生物技术大实验完整版
生物技术实验报告
生物技术实验报告生物技术实验报告引言生物技术是一门涉及生物学和工程学的交叉学科，通过利用生物体的特性和生物分子的相互作用，来解决现实世界中的问题。
本实验旨在探索生物技术在实验室中的应用，以期增进对生物技术的理解和认识。
实验目的本实验的目的是通过使用PCR技术，对特定基因片段进行扩增，并通过凝胶电泳分析扩增产物。
通过这个实验，我们将学习PCR技术的原理和操作步骤，并了解如何使用凝胶电泳进行DNA分析。
实验材料和方法材料：- DNA样本- PCR试剂盒- 扩增引物- DNA电泳仪- 琼脂糖凝胶- DNA标记物方法：1. 准备PCR反应体系：将PCR试剂盒中的反应液与DNA样本、扩增引物混合。
2. 进行PCR扩增：将混合好的反应液放入PCR仪中，按照设定的温度和时间进行扩增。
3. 准备琼脂糖凝胶：将琼脂糖溶解在缓冲液中，倒入电泳仪中，等待凝固。
4. 准备样品：将PCR扩增产物与DNA标记物混合。
5. 进行电泳：将混合好的样品倒入琼脂糖凝胶槽中，进行电泳分析。
6. 分析结果：观察凝胶上的DNA条带，判断扩增是否成功。
实验结果与讨论在进行PCR扩增和凝胶电泳后，我们观察到在琼脂糖凝胶上出现了一些DNA 条带。
这些条带代表了PCR扩增产物的大小和数量。
通过比较这些条带与DNA 标记物的迁移距离，我们可以确定PCR扩增产物的大小。
在实验中，我们使用了PCR技术对特定基因片段进行扩增。
PCR技术通过利用DNA聚合酶酶的特性，在不断变化的温度条件下，使DNA链的两端进行反复扩增。
这种扩增过程可以快速产生大量目标DNA片段，从而使我们能够对其进行进一步分析。
凝胶电泳是一种常用的DNA分析方法，通过利用DNA的负电荷特性，在电场的作用下，使DNA片段在琼脂糖凝胶中迁移。
由于DNA片段的大小不同，迁移速度也不同，因此在凝胶上形成了不同大小的DNA条带。
通过与DNA标记物的比较，我们可以确定PCR扩增产物的大小。
在本实验中，我们成功地扩增了目标基因片段，并通过凝胶电泳分析得到了相应的结果。
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告生物技术综合实验甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达学生：学号：同实验者：谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 保护细胞膜的完整性等。
γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 可以调控GSH 的生物合成量。
GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆过程密切相关。
实验一甘薯叶片RNA提取一、实验目的1. 了解真核生物RNA提取的原理；2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
二、实验原理Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。
TRIzol的主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
%的8－羟基喹啉可以抑制RNase，与氯仿联合使用可增强抑制作用。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。
在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。
用这种方法得到的总 RNA中蛋白质和DNA污染很少。
三、实验材料1. 材料甘薯叶片，品种为徐薯182. 试剂①无RNA酶灭菌水：加入%的DEPC，处理过夜后高压灭菌；② Trizol试剂；③氯仿；④异丙醇、75％乙醇；⑤ TBE缓冲液；⑥上样缓冲液3. 仪器高压灭菌锅、微量移液器、台式离心机、超净工作台、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、塑料离心管、枪头和EP 管架四、实验方法1. 将叶片取出放入研钵中，加入适量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物叶片加入1 mL Trizol试剂，室温放置5 min，使样品充分裂解；2. 每1 mL Trizol试剂加入200 μL氯仿，用手剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相；3. 4℃ 12,000 rpm 离心15 min，吸取上层水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置15 min；4. 4℃ 12,000 rpm 离心10 min，弃上清，RNA沉淀于管底；5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm离心2 min，弃上清；6. 室温放置10 min晾干沉淀；7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；8. 用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用EB染色并照相。
完整生物实验报告
实验名称：植物细胞质壁分离与复原实验一、实验目的1. 观察植物细胞质壁分离与复原的现象；2. 掌握植物细胞渗透作用的原理和方法；3. 了解植物细胞壁的特性。
二、实验原理植物细胞质壁分离是指细胞壁与原生质层在渗透压差异的作用下发生分离的现象。
当外界溶液浓度低于细胞液浓度时，细胞吸水膨胀，原生质层与细胞壁分离；当外界溶液浓度高于细胞液浓度时，细胞失水收缩，原生质层与细胞壁恢复接触。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱鳞片叶、蔗糖溶液、清水、滴管、载玻片、显微镜、显微镜载物台、盖玻片等。
2. 实验仪器：烧杯、天平、量筒、酒精灯、酒精、剪刀、镊子等。
四、实验步骤1. 将洋葱鳞片叶洗净，用剪刀剪成约0.5cm×0.5cm的小块，放入烧杯中；2. 在烧杯中加入适量的蔗糖溶液，使洋葱块浸没在溶液中；3. 将烧杯放在酒精灯上加热，使蔗糖溶液沸腾，持续沸腾约5分钟；4. 将沸腾后的蔗糖溶液冷却至室温；5. 取载玻片，滴一小滴清水于载玻片中央；6. 用镊子取一小块洋葱鳞片叶，将其放在载玻片上的清水滴中，用盖玻片覆盖；7. 将载玻片放在显微镜载物台上，观察洋葱细胞的质壁分离现象；8. 将烧杯中的蔗糖溶液换成清水，重复步骤5-7，观察洋葱细胞的质壁复原现象。
五、实验结果与分析1. 实验结果：a. 在蔗糖溶液中，洋葱细胞的原生质层与细胞壁发生分离；b. 在清水中，洋葱细胞的原生质层与细胞壁恢复接触。
2. 实验分析：a. 当外界溶液浓度低于细胞液浓度时，洋葱细胞吸水膨胀，原生质层与细胞壁分离；b. 当外界溶液浓度高于细胞液浓度时，洋葱细胞失水收缩，原生质层与细胞壁恢复接触。
六、实验结论通过本次实验，我们观察到了植物细胞质壁分离与复原的现象，验证了植物细胞渗透作用的原理。
同时，我们了解到植物细胞壁具有一定的弹性和伸缩性，可以适应细胞内外环境的变化。
七、实验讨论1. 影响植物细胞质壁分离与复原的因素有哪些？a. 外界溶液浓度；b. 细胞液浓度；c. 温度；d. 细胞壁特性等。
生物技术综合大实验-GFP纯化
生物技术综合大实验实验报告GFP的分离与纯化姓名：专业班级院系：指导教师：完成日期GFP的分离与纯化摘要： GFP，在生物领域应用广泛。
本实验回顾了GFP提取纯化过程，包括细菌破碎、GFP沉淀、疏水过滤层析、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析等步骤，来获得较纯的GFP，并运用SDS-PAGE来检测纯化效果。
关键词：GFP 应用进展层析 SDS-PAGE绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一类存在于这些腔肠动物体内的生物发光蛋白。
1962年Shimomura等首先从多管水母(Aequorin victoria)中分离出一种分子量为20kDa的称为Aequorin的蛋白。
由于水母整体荧光及提取的蛋白质颗粒荧光都呈绿色，因此，人们将这种蛋白命名为绿色荧光蛋白。
1992年Prasher 等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构；1994年Chalfie 等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达了GFP，开创了GFP应用研究的先河，之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮；1997年10月18~22日在美国New—Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。
1994年钱永健改造了GFP，使得GFP的荧光变强、变色。
由此和Shimomura、Martin Chalfie共享了2008年诺贝尔化学。
从此，荧光蛋白带来了生物技术的新革命。
GFP本身是一种酸性，球状，可溶性天然荧光蛋白，分子量约27×103，一级结构为一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽。
在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰为473 nm；发射光谱λmax=508~509nm。
GFP性质极其稳定，易耐受高温处理，甲醛固定和石蜡包埋不影响其荧光性质。
其变性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的条件下用6mol/L盐酸胍处理，一旦恢复中性环境，或去除变性剂，虽然变性的蛋白质并不能完全复性，但是复性蛋白质同天然蛋白质对温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。
生物技术大实验课件
实验步骤
1.
2. 3. 4. 5.
1.5%琼脂糖凝胶
电泳(100 V,30min)分离DNA片段
在紫外光下切下目的片段
胶回收纯化 测定回收后DNA的浓度。
实验四. PCR扩增 （聚合酶链式扩增反应）
实验原理
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。 单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚 合酶按5’→3’方向复制出互补DNA。双链DNA分子经高温变
性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应
Primer
Premer 5：用于寻找最佳的引物，
会提供各种引物参数
Clustal X
以克隆黑鲷的NPY基因为例：
在National Center for Biotechnology
Information NCBI基因库 中搜索相近物种的NPY
cDNA序列
用Clustal X 软件对所搜索到的cDNA进行序列比对 找出高度同源区 在该区设计特异或简并引物
实验六、连接反应
实验七、细菌转化 实验八、蓝白斑筛选 实验九、PCR检测阳性克隆 实验十、测序及序列分析
实验安排
第14周：指导学生熟悉cDNA克隆的整个过程 5月23日 理论讲解；实验室安全教育；溶液和培养基 的配制；刀具灭菌； 5月24日 总RNA提取及电泳检测 5月25日 cDNA合成和PCR扩增 5月26日 产物回收纯化、连接反应、细菌转化 5月27日 蓝白斑筛选和阳性克隆检测，送测序 第15-16周：开放实验室，每小组选择目的基因，自行 设计引物（需在第13周完成），然后完成所选目的基 因的cDNA克隆。
生物技术大实验
生物技术大实验陆挺王大慧汪成富苏州大学生命科学学院二零零七年六月前言脂类被广泛地定义为能溶于有机溶剂的一类生物分子【1】。
甘油脂类是指主链中含有甘油的脂类。
主要的甘油脂类包括三酰基甘油和各种磷脂。
由脂肪酸和甘油组成的三酰基甘油可在动物的脂肪组织，植物种子或果实中大量储藏。
脂肪酸是三酰基甘油的主要成分，其作为能量被储存在三酰基甘油中。
虽然在肝脏和肠内也发现三酰基甘油，但是发现它们主要存在脂肪组织中。
磷酸甘油酯(简称磷脂)，是另一种含有磷酸基的甘油脂类。
这类脂类的共同特点是它们都是具有亲水性和疏水性的兼性分子，水解以后都产生磷酸和脂肪酸。
可见，脂肪酸也是磷脂的主要成分。
在真核和原核细胞的生物膜（包括细胞膜，细胞器膜）中，磷脂是主要的结构脂类。
磷脂双层可构成两相界面，是各种分子的通透性屏障。
磷脂组成的变化对细胞膜的流动性，膜蛋白的活性等细胞生理功能由重要的调节的作用。
【2】溶血磷脂是一类重要的磷脂。
其中，溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid ,LPA）是目前已知的结构最简单的甘油磷脂。
它的系统命名为1或2－脂酰－甘油－3－磷酸（1 or 2-acyl sn-glycerol-3-phosphate）。
溶血磷脂酸在体内的信号转导途径中起着重要的作用，被称为多功能“磷脂信使”。
通过活化特定的G蛋白受体，LPA调控着多种细胞反应，如有丝分裂的发生、细胞粘附、细胞骨架重排、离子转运、细胞分化、平滑肌收缩以及细胞调亡等等【3】。
LPA存在于多种生物体体液中，如血清、血浆、眼球的水状体等。
多种类型的细胞均可产生LPA，并通过自分泌或旁分泌的形式释放到细胞外影响靶细胞的功能。
机体可由如下途径释放LPA：1）血小板在凝血酶刺激激活后可迅速产生和释放LPA；2）哺乳类的成纤维细胞在肽类生长因子刺激下可迅速产生LPA并释放到细胞外间质；3）人的脂肪细胞可产生LPA，并刺激前脂肪细胞的增殖[4]；4）在卵巢癌患者的腹水及血浆中可检测到增高的LPA[5]，其来源尚不清楚，但有可能是肿瘤细胞产生的；5）某些炎症细胞、内皮细胞、神经细胞及受损的细胞也可产生LPA[6]多方面研究表明，LPA的产生同多种病生理状态密切相关。
生物技术大实验
离心机的使用
1 ．接通电源 2 ．平衡加入离心样品 3 ．设置时间 4 ．调节转速
2020/11/14
注意事项：
（1）离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 （2）离心管必须仔细平衡。 （3）机内若不清洁，离心管要封口。 （4）必须慢启动，然后加速。 （5）离心时不准开盖。 （6）不准用手刹车。
2020/11/14
生物化学技术大实验安排（2013年3月-6月） 第一部分 生物化学分离及检测技术
第一部分： 实验序号 实验一 实验二 实验三
现代生物学大型实验研究中必需的基本技能训练
内容： 各种基本实验研究技术；
实验名称
教师计划学时
学生学时 任课教师
综合实验室大型仪器设备见习
4
4
袁永泽
薄层层析法分离 AMP、ADP 和 ATP
2．烧伤
（1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。 （2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。
2020/11/14
722型分光光度计的使用
本仪器在可见光谱区范围内（360~800nm）进行定量比色分析用。
1．在仪器尚未接通电源时，电表的指针必须位于透光率“0”刻 线上，若不是这种情况，可以用电表上的校正螺丝进行调节 。
生化实验室
4 月 19，21 日
4 月 26，29 日
生化实验室
5 月 3 日，5 日
5 月 10 日，12 日
生化实验室
5 月 3 日，5 日
5 月 10 日，12 日
微生物实验室
5 月 17，19 日
5 月 24，26 日
生化实验室
5 月 17，19 日
完整版)初中生物创新实验
完整版)初中生物创新实验
金点子演讲：现场成果展示
我们的创新实验名称是“二氧化碳是光合作用的原料”。
我们的目的是通过控制变量和观察石蕊颜色的变化来证明这一点。
我们用到了大烧杯、金鱼藻、石蕊溶液、石灰石、稀盐酸、试管、带导管的双孔橡皮塞、铁架台、长颈漏斗和凉开水。
我们的实验装置图很简单：我们向B烧杯内通入适量的
二氧化碳，直到石蕊溶液变成红色为止。
实验操作步骤如下：首先，我们取一些金鱼藻，放在盛有等量凉开水（凉开水里面没有空气）的A、B大烧杯里。
然后，在两个烧杯中分别装入等量的石蕊溶液，两个烧杯内溶液为紫色。
接着，我们在试管内放入石灰石，从长颈漏斗通入盐酸，将制得的二氧化碳由导管通入B烧杯，直至B内的溶液变为
红色。
停止通气。
最后，我们将两个装置放在同样的光照下，观察溶液颜色的变化。
实验结果表明，一段时间后，A烧杯颜色没有变化；B烧杯溶液由红色变回紫色，说明水中的二氧化碳被植物的光合作用消耗了，从而证明了二氧化碳是光合作用的原料。
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生命的基本特征：①细胞是生物的基本组成单位（病毒除外）②新陈代谢、生长和运动是生命的基本功能③生命通过繁殖而延续，DNA是生物遗传的基本物质④生物对外界可产生应激反应和自我调节，对环境具有适应性生物学经历的三个阶段：描述生物学阶段、实验~、创造~生物技术：也称生物工程，是以现代化生命科学为基础，运用先进科学原理和工程技术手段按预先的设计来加工或改造生物材料，从而产生出人类需要的产品或达到某种目的生物技术发展三个阶段：作坊式生物技术、工业化~、现代~生物技术内容：基因工程技术、细胞~、酶~、发酵~、蛋白质~细胞工程：指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术蛋白质工程：是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的突变蛋白质。
蛋白质工程也成为“第二代基因工程”生物技术基本特征：①高效益②高智力③高投入④高竞争⑤高风险⑥高势能透光度t：某一波长的光透过某一物质的溶液时，其入射的角度I0与透过溶液后的强度I相比发生了变化：I与I0的比值（I /I 0)称为透光度实验室常用水的制备：①利息交换法②蒸馏法③反浸法④超纯法消毒灭菌方法：①高压高温灭菌②干热灭菌③滤膜灭菌④化学消毒法⑤紫外线灭菌⑥抗生素灭菌消毒核酸的一级结构：线性结构，核苷酸的排列顺序，也称碱基序列二级结构：双螺旋结构三级结构：超螺旋结构DNA的变形：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程增色效应：核酸变性后，在260nm处吸收值上升DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象减色效应：DNA复性时，OD260值下降影响复性速度的因素：①溶液温度的高低②单链片段的大小③单链片段浓度④溶液离子强度的大小⑤片段内重复序列的多少OD260的应用：OD260=1.0 相当于①50ug/ml 双链DNA ②40ug/ml 单链DNA或RNA③20 ug/ml 寡核苷酸基因（分子生物学概念）：基因是DNA双螺旋分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列管家基因：某些基因是维持细胞基本代谢所必须的基因，其在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达阅读框架：在DNA链上，由蛋白质合成的起始密码开始，到终止密码子为止的一个连续编码序列基因的结构：外显子、内含子、前导区、尾部区、调控区三个关键因素：①自由复制的DNA序列②着丝粒DNA序列③端粒DNA序列原核生物和真核生物染色体的区别：①原核生物的染色体实质上是一个裸露的DNA双螺旋结构，DNA通常呈环状，且与相对少量的蛋白质结合，长度可打达几厘米，DNA复制从单一复制起点开始②真核生物都有许多线状的染色体，且染色体存在于细胞核内，真核生物染色体由DNA、组蛋白、RNA、非组蛋白等成分组成。
这些蛋白具有功能或结构方面的作用。
染色体DNA的数量远比原核生物多。
每条染色体有多个复制起点分离纯化核酸的总原则：①保证核酸的一级结构完整性②防止核酸的生物降解③排除其他分子的污染真核细胞DNA制备实验基本原理：要从组织中提取DNA就必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎包膜及核膜，使染色体释放出来，同时还要除去与DNA结合的组蛋白及非组蛋白质粒按复制方式分：松弛型质粒、严密性质粒质粒特性：①分子相对小②含高效的自主复制成分③不相容性④转移性⑤选择的标记⑥限制性内切酶单一切口碱裂解法原理：在PH12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭合环质粒DNA人为自然状态。
将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS作用下形成沉淀，儿质粒DNA 仍为可溶状态。
通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。
质粒尚在上清中，在用酚氯法抽提进一步纯化质粒DNA电泳：是指带电粒子在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。
影响电泳迁移率的因素：1，样品：即颗粒所带净电荷的数量、大小及形状。
2，支持介质：惰性材料有一定坚韧度，吸附力小，无电渗作用。
吸附作用：是介质对样品颗粒的吸附作用，所以出现拖尾和条带不均匀，纸最大，醋酸纤维素介质最小，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶居中。
电渗：在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动为电渗。
其产生原因是固体支持物多孔，且带有可解离的化学基因，因此吸附溶液中的正离子和负离子，使溶液分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现不同的迁移率，这就是分子筛效应。
影响凝胶电泳的因素：1DNA分子的大小2琼脂糖的浓度3DNA分子的构象 4 电源电压5嵌入燃料的存在6离子强度的影响聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点：1、在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。
2、化学性能稳定，与初分离物不起化学反应在很多溶剂中不溶。
3、对PH和温度变化较稳定。
4、几乎无吸附和电渗作用。
5、样品不易扩散，用量少。
其灵敏度可达10-66、凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径。
7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中集浓缩，分筛和电荷效应为一体。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理：当向蛋白质溶液中加入足量SDS，可引起构象改变，蛋白质—SDS形成的复合物近似“雪茄烟“形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而取决于分子量大小，所以它们以相等的迁移率速度从浓缩胶进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而别分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤：1、胶膜固定2、制备分离胶3、制备浓缩胶4、准备电泳5、上样6、电泳7、染色8、脱色9、观察结果第六章限制性核酸内切酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。
细菌限制性内切酶的修饰机理：各种细菌都可以合成一种或几种切割顺序专一的DNA内切酶，，这种酶的主要功能是对外源性的双链DNA进行切割、水解不允许外源性DNA存在细菌自身细胞内，而自身的DNA可以不受酶的切割因为细菌细胞还合成一种修饰酶，可以对自身DNA进行修饰，即改变DNA原来具有的可以被限制性内切酶识别的核苷酸顺序结构，从而不被限制性内切酶识别及切割、水解，这就是限制性内切酶修饰系统。
限制性内切酶分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型Ⅱ型特点：①限制性内切酶修饰系统是由两种酶分子组成的，一种为限制性内切酶另一种为独立的早基化酶，其修饰作用是与限制性内切酶识别位点相重叠的序列。
②识别特定的核苷酸序列3、具有特定的酶切位点酶活性单位：在一定温度，PH及离子强度条件下，1小时内完全酶解（切割）特定底物DNA，所需要限制性内切酶的量，为该酶的活性单位。
酶的标准反应体系：在50ML反应体系中及指定温度下，使用特定的缓冲体系，用一个活性单位的限制性内切酶酶解1pg底物DNA反应1小时，为该酶的标准反应体系。
星号活性：限制性内切酶在非标准反应条件下，某些限制酶的识别或切割位点发生改变，不再严格遵循识别位点酶解DNA的活性称星号活性。
基因克隆：通过体外重组技术将一段目的DNA经切割，连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程基因重组可分为三个水平：整体水平，细胞水平和分子水平一个完整的基因克隆过程包括以下步骤：①获得待克隆的DNA片段（基因）②目的基因与载体在体外连接③重组DNA分子导入宿主细胞④筛选、鉴定阳性重组子⑤重组子的扩增与表达载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫做载体作为基因克隆的载体必须具备以下特征：①载体必须是复制子②具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选③具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入④自身分子量较小，拷贝数高⑤在宿主细胞内稳定性高载体的种类按其功能分类：克隆载体、表达载体、整合载体载体根据外源性DNA进入载体的方式特点分为：插入型载体、替代型载体常用的载体可以分为三大类：质粒、噬菌体及病毒质粒生物学的特性：①质粒是染色体外能够进行自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子，它并不是细菌生长所必须的，但可以赋予某些细菌抵御外界环境因素不利影响的能力②质粒的大小差异很大，最小的只有1kb，只等编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb ③质粒生存在寄主细胞中“友好”的“借居”，离开了寄主它本身无法复制，同时质粒往往有宿主专一性④质粒的复制类型，一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为严紧型质粒（大）。
细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞中只有1-2个质粒⑤质粒的不亲和性，两种亲缘关系密切的不同不能在同一宿主细胞内质粒不相容性：同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定的保持在一个细胞内的现象质粒相容性：若两种质粒进入同一细胞时能够一起复制并共存于该宿主细胞内称为质粒相容性⑥质粒的转移性转移性质粒：含有接合转移基因，能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞非转移性质粒：不含有接合转移基因，⑦质粒的存在形式：有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种λ噬菌体感染机理：在感染早期以以环状分子进行转录之后有两种生活途径，一种是溶菌周期：烈性噬菌体又叫溶菌循环，即环状DNA的多次复制，合成大量基因产物，组成噬菌体颗粒，宿主菌裂解后，流向下一个循环感染烈性噬菌体溶菌生长的基本过程①吸附吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上②注入噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞③转变被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所④合成大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质⑤组装包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒⑥释放合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来DNA重组：DNA分子的体外重组是指在体外的条件下采用一定的技术将任何感兴趣的DNA 片段连接在一起的过程适当的宿主细胞必须符合以下条件：①对载体的复制和扩增没有严格的限制②不存在特异的内切酶体系降解外源DNA ③在重组DNA增殖过程中不会被修饰④重组缺陷型DNA 不会产生体内重组⑤容易导入重组DNA分子⑥符合重组DNA操作的安全标准重组克隆的筛选方法：①抗药性标志的筛选②蓝白斑筛选法③菌落快速裂解鉴定法④内切酶图谱鉴定法⑤通过聚合酶链式反应筛选重组子⑥噬菌斑形成能力筛选法平台期效应：反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而是进入线性增长期或静止期，即出现“停止效应”。
反应体系：4中dntp混合物，引物，模板DNA，TagDNA聚合酶，Mg2+。
引物设计原则：1.序列要位于高度保守区。