加强临床流式细胞免疫表型分析的质量控制

万方数据 作者单位： 北京大学第一医院检验科 !"""#$，
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中华检验医学杂志 ’((% 年 J 月第 ’N 卷-5，U61V64< ’((%，:"; ’N，W"& J
度依赖于 !"#$ 的滴度、 合适的仪器设置和校准等。应了解每一种 !"#$ 的灵敏度。 !"#$ 与细胞的比例、 用 !"#$ 检测单一样本， 重复测定 ’( 次以上。正常外周血、 骨髓、 培养细胞系和质控物 （如美 %& 精密度： 国 )* 公司的 +* +,-. 等） 可用于精密度测定。对每一种 !"#$ 应测定其均数和标准差， 作为 !"#$ 每次应用 时的参考。 商品化的 !"#$ 一般都标明其适用范围。按用途可分为 % 类： 体外诊断 （ 01 2034" 50671"808， /& 适用范围： 试剂、 分析特异性试剂 （ 616;<3-=8>-?0@0? 4-67-138，#AB） 和仅供研究用 （ "1;< 4-8-64?,） 试剂。作为临床应用 9:*） 的 !"#$， 建议尽可能使用 9:* 和 #AB 试剂， 尤其是对临床具有诊断或治疗意义的试验， 如白血病与淋巴瘤 的免疫分型、 血液淋巴细胞免疫表型分析与免疫细胞亚群绝对计数、 外周血造血干 C 祖细胞计数、 淋巴细胞 DE#=)’F 定量分析等。 三、 免疫荧光染色方法 依据分析目的不同选用， 间接免疫荧光染色已较少， 直接免疫荧光染色包括单色 G 四色分析， 二色以上 分析较为常用； 现已可达十色分析， 但临床尚未应用。单色免疫荧光多用于 !"#$ 特异性较高、 单一细胞群 的抗原检测， 如红细胞膜 +*HH 或 +*HI 测定。血液淋巴细胞免疫表型至少应用双色分析， 白血病与淋巴瘤 的免疫分型、 淋巴细胞免疫亚群绝对计数、 造血干 C 祖细胞计数等复杂免疫表型宜采用三色或四色分析。在 多色免疫表型分析的荧光素标记 !"#$ 组合时， 应注意不同 !"#$ 彼此间有无干扰， 最好采用同一品牌的试 剂， 因为不同品牌的荧光素标记 !"#$ 的生产工艺和标记的荧光色素等有差异， 可干扰免疫反应和影响流式 细胞仪测定时的颜色补偿， 产生假阳性或假阴性结果。组合的多色标记 !"#$ 可以从厂商购买， 也可由本实 验室制备， 但组合的多色标记 !"#$ 的荧光信噪比、 对靶细胞的结合强度应该与未组合时相同。 血液或骨髓免疫荧光染色后的溶血处理， 溶血免洗一般用于细胞绝对计数， 其他的免疫表型分析应尽可 能溶血后洗涤 J 次， 减少红细胞碎片的干扰。 四、 对照设置 流式细胞 术 分 析 免 疫 表 型 必 须 设 置 各 种 对 照 （ ?"134";8 ） ， 包括阳性对照 （ >"80302- ?"134"; ） 、 阴性对照 （ 1-76302- ?"134";） 、 正常对照 （ 1"4K6; ?"134";） 、 同型对照 （ 08"3<>- ?"134";） 、 空白对照 （ $;61L ?"134";） 等。对照的目的 是避免各种因素可能造成的假阳性或假阴性反应。 是检查已知阳性标本能否用所测条件与方法确定为阳性， 如 +*% 的 !"#$ 检测正常人血液 J& 阳性对照： 若明显低于此值， 则有可能是 !"#$ 的质量与浓度、 荧光染色条 M 淋巴细胞的阳性率一般应大于 N(O 以上， 件、 流式细胞仪的状况等存在问题。阳性对照达不到要求时不能进行临床试验。 是指与 !"#$ 相同的、 未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类， 若使用直接免疫荧光染色法， 同型对 ’& 同型对照： 照也应标记荧光色素， 如 97PJ=Q9M+、 97P’6=RS 等。主要考虑了细胞的自发荧光、 Q+ 受体介导的抗体结合和 非特异性抗体结合等影响因素。此外， 同型对照与 !"#$ 所标记的荧光色素、 浓度、 （标记的荧光色 Q： R 比值 素与免疫球蛋白分子的比值） 应该相同为最佳， 这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义， 切忌使用 与 !"#$ 不相匹配的同型对照， 最好为同一实验室、 采用相同工艺或方法制备 （如同一品牌） 的产品。 仅以缓冲溶液， 如 R)A、 其余条件与阳性或同型对照 %& 空白对照： DSRSA 缓冲液等替代 !"#$ 进行试验， 相同。空白对照主要用于观察细胞和缓冲液中所含物质的自发荧光。由于一般标本细胞的自发荧光极弱， 又已做同型对照， 免疫表型分析时可以免做空白对照。 用健康人、 近期无感染、 未使用任何药物的标本 （如血液） 作为对照。对一种新的 !"#$ （如 /& 正常对照： ， 在使用前进行对照试验， 可了解其性质、 效价等特性是否符合实验要求。在临床试验时， 为了避 +*JI=Q9M+） 免一些不定因素可能造成对实验结果的的影响， 以及与患者测定结果比较， 常常需要正常对照。例如， 正常 对照血小板 +*/J 阳性百分比应至少 T IHO 以上， 平均荧光强度 （!Q9） 比同型对照强 H G J( 倍以上， 若正常对 照出现异常结果， 则不能出实验报告。 是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测， 应出现阴性结果的对照试验。阴性对 H& 阴性对照： 照试验可以避免 !"#$ 的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。如血小板无力症 （ 9 型） 患者， 由于 万方数据 其血小板缺乏 可作为最好的阴性对照。测定血小板膜 +*/J 时， 方法同正常对照， 只是将正常 +*/J 和 +*NJ，
中华检验医学杂志 /""# 年 ! 月第 /3 卷第 ! 期
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述评・ ・
加强临床流式细胞免疫表型分析的质量控制
王建中 流式细胞术 （ %&’） 的应用越来越广泛， 流式细胞免疫表型分析已经成为最常用的检查项目。 %&’ 可以 通过多参数分析异质性细胞群的免疫表型， 从双参数分析外周血细胞到参数以上分析骨髓细胞膜、 细胞浆和 细胞核等多种抗原成分， 涉及临床多种疾病的诊断、 治疗与预后等诸方面。白血病和淋巴瘤的免疫表型分 析、 微小残留白血病细胞的免疫检测是血液肿瘤的形态学诊断与监测的重要补充和深化； 血液淋巴细胞免疫 表型分析与免疫细胞亚群绝对计数是评价机体免疫功能、 诊断与监测免疫性疾病的重要手段； 精确计数外周 血造血干 ( 祖细胞的数量， 是判断最佳采集时机、 成功进行造血干细胞移植的关键； 血小板免疫表型分析和免 疫性血小板计数对出血与血栓性疾病的诊断与治疗有决定性作用； 血液中 ) 淋巴细胞膜 *+,-./0 表达的精 确定量是诊断强直性脊柱炎的重要指标。然而， 免疫表型分析结果存在多种影响因素， 包括样本与试剂准 备、 单克隆抗体 （’1,2） 、 免疫荧光染色方法、 对照设置、 流式细胞仪校准、 流式细胞数据的获取与分析等。只 有充分了解这些影响因素并做好严格的质量控制， 才能保证其试验结果的准确、 可靠， 且具有临床应用价值。 一、 样本与试剂准备 免疫表型分析的样本如血液、 骨髓、 体液等必须当天采集， 特殊试验， 如循环 3 4 之内进行免疫荧光染色； 活化血小板检测应在采血后立即染色与固定。所使用的抗凝剂、 缓冲液、 溶血剂、 固定剂等必须符合标准， 如 血液、 骨髓的抗凝采集管， 最好使用 56),-7/ 或枸橼酸钠真空采血管。用于稀释、 洗涤细胞的缓冲液应经 8 并含有 "9!; 的牛血清白蛋白， 减少颗粒的干扰和对单克隆抗体的非特异性吸附。 "9/ ! : 孔径的滤膜过滤， 组织样本应去除聚集并过滤、 制备单细胞悬液， 不应用进行酶消化和乙醇固定， 避免破坏或改变抗原结 构， 可采用机械法去聚集， 目前广泛使用的单细胞制备仪 （:<=>:?@4>A<） 最适合组织细胞的去聚集。 ， 因 红细胞溶解液 （溶血剂） 最好使用在国内外广泛应用的试剂 （如美国 .6 公司的 %,&B +CD>AE D1FGH>1A） 为经不同种类的溶血剂作用的白细胞对 ’1,2 的结合及光散射特性有显著差别， 对免疫细胞亚群 （如淋巴细 胞亚群） 计数的参考范围也不同。 细胞过多或抗体浓度过低、 过高都可影响免疫表型分析。 ’1,2 与细胞的结合依赖于两者合适的比例， 分析血液细胞免疫表型时， 应计数血液白细胞数量。当 I.& 8 ! """ (! 用 /"" ! 加溶血剂 $ :F F 时， F 血标本、 （%,&B +CD>AE B1FGH>1A） 、 （ ； 用 !"" ! 加溶血剂 / :F、 ’1,2 /" ! F .6 ’1,2） I.& 在 ! """ J !" """ (! F， F 血标本、 用 K" ! 加溶血剂 ! :F、 血液应 ’1,2 /" ! F； I.& 在 !" """ J /" """ (! F， F 血标本、 ’1,2 /" ! F； I.& L /" """ (! F， 用磷酸盐缓冲液稀释至! """ J !" """ (! 用稀释血 !"" ! 加溶血剂 ! :F、 F， F、 ’1,2 /" ! F。 二、 单克隆抗体 !9 特异性： ’1,2 的特异性应该通过识别正确的靶抗原进行定义。’1,2 的特异性多是由制造商在其产 品说明书上列出， 但应注意所列 ’1,2 的细胞克隆是否为国际白细胞分化抗原鉴定会议通过。对于白血病 和淋巴瘤的免疫分型、 结果的解释应与形态学的 “金标准” 和临床表现比较， 每个实验室应该建立所用 ’1,2 的流式细胞术分析偏差的期望值， 一般 8 K; 。然而， “自制” 试剂， 随着每个实验室的方法不同可 ’1,2 属于 能存在正常或异常细胞诊断特异性方面的差异。临床血液病学检查的标本几乎总是正常细胞伴随着异常细 胞， 因此在 ! 份标本中能够同时评价两类细胞， 只有正常细胞的免疫表型正确时， 异常细胞的免疫表型结果 才是可靠的。 是指与非特异性或阴性对照染色相比， 能够被流式细胞仪检出的最低荧光染色强度。灵敏 /9 灵敏度：