双层漏斗、吸 管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻 片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、 8%甘露醇盐溶液、 20%蔗糖盐溶液等。
实验步骤：
1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干 净。
2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细 胞暴露，注意不要损伤细胞。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶 液中，充分接触酶液。 25~30℃酶解 1~1.5 小时，期 间可晃动培养皿1~2次。
再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次
5 镜检：将原生质体悬浮液滴在载玻片上，轻 轻盖上盖玻片，先在低倍镜下找到原生质体，再换 成高倍镜仔细观察。
实验报告：
1 画出在显微镜下看到的原生质体的图像； 2 在整个实验操作过程中需要注意哪些问题？
结果与讨论：
1 预期结果：完整的原生质体形态上是圆球状 的，颜色鲜艳，富含细胞质。
实验9 植物原生质体的分离与 纯化
实验目的：
1 学习植物原生质体的分离和纯化技术；
2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。
实验原理：
植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。 分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原 生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。 其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于 具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、 半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的， 通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生 质体。
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
过 滤 前 的 酶 解 液
2 讨论： ① 选择合适的材料是实验成功的首要因素， 请问该实验选材时注意什么问题？ ② 酶Байду номын сангаас时酶液的组成及浓度如何确定？ ③ 研究原生质体的意义是什么？
原生质体融合的研究
(4)将原生质体融合与染色体显微操作、
染色体基因定位、细胞拆合与重组等分 子细胞遗传学方法结合起来；可以将控 制某些优良性状的基因利用染色体作图 先行在染色体上定位、标记，然后制作 含有标记染色体的微质体或亚原生质体， 诱导融合，从而定向改造某些性状，创 造出性状优良的材料
参考文献
单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb) 即单个B淋巴细胞克隆所分泌的抗体。 抗体主要由机体的B淋巴细胞合成，每个 B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。 当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许 多决
定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。 被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子 孙，即克隆。如果选出一个合成一种抗体 的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分 裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆 细胞所合成的抗体即为单克隆抗体。
原生质体融合研究的原因 利用原生质体融合可以进行异核体杂种 的培育。作物的优良性状往往受多基因 控制，基因工程很难实现多基因转移， 而原生质体融合为一次性多基因性状的 改良提供了途径。一些作物利用有性杂 交进行远缘杂交不易获得成功，体细胞 杂交解决了这一问题，它不仅可在相同 的物种之间进行杂交，而且可进行不同 物种间的杂交，甚至在动、植物之间进 行杂交，目前马铃薯抗卷叶病及抗晚疫 病等特性已通过体系胞杂交由野生种转 移到载培种中。
原生质体研究的进展
l 1880年，Hanstein首次起用原生质体 (protoplast)一词。 l 1960年，Cocking首次应用酶法制备番 茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe etl al.首次得到烟草叶肉 原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作 物－水稻原生质体培养再生植株。l
生物技术野外实习报告
生物技术野外实习报告一、实习背景随着科技的不断发展，生物技术在农业、医学、环境保护等领域发挥着重要作用。
为了进一步深入了解生物技术在实际应用中的情况，我参加了一次生物技术野外实习活动。
二、实习目的1.了解生物技术在农业领域的应用情况。
2.学习生物技术实验技能。
3.加深对生物技术的理论知识的理解。
三、实习过程在野外实习中，我首先参观了一个农业科技园区。
园区内有多个大棚，分别种植着各种蔬菜。
导游向我们介绍了这里采用的生物技术方法，包括基因改良、组织培养、基因测定等。
特别是在蔬菜的栽培中，应用基因改良技术可以提高产量、改善品质，减少病虫害的发生率。
随后，我们参观了一家生物技术公司的实验室。
在实验室中，我得到了一次亲身实践的机会。
导师向我们介绍了基因克隆的流程，并让我们进行实际的操作。
我们提取了DNA样本，并用PCR技术扩增目标基因。
接着，我们将扩增产物进行凝胶电泳分析，确认了基因的存在。
此外，我们还参观了一家生物技术企业的生产车间。
在车间内，工作人员正在进行生物制剂的生产。
他们利用发酵技术大规模生产农药、医药等产品。
在这里，我进一步了解到了生物技术在工业上的应用情况，并且看到了一系列严格的质量控制手段。
四、实习收获五、实习感想这次生物技术野外实习让我深刻认识到生物技术的广泛应用和无限潜力。
同时也发现，在生物技术领域的实践中，我们需要保持谦虚和冷静，因为生物技术的发展是一个缓慢而复杂的过程。
在接下来的学习和研究中，我将继续努力学习生物技术的理论知识，并在实践中不断提高自己的实验能力，为生物技术的发展做出自己的贡献。
生物实习报告
生物实习报告
实习日期，2022年6月1日-2022年6月30日。
实习地点，XX大学生物实验室。
实习内容：
在本次生物实习中，我主要参与了XX教授的研究团队，进行了
一系列与植物生长和发育相关的实验。
实习内容包括植物种子萌发
实验、植物生长素处理实验以及植物组织切片观察等。
在植物种子萌发实验中，我学习了如何准备不同浓度的培养基、如何处理种子以及如何观察和记录种子的萌发情况。
通过这个实验，我深刻理解了植物营养物质对种子萌发和生长的重要性。
在植物生长素处理实验中，我学习了如何处理植物组织，如何
测定生长素的浓度以及如何观察植物的生长情况。
这个实验让我对
植物生长素的作用机制有了更深入的了解。
最后，在植物组织切片观察实验中，我学习了如何制备植物组
织切片、如何染色以及如何使用显微镜观察和拍摄组织结构。
通过这个实验，我对植物细胞和组织的结构有了更清晰的认识。
实习收获：
通过本次生物实习，我不仅学到了丰富的实验操作技能，还深入了解了植物生长和发育的相关知识。
在实习期间，我还与实验室的老师和同学们进行了深入的交流和讨论，从他们身上学到了很多宝贵的经验和知识。
未来展望：
在未来的学习和科研中，我将继续深入研究植物生长和发育的相关问题，努力提升自己的实验技能和科研能力，为推动植物科学研究做出自己的贡献。
同时，我也将继续与老师和同学们保持良好的交流和合作，共同进步，共同成长。
植物原生质体的分离实验
植物原生质体的分离实验实验一植物原生质体的分离与培养一．教学目标：熟悉植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，熟悉原生质体活性鉴定的原理。
掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理与方法。
二．重点：掌握分离与培养原生质体的技术、方法与原理。
掌握细胞活性的检测方法。
掌握细胞计数的原理与方法。
三．难点：分离与培养原生质体的技术。
四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或者具体指导。
五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。
其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁要紧由纤维素、半纤维素与果胶质构成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶与果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。
由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,务必保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或者蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳固原生质膜。
其次,还应当考虑取材、酶的种类与纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。
将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂与再生植株。
测定原生质体的活性有多种方法。
荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。
一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。
它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。
细胞计数通常用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。
从理论上讲，植物体的任何一部分都能够通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。
但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。
因此，为了制备健康的原生质体，通常选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或者次生加厚的外壁，则不能被酶降解。
高中学生生物实验报告
高中生物实验报告实验目的本实验旨在通过对一些标本的观察，让同学们了解生物的基本概念和组成成分，进一步深入了解生物界的分类和特征，并培养同学们的观察能力和实验操作能力。
实验原理本实验主要通过对昆虫、植物、动物等标本的观察，了解生物的体形、生理、生态方面的知识，并加深对生物分类和特征的理解。
同时，通过实验中的观察和操作，提高实验技能和对实验过程的把握能力。
实验设备和试剂•显微镜•刀具•草图纸、笔•溶液：理化盐水、表面张力试剂、甲醇、十字花科植物叶片液实验过程第一步：观察昆虫标本1.取出昆虫标本观察其体形、颜色和器官的分布情况。
2.用显微镜观察昆虫标本的部分结构，如观察昆虫的嘴部、触角、眼睛等器官的结构特征，并用笔和草图纸记录下来。
第二步：观察植物标本1.取出植物标本观察其根、茎和叶的结构，包括细胞结构、组织结构和器官结构。
2.用十字花科植物叶片液滴到玻璃片上，并用显微镜观察叶子表皮、气孔和叶片薄壁细胞结构。
第三步：观察动物标本1.取出动物标本观察其体形和颜色，观察其内部骨架和肌肉的分布情况。
2.用理化盐水作用于昆虫标本上，观察原生质体、细胞核的颗粒运动及大小，并记录下来。
第四步：表面张力的实验1.在玻璃杯中注入一些水，滴入几滴表面张力试剂。
2.在表面张力试剂上方插入一根细玻璃管，在细玻璃管上面放置一些小塑料片。
3.观察小塑料片受到的力的影响，并记录下来。
结果在本实验中，同学们通过观察昆虫、植物、动物标本以及表面张力实验，加深了对生物分类、特征和生命活动的认识。
同时，也提高了同学们的观察能力和实验操作能力。
实验总结通过本次实验，我们深刻认识到生命的美妙和神奇。
只有多角度和多方面去观察和研究生物，才能更好地认识生命，认识自己，并更好地利用生命资源和保护生态环境。
实验感想在实验中，我们收获了很多的知识，也经历了很多的挑战和困难。
在接下来的学习中，我们应该继续保持学习的态度，认真思考，不断探索，使我们的知识更加全面。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生物技术综合实验报告（第一部分）实验一工作液的配制、培养基配制、器皿洗涤及灭菌一、实验目的掌握各种工作液配制方法；了解植物培养基的构成及配制方法；掌握高温高压灭菌的方法。
二、原理培养基是植物组织培养的基本条件，同时也是关键因素。
湿热条件(121℃的蒸汽，10分钟)能够有效地杀灭附着在玻璃器皿、器具以及溶液和培养基中的微生物达到灭菌的目的。
三、器具和试剂灭菌锅，天平，电炉，微波炉，三角瓶，封口膜，移液管，移液器，量筒，烧杯，pH试纸，培养皿，滤纸，Parafilm封口膜。
琼脂，MS培养基大量元素，无菌水，葡萄糖，2, 4-D，IBA，KT （激动素），1M NaOH及HCl，卡那霉素，头孢霉素，乙酰丁香酮。
四、实验内容PH调节剂的配制、培养基母液的配制、培养基的配制、各种相关物品的准备（一）培养基的配制步骤1、取个干净烧杯，加入1/3-2/3左右的蒸馏水，用移液管取所需的母液加入烧杯。
2、称取定量的蔗糖加入烧杯中并不断搅拌，直到完全溶解，定容。
3、用NaOH或者稀HCL调剂酸碱值。
4、称取定量琼脂糖加入烧杯中，加热煮沸搅拌，待琼脂完全溶解，分装。
5、高压灭菌（121℃,15min-20min)。
6、冷却，取出，备用。
（二）棉花无菌苗培养基的制备1、取25 ml MS大量元素母液，称取葡萄糖15g、于1升的烧杯中，定容后调pH值为6.0，加入7.5g/l 琼脂煮沸。
2、然后将其分装到100毫升的三角瓶中，每瓶40毫升。
3、用封口膜封口后在灭菌锅中灭菌15分钟。
4、灭菌后臵于水平的工作台上冷却即可。
要求：配制1L（三）拟南芥无菌苗培养基的制备1、拟南芥无菌苗培养基：1/2 MS大量元素+蔗糖10g/L，PH值6.0；加入7.5g琼脂高温高压灭菌。
2、0.1%琼脂糖：0.1g琼脂糖/100ml 蒸馏水；无菌苗培养基和0.1%琼脂糖均121°高压灭菌15分钟。
3、另准备20套9cm培养皿，灭菌。
要求：配制0.5L，装1瓶灭菌，灭菌后培养基倒皿。
五、注意事项1、为了尽量减少人为的误差，必须严格按实验步骤进行操作，严格按照要求的量来配制工作液、母液及培养基。
2、应当把培养基中的各种成分都写在纸上，加进去一个以后即划掉一个。
3、所有装着培养基的试管、玻璃罐、玻璃瓶和培养皿等都应当清楚地做上标记。
4、每小组的操作的具体事项请参照黑板上贴的任务分组。
5、爱护实验仪器及耗材，小心使用玻璃器皿，合理灭菌，因为灭菌耗时较长。
实验二无菌苗的制备一、原理化学灭菌：0.1%升汞(Hgcl2)溶液浸泡10分钟可以对棉花种子等外植体进行灭菌，84消毒液（2%的次氯酸钠）浸泡3分钟可以对拟南芥等小种子外植体进行消毒。
物理消毒：紫外灯消毒、酒精灯火焰或高温烧灼5min左右可有效杀死镊子、剪刀等不锈钢操作器具的菌类达到消毒的目的。
二、实验材料、器具和试剂棉花品种YZ1;拟南芥col-0野生型灭菌锅，天平，电炉，三角瓶，封口膜，镊子，酒精灯，剪刀，移液管，超净工作台。
0.1%升汞溶液，84消毒液，75%酒精三、实验内容（一）拟南芥无菌苗培养基倒皿1. 取上次灭菌好的拟南芥培养基（500ml装），稍微拧松瓶盖，微波炉煮沸，边煮边摇动，至全部融化。
2. 将上次灭菌好的9cm培养皿分开放臵超净工作台（超净工作台需先打开）上。
3. 将融化好的培养基分装于培养皿中（500ml/18-20皿），将皿至于超净台上吹干.。
（二）共培养培养基的配制成分数量成分数量MS大量元素(20倍）50 ml 2,4-D (0.1mg/ ml) 1 mlNH4NO3 (20倍) 50 ml 甘氨酸(1000倍) 1 ml微量元素(100倍) 10 ml KT (0.1mg/ml) 1 ml铁盐(100倍) 10 ml 葡萄糖30g/L微生素(1000倍) 1 ml PH值 5.85-5.90肌醇(100倍) 1 ml依次加入上述物质，调PH值5.85-5.90，然后分装至2个500ml蓝盖瓶，每瓶加入4g琼脂，灭菌，灭菌后倒皿。
（三）选择培养基的配制共培养培养基+卡那霉素50mg/L + 头孢霉素400 mg/L灭菌后，待培养基凉至60度左右加入，混匀，倒皿。
（四）棉花无菌苗的制备1、将棉籽用手术剪刀去壳（每人3颗，饱满无病虫害种子）。
2、用0.1%的升汞灭菌13分钟。
3、无菌水冲洗三遍，接种于无菌苗培养基中。
4、28℃条件下暗培养7天（304培养箱）。
（五）拟南芥无菌苗的制备大量法灭菌：将拟南芥种子放入1.5ml离心管中，加入84消毒液：无菌水=1:1的混合液1ml，上下摇晃灭菌2min，弃消毒液；加入1ml 75%的酒精混匀1min，然后无菌水清洗4次；加入0.1%琼脂糖溶液悬浮种子，用移液枪涂布于拟南芥无菌苗培养基，吹干，封口。
弱光培养两天至种子萌发，转至光照培养室培养两周（304培养箱）。
五、注意事项所有操作（除数种子）均在超净工作台上进行。
六、实验结果一周后观察无菌苗的生长状况1、六瓶接种的棉花无菌苗中有一瓶被轻度污染，其余五瓶生长状况良好。
2、拟南芥的无菌苗因涂布不均匀长势一般，幼苗较其他小组要弱小，叶片颜色较深。
实验三愈伤组织的诱导及农杆菌介导的棉花遗传转化一、实验目的掌握植物体细胞胚胎发生的基本理论；了解植物愈伤组织在诱导和分化过程中的形态学、细胞学特征；进一步巩固植物离体培养和无菌操作的步骤；掌握植物遗传转化的方法、理论；掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。
二、实验原理植物细胞全能性：植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。
愈伤组织：胚性愈伤：呈淡黄色或者黄绿色，质地较均匀；细胞球状或近球状，细胞核大，细胞质浓非胚性愈伤：呈褐色、白色粉末状或白色、绿色坚硬块状；细胞一般为长柱状等非规则形状，细胞核小，细胞质较稀。
农杆菌介导转基因的原理：植物细胞在受伤后，创伤分子诱导农杆菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切，加工，形成T-链蛋白复合体（T-复合体），通过农杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基因组。
三、材料与用品1、实验材料：棉花材料YZ1（上周做的无菌苗）、农杆菌菌株LBA4404。
2、用具：超净工作台，显微镜，载玻片，天平，三角瓶，封口膜，橡皮筋，镊子，酒精灯，培养皿，滤纸，剪刀，医用手术刀，摇床。
3、药品：诱导、共培养培养基，卡宝品红染色液，MGL活化培养基，LB培养基，乙酰丁香酮（AS）。
四、实验步骤（一）棉花愈伤组织的诱导及观察1、愈伤诱导培养基的配制（第1周已做）2、无菌苗的制备3、无菌苗的切取：选取培养7天左右健壮的无菌苗臵于垫有滤纸的培养皿上，用解剖刀切掉子叶及生长点，切掉胚根及相连的约1/4的下胚轴，余下的下胚轴用作愈伤组织诱导的外植体，用解剖刀将下胚轴切成～0.7cm小段。
4、外植体接种及离体培养：将切离好的外植体接种于愈伤诱导培养基上（每瓶约7段），平行放臵，28℃光照培养，每天14小时光照，进行愈伤组织诱导及增殖培养。
5、愈伤组织继代（一个月后）：待培养一个月左右，将增殖后的愈伤组织连同下胚轴切断继代到分化培养基上，进行胚性愈伤组织的分化。
6、愈伤组织形态观察：分别挑取少量非胚性愈伤和胚性愈伤组织，臵于载玻片上，滴几滴清水用镊子捣碎愈伤组织，然后滴加一滴卡宝品红染色数秒钟后，在显微镜下观察比较两者细胞学特征。
（二）农杆菌介导的棉花下胚轴的遗传转化1、共培养及选择培培养基的配制（第2周已做，没倒皿的组倒皿）2、无菌苗的制备（第2周已做）3、农杆菌的活化（研究生帮忙做）：从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化；按1:100的体积加入20ml LB液体培养基里摇菌，28℃暗培养36-48hr；将浑浊的农杆菌液涂布于LB平皿上，28℃暗培养36-48hr；把培养基表面菌落刮入装有20ml MGL培养基的三角瓶中（按1/1000比例加入AS），28℃、200rpm摇30min；OD值在0.5-1.5之间（估计）即可用于侵染。
4、下胚轴与农杆菌共培养：把无菌苗切成~7mm茎段（同诱导程序），用镊子夹到经活化的菌液中进行侵染，摇匀，侵染10分钟；倒掉菌液，将下胚轴转入装有滤纸的灭菌培养皿中，吹5分钟使表面稍为干燥；再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃, 暗培养48-60小时结束共培养。
5、选择培养（48-60小时后）：把经过共培养的下胚轴用镊子转入选择培养基中，培养30天左右继代一次转入相同的选择培养基中。
五、注意事项1、在切无菌苗时，一定要使用锋利的刀片,尽量做到一刀能切断，避免挤压茎段。
2、无菌苗培养时间不宜过长（培养七天最好）。
3、从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的时间，用完后尽快放回冰箱。
4、侵染时下胚轴稍为干燥可以增加农杆菌的吸附。
5、共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持干燥，可以减少农杆菌的污染。
6、整个过程均为无菌操作环境。
六、实验结果：1．锥形瓶与平皿中的下胚轴生长状况均良好，观察到平皿中农杆菌介导转化的下胚轴有发黑的现象，而锥形瓶中诱导的愈伤组织则无发黑现象。
2．两个平皿中的拟南芥均生长缓慢且幼叶发黄，推测原因可能与杂菌感染有关。
实验四植物原生质体的分离、纯化一、实验目的了解植物原生质体分离和纯化的原理；掌握植物原生质体分离和纯化的方法；掌握原生质体活力测定和原生质体计数的方法。
二、实验原理植物原生质体是指细胞中去掉了细胞壁后的部分。
植物细胞在纤维素酶，半纤维素酶和果胶酶的作用下，细胞壁被消化。
纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素，果胶酶是用来降解连接细胞的中胶层，使细胞丛组织中解离出来，可以得到裸露的原生质体。
原生质体在合适的培养条件下，能再生细胞壁，进行分裂、生长、形成愈伤组织，进一步分化成根和芽，长成新的植株，表现了植物细胞的全能性。
三、材料与用品1、材料：棉花胚性愈伤组织，拟南芥叶片。
2、器材和用具：低速离心机，血球计数板，不锈钢筛（140和400目），普通显微镜，玻璃试管及吸头。
3、试剂：CPW9和CPW25溶液（高温高压灭菌），台盼蓝。
四、实验步骤1、材料的准备拟南芥无菌苗的制备（第2周已种）。
2、原生质体酶解分离（1）愈伤组织原生质体的分离：1g颗粒状、新鲜的愈伤组织于6cm培养皿中，加入6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，臵于摇床,40转酶解14小时。
（2）叶肉原生质体的分离：取约2g拟南芥幼嫩叶片于6cm培养皿中，用解剖刀将叶片切碎，加入6 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，28℃黑暗条件下酶解4小时。
3、原生质体的纯化（1）酶解后的原生质体-酶混合物经双层不锈钢网（140和400目）去掉残渣加入CPW9M 洗涤，滤液在10ml 的玻璃离心管中离心4～5分钟（800rpm），使原生质体沉于管底，细胞壁等碎片浮在液面。