狂犬病毒致病机理：基于灭活及减毒疫苗免疫的发现
狂犬病疫苗的工作原理
狂犬病疫苗的工作原理狂犬病，一种严重的病毒感染疾病，常常影响着人类和动物的生命。
为了预防狂犬病的传播，狂犬病疫苗成为了一种非常重要的控制措施。
本文将探讨狂犬病疫苗的工作原理，以及它如何在防止狂犬病传播方面发挥作用。
1. 狂犬病的威胁狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的传染病，主要通过犬类动物的咬伤传播给人类。
这一病毒攻击中枢神经系统，导致症状包括恶心、呕吐、疼痛、肌肉麻痹和痴呆。
如果不及时治疗，狂犬病会致命。
2. 狂犬病疫苗的基本原理狂犬病疫苗的工作原理基于疫苗接种的基本原理，即通过引入病原体或病毒的部分或变性病原体来激发免疫系统的反应。
对于狂犬病疫苗，通常使用的是减毒狂犬病病毒。
3. 减毒狂犬病病毒狂犬病疫苗中使用的狂犬病病毒已被经过特殊处理，以降低其病原性，但仍能够引发免疫反应。
这个过程通常涉及将病毒培养在特定的细胞系上，如细胞培养或胚胎鸡蛋。
在这个过程中，病毒会失去其致病性，但仍能够激活免疫系统。
4. 免疫系统的反应一旦疫苗接种到人或动物体内，免疫系统会察觉到病毒抗原，即狂犬病病毒的部分。
这将引发免疫系统的反应，包括产生抗体。
这些抗体是免疫系统用于对抗狂犬病病毒的武器。
5. 记忆免疫系统疫苗接种后，免疫系统会保留对狂犬病病毒的记忆。
这意味着如果个体暴露于真正的狂犬病病毒，免疫系统将迅速识别并抵御病毒的入侵。
这是疫苗接种的关键效应之一，它赋予个体长期的保护。
6. 疫苗接种计划狂犬病疫苗的接种通常需要多次，以确保充分的免疫保护。
初始接种后，通常需要一定的时间来建立抗体水平，因此随后的接种通常是在特定时间间隔内进行的。
接种计划的具体安排会根据不同地区和国家的公共卫生政策而有所不同。
7. 预防狂犬病传播通过推广狂犬病疫苗接种，可以预防狂犬病在人类和动物中的传播。
在受到狂犬病威胁的地区，接种狂犬病疫苗是一项关键的公共卫生措施。
此外，定期接种狂犬病疫苗也有助于控制疫情，防止其扩散。
总结狂犬病疫苗的工作原理基于激发免疫系统对狂犬病病毒的抵抗力。
狂犬病病毒及其致病和治疗描述
2021/1/12
31
2. 磷蛋白(NS)
NS其实并不是非结构蛋白，由于人们已习惯称其为NS，在此仍 沿用NS之称。
鉴于NS结构的一个重要特点是磷酸化，所以亦称为磷蛋白。又因 为它是衣壳基质蛋白，也有称其为M1。
NS肽链长297个氨基酸残基，序列特点为酸性氨基酸含量高，在 肽链中心部分及N端各有一个疏水区。各株系之间的同源性在92％— 98％。
狗。”
这说明我国在2500年前就已有疯狗(即狂 犬病)存在，而且已认识到这类疯狗对人危 害极大，并采取了有效的措施：驱逐疯狗。
2021/1/12
8
我国现已发现的最早的医方书《五十二病方》
我国现已发现的最早的医方书
《五十二病方》中有治 “狂犬齧人” 和“犬齧 人” 各三方，其中有一种外治方是 “犬所齧， 令毋痛及易瘳方”，具体治法是 “令(齧)者卧， 而令人以酒财沃其伤。” 即被狗咬伤后，采用酒 剂冲洗伤口。
2021/1/12
6
19世纪以前，对狂犬病病因的认识总的来讲是盲目
的，甚至常常是荒谬的。
对病因的解释：极端的燥热；干旱；性挫折；心理过 度紧张等；而 “魔鬼附身” 似乎是更容易被一般人接 受的一种解释。
狂犬病人的典型特征是极想喝水但又极端 “恐水” (狂犬病又称恐水病)，所以古代的治疗方法之一就是将病 人出其不意地扔入池塘，认为这样可以使病人对水的饥渴 和恐惧同时消除。
ＲＶ的基因结构与弹状病毒家族其他成员的基
因结构基本相似。
2021/1/12
28
ＲＶ的基因结构示意图
2021/1/12
29
ＲＶ的5种结构蛋白及其基本功能
ＲＶ的5种结构蛋白序列主要是 由其编码基因的核苷酸序列推导 出来的。
狂犬疫苗作用原理
狂犬疫苗作用原理
狂犬疫苗的作用原理是通过激活和增强人体的免疫系统来防止狂犬病病毒的侵入和感染。
狂犬疫苗主要包含狂犬病毒的灭活或减毒毒株。
当疫苗进入人体后，其中的病毒成分会刺激人体的免疫系统，使其产生特异性的免疫反应。
首先，疫苗激活人体的抗体反应。
病毒成分会被人体的抗原呈递细胞（APC）摄取并加工，然后将病毒抗原呈递给B淋巴细胞。
B细胞会在刺激下分化为体液免疫相关的浆细胞，这些细胞会产生并释放特异性抗体，以便日后抵御病毒感染。
其次，疫苗也会激活人体的细胞免疫反应。
病毒抗原呈递给T 淋巴细胞，特别是辅助性T细胞（Th细胞）。
活化的Th细胞会分泌细胞因子并激活其他免疫细胞，如杀伤性T细胞（Tc 细胞）和巨噬细胞，以协同作用来抵御病毒感染。
这种通过免疫系统增强体内对病毒的防御机制，使得人体在接种狂犬疫苗后能够对狂犬病毒产生免疫力。
这样，如果被感染狂犬病毒，人体的免疫系统可以更快速地识别并清除病毒，从而减轻或阻止病情的发展。
需要注意的是，狂犬疫苗的免疫保护并非立即生效，在接种疫苗后通常需要一段时间才能建立充分的免疫应答。
此外，狂犬疫苗多为多剂次接种，通过多次接种和加强剂可提高免疫效果的持久性和力度。
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准分析-重庆狂犬疫苗抗体检测
人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准分析一、人用狂犬病疫苗的免疫机制、毒株及质量标准狂犬病病毒RNA编码核蛋白（N）、M1、M2、病毒包膜糖蛋白（G）和L五种蛋白，其中G蛋白是狂犬病病毒最主要的抗原，可有效刺激特异性辅助性T细胞和细胞毒性T细胞（CTL）增生，并诱导机体产生特异性抗体。
G蛋白特异性抗体是狂犬病疫苗最重要的保护性抗体，免疫效果主要依赖其抗原表位、结构、蛋白折叠及糖基化等。
N蛋白也是一种有效的保护性抗原，能够刺激B细胞和Th细胞诱导产生细胞和体液免疫。
磷蛋白（P）可诱导CTL，但保护作用较弱。
机体在接种狂犬病疫苗约7天左右产生IgM抗体，在约14天后产生IgG抗体并迅速升高。
IgM和IgG抗体均具有中和病毒的能力，有些中和抗体能进入感染狂犬病病毒的神经细胞内抑制病毒复制。
CTL的高峰出现在免疫后12天，可清除中枢神经系统内的狂犬病病毒，Th细胞可增强抗核蛋白和糖蛋白抗体，也能增加保护效果。
但Suss的研究认为细胞免疫在狂犬病中的作用不明。
由于狂犬病病毒核蛋白序列高度保守，氨基酸同源性达78%至93%，故病毒之间在核壳体水平上存在着广泛的抗原交叉反应。
狂犬病病毒的主要抗原部位为G蛋白外功能区，当其氨基酸同源性>74%时，病毒之间能够交叉中和，为同一遗传谱系内的病毒；膜外区的氨基酸同源性<62%时，则无交叉中和反应。
目前疫苗株均属于遗传谱系I，对遗传谱系II中的病毒感染不具保护作用。
现已经有十余个种类或基因型的狂犬病病毒属病毒被描述为狂犬病的病原体。
目前为止，遗传谱系I的狂犬病病毒是引起人狂犬病的最常见的病毒型别，也是至今应用于狂犬病疫苗生产的唯一病毒种类。
故现有疫苗可能无法为遗传谱系I外的其他血清型病毒感染提供保护。
因此，用于疫苗的病毒种类必须慎重选择。
生产用毒种应是在实验室细胞培养适应和减毒，并具有稳定生物学特性的固定毒株，其历史和来源应确证清楚，并经过全面的特征性检定，符合国家相关文件的要求。
狂犬病病毒简介及致病机理
课程：分子免疫学题目：狂犬病病毒简介及致病机理学院：生命科学学院姓名：朴佳芳学号： ********** 2016年 11月25日狂犬病病毒简介及致病机理摘要狂犬病又称恐水症，为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。
多见于狗、狼、猫等食肉动物。
人多因被病兽咬伤而感染。
临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命为一种古老的侵害中枢神经系统、可引起严重脑脊髓炎的烈性人畜传染病，一旦发病，病死率几乎为100％。
我国是狂犬病高发国家，每年的狂犬病病例数仅次于印度，居世界第二位。
狂犬病由狂犬病病毒属病毒引起，其中作为代表种的RV是引起狂犬病的主要病因。
近年来，随着分子生物学的发展和研究手段的进步，人们对于Rv的结构、基因功能等有了深入的认识，为狂犬病疫苗的研制和改造积累了丰富的资料和理论依据。
本文结合狂犬病和Rv最新的研究进展，对糖蛋白、细胞凋亡、感染与免疫、复制和转录等致病机理及Rv及宿主细胞对病毒感染应答方面等方面作一综述。
关键词：狂犬病狂犬病毒致病性感染Abstract Rabies, also known as fear of water, for the rabies virus caused by a zoonotic acute infection of the central nervous system. More common in dogs, wolves, cats and other carnivores. Many people infected by the disease beast bites. Clinical manifestations of the unique manic, fear of fear, fear of the wind fear of water, salivation and pharyngeal muscle cramps, and finally paralyzed and endanger life as an ancient violation of the central nervous system, can cause severe encephalomyelitis of violent human and animal infectious diseases, Once the disease, the mortality rate is almost 100%.China is a high incidence of rabies countries, the number of rabies cases each year after India, ranking second in the world. Rabies is caused by a rabies virus, in which RV as a representative species is the main cause of rabies. In recent years, with the development of molecular biology and the progress of research methods, people have a deep understanding of the structure and gene function of Rv, and accumulated rich data and theoretical basis for the development and transformation of rabies vaccine. In this paper, we reviewed the recent advances in rabies and Rv, and reviewed the pathogenesis of Rv and host cells, such as glycoprotein, apoptosis, infection and immunity, replication and transcription, and the response to virus infection.Keywords: Rabies Rabies virus Pathogenic Infection目录摘要 (1)一、狂犬病病毒的介绍和分类 (3)二、狂犬病毒的特征和传染情况 (4)（一）传染源 (5)（二）传播途径 (5)（三）传播对象 (5)三、狂犬病病毒致病机理 (6)（一）糖蛋白 (6)（二）细胞凋亡 (7)（三）感染与免疫病毒的复制 (7)（四）复制和转录 (8)参考文献 (8)狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。
巴斯德狂苗--维尔博资料
被动免疫
— 为人体提供最及时的保护
使用抗狂犬免疫球蛋白的原理 (RIG)
[20,21]
在第 0,3,7,14,28天使用单剂量HDCV后狂犬病毒抗体滴度的变化。
情绪波动(激动/抑郁， 攻击性) 恐惧发作(恐水 恐光 恐风) 自主功能障碍(瞳孔散大) 瘫痪
格林－巴利综合症(伴发热) 完全瘫痪
狂犬病发作后基本无希望存活
几乎所有的狂犬病临床症状都会发展成为昏迷和死亡，在发病后数天 时开始昏迷，最后多数由于呼吸循环衰竭而死亡。 至今为止，全球范围内有病案记载的，狂犬病发作后存活的仅有5例， 且这5例患者发作前均已注射过狂犬病疫苗。
儿 童 、 学 生
其 他 人 员
农 牧 （ 渔 ） 民
高，15岁以下儿童占发病数的30－50％*。
– 极易被咬伤头面部、颈部及上肢。
– 被抓伤或咬伤后，未及时告诉监护人，未能得到及时处臵， 所以容易被忽视。
* WHO rabies fact sheet N°99, revised June 2001
狂犬病疫苗接种后不良反应
WHO指出，现代细胞纯化疫苗安全性良好。 以维尔博为例，目前全球成功接种8000多万剂， 尚未发现1例严重不良反应。
一般无不良反应，极少数人可能出现局部红肿、硬结以及荨麻疹等； 个别人的反应可能较重，红肿范围较大，伴有高烧、倦怠等症状； 个别暴露者会出现食欲减退、全身疼痛以及伤口周围长时间有麻木和 疼痛感等现象
狂犬病疫苗
注射疫苗是一种主动免疫过程
主动免疫又称为自然免疫，是将疫苗或类毒素接种于人 体，使机体产生获得性免疫力的一种防治微生物感染的
措施。
路易· 巴斯德—狂犬病疫苗创始人
1881年路易〃巴斯德研究小组证明狂 犬病毒主要在神经中枢复制 1885年，巴斯德第一次将狂犬病灭活 疫苗用于人 1885年后1年多时间里巴斯德利用狂犬 病疫苗成功救治了2500名被带毒犬咬 伤的人
狂犬疫苗原理
狂犬疫苗原理
狂犬疫苗是一种用于预防狂犬病的疫苗。
狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的严重传染病，通常通过动物咬伤或抓伤的方式传播给人类。
狂犬病病毒主要存在于患病动物（如犬、猫、狐狸等）的唾液中。
狂犬疫苗的原理是通过激活人体的免疫系统产生对狂犬病病毒的保护性免疫力。
疫苗中包含的狂犬病病毒抗原能够刺激人体免疫系统生成特异性抗体，这些抗体可以识别并中和狂犬病病毒，从而防止病毒侵入人体细胞并复制。
狂犬疫苗主要有两种类型：活疫苗和灭活疫苗。
活疫苗是由弱毒或无病原性的狂犬病病毒制备而成，通过接种活疫苗可以刺激人体免疫系统产生针对病毒的免疫反应。
灭活疫苗是由经过灭活处理的狂犬病病毒制备而成，虽然疫苗中的病毒已失去感染能力，但仍具有免疫原性，能够激活人体免疫系统产生抗体。
根据狂犬病的防治需要，狂犬疫苗通常采用注射的方式进行接种。
在接种后，人体的免疫系统将启动针对狂犬病病毒的免疫反应。
这个过程包括抗原被识别、抗体生成、细胞免疫等防御机制，最终形成持久的免疫保护。
狂犬疫苗的接种是预防狂犬病的最有效手段之一。
疫苗的接种需要按照规定的剂量和时间表进行，以确保免疫效果的持续性和有效性。
同时，根据不同地区的疫情情况，可能需要进行加强针或者定期的疫苗接种来保持免疫力。
总的来说，狂犬疫苗通过刺激人体免疫系统产生对狂犬病病毒的免疫反应，从而预防狂犬病的发生。
疫苗的接种是一种安全有效的措施，可以降低病毒传播的风险，保护个体和公众的健康。
狂犬病预防控制技术指南解读 2016版
ppt课件
5
狂犬病简介-病毒情况
对脂溶剂（肥皂水、氯仿、丙酮等）、乙醇、甲 醛、碘制剂以及季胺类化合物、酸（PH 4以下） ，碱（PH 10以上）敏感，容易被杀灭
肥皂水（或其他弱碱性清洗剂）和一定压力的流动清水交替清洗
咬伤和抓伤的每处伤口至少15分钟。
对日光、紫外线和热敏感，病毒悬液经56℃ 30 ～60分钟或100℃ 2分钟即失去活力，因此也易 被巴氏消毒法消毒
ppt课件
12
暴露分级情况
a.暴露于啮齿类动物、家兔或野兔时通常无需接受 狂犬病暴露后免疫预防。
b.禽类、鱼类、昆虫、蜥蛎、龟和蛇不会感染和传 播狂犬病
c.发生在头、面、颈部、手部和外生殖器的咬伤属 于III 级暴露。（WHO 推荐：由于头、面、颈、手 和外生殖器部位神经丰富，建议这些部位的暴露属 于III级暴露
通过肌肉周围神经末梢进入神经系统
病毒在伤口周围肌肉细胞中复制 被动物咬伤而感染病毒
病毒的侵入；病毒停留在 伤口附近横纹肌细胞内缓 慢繁殖1－2周或更长
ppt课件
7
Part.02
犬伤处置介绍
ppt课件
8
暴露后处置
ppt课件
9
ppt课件
10
暴露的分级
暴露类型
2016版指南
暴露程度 暴露后免疫预防处置
“2-1-1”程序：第0 天接种2 剂（左右上 臂三角肌各接种1 剂），第7 天和第21 天 各接种1 剂
五针 法
五针法 第0、3、7、14 和28 天各接种1 剂，共接 种5 剂；
ppt课件
18
暴露前预防: 基础免疫
适用人群:高概率接触到病毒的人
所有持续、频繁暴露于 狂犬病病毒危险环境下的 个体均推荐进行暴露前预 防性狂犬病疫苗接种
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(此文是一篇专业论文的全文翻译，本来是作内部参考用，但因很多网友关心这方面的问题，而在网上对相关问题常有过时或错误的观点流传，所以在此全文发布，供感兴趣的网友参考。
因主要是供本专业人员阅读的文献，对其他专业或一般读者，其中有些内容可能不易理解，可先只看摘要。
我们以后争取能有时间作一些简化的解读。
)摘要虽然狂犬病疫苗的应用已经有一个多世纪的历史，但是狂犬病疫苗通过免疫接种或天然感染后引起机体免疫应答的具体机制仍不太清楚。
本研究通过减少灭活和减毒活疫苗剂量，分别采用常规、提前或延迟的处治方案来比较所产生的不同保护效果。
分别对2月龄叙利亚地鼠、4周龄ICR小鼠或成年猕猴接种犬狂犬病毒（RV）变种。
在暴露后6小时、1、2、3、4、5、6和7天开始处治。
应用单剂或多剂灭活疫苗（HDCV）、反向遗传技术构建的减毒活疫苗或γ射线灭活的ERAG333疫苗进行肌肉接种。
对病毒在这些啮齿类动物模型中的传播动力学进行监测。
结果发现，RV在感染4天后播散到脊髓，6天到达脑部。
在暴露后迟至5－6天才接种ERAG333活疫苗的地鼠全部死亡。
而在6小时、1、2、3和4天分别接种一个剂量的ERAG333活疫苗的存活率分别是78%，44%，56%，22%和22%。
与此相似，在暴露后24小时接种灭活ERAG333疫苗，地鼠存活率是67%。
如果标准预防方案――埃森(Essen)方案推迟3-6天才执行，则所有的地鼠全部死亡，而暴露后1-2天即开始进行预防的地鼠的存活率分别是67%和33%。
猕猴在暴露后24小时接种一剂减毒的ERAG333疫苗即可获得保护力。
即使预防延迟，高度减毒（活的）和灭活的ERAG333疫苗也可诱导强有力的保护性免疫反应。
按照埃森方案，采用2-5剂商品疫苗和人狂犬病免疫球蛋白（HRIG）进行预防，实验动物的存活率可达89-100%。
经缩减的疫苗接种程序仍可以提供有效的预防，接种疫苗的剂量总数不影响结果。
1. 引言狂犬病一旦发病就会致命，但是如果能够尽早采取适当的暴露后预防（PEP），完全可以避免疾病发生。
到目前为止，还没有单独的任何一种药物具有特异性的治疗效果，但是联合采用不同生物制剂的治疗方案可发挥协同作用，已成功地应用于实验性治疗。
目前，PEP仍是在暴露后唯一有效的预防人类狂犬病的方法。
现代的PEP主要包括被动免疫和主动免疫，被动免疫是早期输入针对狂犬病毒（RV）的中和性抗体，这些抗体是由病毒的有效成分刺激产生的；而经诱导产生的主动免疫则可进一步清除外周组织的病毒。
在接种的疫苗能产生主动免疫应答之前，被动输入免疫球蛋白所提供的病毒中和抗体(VNAs)可以填补机体抵抗力暂时的空缺，这是PEP的一个重要组成部分，特别是对于严重的暴露。
以往的实验表明，体液免疫对清除外周RV作用很大，而细胞免疫应答则作用有限。
PEP一方面可以快速诱导免疫应答，还可以使机体产生持续的免疫记忆，这是PEP的另一个重要作用。
在过去的一个世纪中，狂犬病疫苗生产所用的基质、减毒和灭活的水平和方式，以及接种途径都发生了巨大变化。
同时，由于疫苗免疫原性、有效性和安全性的提高，PEP经肌肉途径接种疫苗的剂量从原来的21剂以上逐渐减少到现在的4剂。
关于未来的疫苗产品，亚单位、DNA和重组活疫苗都正处在实验评估阶段。
尽管狂犬病生物制品的生产在全球已得到改进，对狂犬疫苗的免疫原性和有效性的认识也在不断进步，但其实际应用仍受到经济和技术的制约。
在21世纪，某些国家仍在生产神经组织疫苗，并用作暴露于疯动物后唯一的预防手段。
而且，尽管针对狂犬病的成功的疫苗接种已有一个多世纪的历史，但在自然感染或接种灭活或减毒活疫苗所引起早期的细胞和体液免疫的分子机制仍不清楚。
本研究目的是在不同动物模型中，对各种灭活和减毒狂犬病疫苗及PEP程序的预防效果进行实验比较。
2.材料与方法2.1.动物与病毒2 月龄雌性叙利亚地鼠（金仓鼠）、4 周龄雌性ICR小鼠，在实验前至少观察72小时。
1 岁龄雌性猕猴，实验前至少经2 个月检疫。
为了便于对比，选用两种不同的犬街毒株作为攻击毒株。
其中一株滴度为10(2.5 次方)MICLD50/50μl，分离自德克萨斯州一只自然感染狗的唾液腺；另一株滴度为10(2次方)MICLD50/50μl，分离自墨西哥一只自然感染狗的唾液腺。
所有的实验动物的处理及实验程序都是符合疾病预防与控制中心关于动物管理和操作委员会的指导方针。
2.2.生物制品对于啮齿类动物，根据实验设计方案一次性接种最低效价为2.5 IU/ml的50μl （非人灵长类动物1ml）HDCV ，Imovax®(sanofi pasteur)或50μl 纯化的鸡胚疫苗(PCEC)，Rabavert (Novartis)。
同样地，对于啮齿类动物，根据PEP的原则，在相应部位肌肉注射50μl未经稀释的HRIG，HyperRabtm S/D (Talecris Biotherapeutics, 150 IU/ml)或Imogam®Rabies-HT (sanofi pasteur, 150 IU/ml) 。
减毒疫苗ERAG333（通过定点突变的方法将病毒G蛋白333位点的精氨酸突变为谷氨酸）和ERA2G333（含有两个G基因，333位点都突变）通过反向遗传系统构建。
ERAG333株显示出高度的安全性，对3 周龄的成年小鼠及其他目标或非目标物种均无致病性，甚至经颅内注射也是如此。
经γ 射线灭活的ERAG333株，将灭活病毒样品在鼠神经瘤细胞（MNA）中连续传3代以验证完全灭活的病毒。
将减毒或灭活的ERAG333株50μl (10(9次方) TCID50/ml)肌肉接种于仓鼠或小鼠右腓肠肌或接种1ml于猕猴三角肌(10(9次方) TCID50/ml)。
2.3. 实验方法2.3.1.直接荧光抗体试验(DFA)采用异硫氰酸荧光素标记的单克隆抗体检测脑组织样本中的狂犬病毒抗原。
2.3.2 .逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及半嵌套式RT-PCR (hnRT-PCR)采用RT-PCR和hnRT-PCR方法追踪检测RV从地鼠的接种部位到达脑部的过程。
采集腰部、胸部脊髓及脑部切片组织，应用无菌技术以防止交叉污染，按照TRIzol Reagent（Invitrogen）说明书进行操作提取组织总RNA。
逆转录的引物为1066fw （5’ GAG AGA AGA TTC TTC AGG GA 3’ ），引物根据RV PV 株基因组（登录号M13215）1136nt–1155nt处的序列设计，反应条件为42℃90 min。
第一次PCR采用引物1066fw和304rv（3’TTG ACA AAG ATC TTG CTC AT 5’）扩增病毒基因组从304nt–1066nt的一段序列。
另设计两条引物通过hnRT-PCR 检测微量的病毒RNA：(a) 1087fw (5’ GAG AAR GAA CTT CAR GA3'，1087–1104) 和304rv；(b) 504sfw（5’TCA TGA TGA ATG GAG GT 3’ ，504–521）和304rv。
两次PCR反应条件一致：94 ◦C预变性1 min，40 个循环：94 ◦C 30s，37◦C 30s，72◦C 1.5 min，最后72 ◦C 延伸7min，采用3.5%琼脂糖凝胶的方法检测扩增片段大小，然后通过序列分析鉴定病毒。
2.3.3.快速荧光灶抑制试验(RFFIT)采用RFFIT方法利用CVS-11作为攻击毒株检测病毒中和抗体（VNA）。
2.3.4 .统计学分析统计并绘制Kaplan–Meier生存曲线(SAS 9.2)，采用时序检验法(log-rank test)分析各个实验组的生存量差异。
同一生存函数的检验假设在P < 0.05时被否定。
2.4.应用灭活的商用HDCV和减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333对地鼠进行PEP2.4.1 利用分离于德克萨斯狗的RV进行攻击实验将分离于德克萨斯狗的RV(10(2.5次方)MICLD50/50μl )肌肉接种于2 月龄雌性叙利亚地鼠(6只/组)左腓肠肌。
实验动物根据不同的PEP方案被分为若干组，每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 灭活的HDCV或减毒疫苗ERAG333或ERA2G333。
接种HDCV的实验组，于0, 3, 7, 14和28天各接种一剂（同时注射或不注射HRIG）；接种减毒活疫苗ERAG333或ERA2G333的实验组，每只动物只接种一次，分别于暴露后1、3、5或7天；对照组6 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。
2.4.2. 利用分离于墨西哥狗RV进行攻击实验将2月龄雌性叙利亚地鼠分为13组（9只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl(10(2次方)MICLD50/50μl ) 分离于墨西哥的狗RV。
然后，应用减毒的ERAG333疫苗在6小时、24小时和2、3 、4、5、6天对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。
埃森方案规定于暴露后0、3、7、14和28天各接种一剂HDCV疫苗或同时注射HRIG。
对照组9 只地鼠不做任何处理，发病后于1-6天执行安乐死并检测病毒的播散情况。
收集各个实验组动物腰部、胸部脊髓和脑组织并用hnRT-PCR检测病毒RNA。
同时，每日观察动物情况，连续观察4 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。
2.5.应用减毒和灭活的ERAG333疫苗对地鼠进行PEP将2月龄雌性地鼠分为5组（6只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl （10(2次方)MIC LD50/50μl）分离于墨西哥狗的RV。
然后，应用减毒或灭活的ERAG333疫苗在24小时和3 天对地鼠进行PEP，每只地鼠只免疫一次。
每日观察动物情况，连续观察2 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。
2.6.应用灭活的细胞培养疫苗或减毒的ERAG333疫苗对猕猴进行PEP将成年雌性猕猴分为3组（3只/组），每只猕猴经咀嚼肌注射0.5ml 滴度为10(2次方)MIC LD50/50μl分离于墨西哥狗的RV。
24小时后，第一组于三角肌接种1ml HDCV(根据埃森方案于0, 3, 7, 14和28天各一剂，不包括HRIG）；第二组于三角肌接种一次1ml 减毒ERAG333疫苗（10(9次方)TCID50/ml）(于3, 7, 14和28天在三角肌接种1ml PBS）；第三组只在0, 3, 7, 14和28天于三角肌接种1ml 的PBS。
所有动物在第1 个月每周采一次血检测VNA，1 个月后继续每日至少观察动物两次，连续观察3 个月，并对发病动物执行安乐死，做好记录。
2.7.在地鼠模型中检测早期和延迟进行标准PEP（5剂疫苗）的有效性将地鼠分为6组（3只/组），每只地鼠经左腓肠肌注射50μl 滴度为10(2.5次方) MIC LD50/50μl分离于德克萨斯狗的RV。