流式细胞术
细菌学检验-13-流式细胞技术
液流系统（流动室、液流驱动系统）示意图
流动室
鞘液
进样孔
喷嘴
荧光信号
Fluorescence signals
激光束
Focused laser beam
FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
（2）光学系统：激光光源、光收集系统
激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射较长波长的光，通过较
BD LSR
FACS Vantage DiVa
科研型（大型机）
特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选
FACSAria
科研型
特点： 分辨率高
选配多种波长和 类型激光器
可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
适用于高速分选 和多色分析
（4）分选系统
配有分选装置，分选带有某 种特性的细胞
单波长、高强度、高稳定性
多采用氩离子激光器或氦氖激光器
一般选配2~4根激光，488nm 、633nm和 355nm、407nmUV激光
最多检测13个荧光参数
光收集系统：滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及 细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下， 通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。
细胞不被破坏，单个细胞，测量快速、大量、多参数、 准确、灵敏、定量
流式细胞术基础知识
讲者：***
目录
1、流式细胞术基本定义 2、流式细胞仪介绍 3、荧光染料介绍 4、不同型号流式细胞仪简介 5、流式细胞仪应用
流式细胞术定义
流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、 准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多 项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选
淋巴细胞亚群分析可以了解机体在不同条件下的免疫功能 状态，主要包括细胞免疫功能和体液免疫功能。在临床上，主要用 于对免疫系统造成明显干扰的相关疾病的辅助诊断，分析疾病的发 病机理，监控疾病的病程进展，观测疗效及监测预后等等。
流式细胞仪临床应用
临床意义 CD3+ CD3+ CD4+ CD3+ CD8+ CD4+ / CD8+ B细胞 NK细胞
FITC, PE,ECD,PC5 or PECy5.5,PE-Cy7
APC, APC-Cy7
国食药监械(进)字 2014第2403463号
FITC, PE,ECD,PC5 or PC5.5,PC7
红光:638nm 紫光：405nm
APC，APC-Cy5 or APCAlexa Fluor 700, APC-Cy7 or APCAlexa Fluor
谢谢！
部分演示内容来源于网络，如有侵权，请联系删除！谢谢！
APC, APC-Cy7
浙械注准 20192220121
流式细胞仪应用
临床研究
血液，肿瘤， 药理，免疫…
环境研究
湖泊，海洋 生态研究…
生物学研究
遗传，生殖， 微生物，细胞 生物，毒理， 分子生物…
食品制药工业
食品检测、药物筛 选，疫苗研究…
流式细胞术名词解释
流式细胞术名词解释
流式细胞术（flow cytometry）是一种高速、高效的单细胞分析
技术，广泛应用于生命科学中。
该技术利用激光束和多重探针对单个
细胞进行多参数分析，可以快速获取细胞表面、内部分子以及细胞特
性的详细信息。
在流式细胞术中，细胞被分散在流动液体中，通过细胞分流器进
入流式细胞仪的测量单元。
激光器对细胞进行激发，然后由散射仪和
荧光仪收集并分析激发光信号。
散射光可以提供关于细胞大小和形状
的信息，而荧光探针可以用于检测细胞表面抗原、内部蛋白、DNA含量、RNA含量等多种细胞特征。
流式细胞术的优势在于可以快速高效地处理大量的样本，适用于
单细胞和多种细胞的分析。
同时，该技术还可以对细胞进行有效的分
选和分离，具有极高的精确性和灵敏度。
因此，流式细胞术在生物学、医学、生物工程等领域中得到了广泛的应用。
例如，在癌症诊断中，
通过流式细胞术可以区分不同类型的癌细胞，进一步指导治疗方案的
设计和实施。
总之，流式细胞术已经成为现代生命科学中不可或缺的工具之一。
其在高通量、高精度分析和细胞分选中的优势，可以为研究细胞和疾
病提供重要的科学基础。
细胞鉴定 流式和ngs
细胞鉴定流式和ngs
细胞鉴定是对细胞的种类、性质和功能进行确定的过程。
流式细胞术和二代测序（NGS）是两种常用的细胞鉴定技术，它们各有优缺点。
流式细胞术是一种基于细胞表面标志物的快速、高通量的细胞分析技术。
它通过将细胞悬液逐个通过激光束，检测细胞表面标志物的荧光信号，从而实现对细胞的分类和鉴定。
流式细胞术具有快速、灵敏、多参数、高通量等优点，可用于检测细胞表面标志物、细胞周期、细胞凋亡等。
然而，流式细胞术只能检测已知的标志物，对于未知的标志物则无法进行鉴定。
二代测序（NGS）则是一种高通量的基因测序技术，它可以对细胞中的所有基因进行测序，从而实现对细胞的全面鉴定。
NGS 可以检测细胞中的基因突变、基因表达、表观遗传学等信息，从而深入了解细胞的生物学特征和功能。
然而，NGS 技术相对复杂，需要专业的实验技能和生物信息学分析能力，同时成本也较高。
综上所述，流式细胞术和二代测序（NGS）各有优缺点，在细胞鉴定中应根据具体需求选择合适的技术。
如果需要快速、高通量地检测已知的标志物，流式细胞术是一个不错的选择；如果需要全面了解细胞的基因信息，NGS 则更为适合。
简述流式细胞术的原理与应用
简述流式细胞术的原理与应用一、流式细胞术的原理介绍流式细胞术（Flow cytometry）是一种利用流式细胞术仪（Flow cytometer）对单个活细胞进行多参数分析的技术。
它基于细胞的光学性质和生物化学特性，通过探针标记、荧光染料和细胞表面抗原的相互作用，对细胞进行高速连续检测和分离。
流式细胞术的原理如下：1.细胞悬浮和样本处理：将细胞样品作为悬浮液，通过离心等方法将细胞分散在液体中，去除细胞的团块和碎片，保证单个细胞的流式检测。
2.细胞标记：采用流式细胞术特定的探针和染料对细胞进行标记，以便后续检测和分析。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记和细胞分子探针标记。
3.细胞分离和传送：将标记的细胞悬浮液通过流式细胞术仪，以流速每秒数千个细胞的速度单个分子传送到探测点。
4.光散射与荧光探测：细胞经过流式细胞术仪后，以激光束照射细胞，通过散射光和荧光信号的检测，对细胞进行空间分布和化学信息的获得。
5.数据采集与分析：通过计算机系统采集和记录细胞经过流式细胞术仪后所产生的光散射和荧光信号，在分析软件中对数据进行处理和解读，获得有关细胞的信息。
二、流式细胞术的应用流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术，它在细胞学、免疫学、血液学、肿瘤学等领域有着重要的应用价值。
下面列举几个流式细胞术的应用示例：1.血液学研究：流式细胞术结合细胞表面标记和荧光染料标记，可以对血液中的不同细胞类型进行快速的鉴定和数量分析。
例如，通过流式细胞术可对血液中的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞等进行分类和计数，从而判断患者的免疫状态和疾病进展。
2.癌症诊断与治疗：流式细胞术对肿瘤细胞的检测和分析有着重要的作用。
通过流式细胞术，可以检测和定量肿瘤细胞的表面抗原和细胞内信号分子，进一步了解肿瘤细胞的类型、分化程度和增殖状态，为癌症的诊断和治疗提供指导。
3.免疫学研究：流式细胞术能够对免疫系统中的各种细胞类型进行鉴定、计数和功能分析。
流式细胞术简介及应用进展课件
流式细胞术简介及应用进展
15
▪高速度：分析细胞数：1000个/s→60000个/s ▪高灵敏度：荧光分子数/细胞：3000→100个FITC； ▪高准确度：区分两个细胞：参数：相差5% →1%； ▪高精度：CV值：7% →< 1%; ▪多参数：荧光：1个 →12个参数； ▪高纯度：分选细胞：80-90% →99.9%; ▪其 它：荧光信号：线性检测→对数检测
电子程序化单细胞分选仪——Electronically programmable individual cell sorter, EPICS (Coulter公司）
流式细胞术简介及应用进展
5
BD FACSCalibur型 FCM （单L，3F）
流式细胞术简介及应用进展
6
Coulter EPICS XL/XL-MCL （单L，4F）
流式细胞术简介及应用进展
11
BD FACSAria
BD FACSCount
CD3\4\8 专为HIV监测设计的经济普及型流式细胞仪
流式细胞术简介及应用进展
12
BD FACSCanto 2L 6C
流式细胞术简介及应用进展
13
BD FACS Calibur 1L 4C
流式细胞术简介及应用进展
14
三、流式细胞术应用的新进展
流式细胞术简介及应用进展
17
2、cytometric bead array (CBA)
微球流式芯片技术(CBA)是一种微球多参数检测分析技 术，它用一系列的微球组合来捕获并结合流式细胞术检 测溶液中被检测物质的量，其采用夹心法分析策略。用 已知的标准品和对照标准曲线就可得出被测样品的浓度。 这种检测方法，既不受样品量的限制，也可同时检测多 项指标参数；客观、省时、人为因素影响小。
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞术原理
流式细胞术原理流式细胞术原理概述：1.什么是流式细胞术：流式细胞术是将多种特定条件下的离体细胞（即细胞不在原生质上）置入一个流式细胞仪，并利用各种仪器和仪器注入液体，通过细胞之间物质交换，使其在有限时间内受到良好的刺激、富集和选择，从而在定量和质量上均匀地输出体外驯化后的细胞。
2.流式细胞术应用：（1）表型分析：基因表达分析、蛋白质表型分析、抗原检测以及多种分子诊断测试；（2）免疫学应用：免疫细胞排序（FACS）、免疫细胞鉴定、免疫细胞功能分析；（3）其他研究：血液细胞分离以及人类疾病细胞的示蹤。
3.Flow Cytometry的原理：首先，将活细胞置于流式细胞术仪中，然后，在仪器里运动，在仪器里的运动速度是一个恒定的流动；接着，激光会从另一边投射进去，在有特定滤波器的情况下，激光射线就会倒射，与细胞中存在的染料结合，以此来分析表达位点上的基因和蛋白的表达情况，并且在此过程中会记录下所有的数据；最后，细胞会流经检测仪的椭圆形游标，当单束仪检测到某个细胞时，就会发出一个电信号，这样就可以将其标记出来，最后可以将所有细胞记录下来，便于分析表达位点或者染料反应情况，从而分析细胞的类型及其分布情况。
4.Flow Cytometry技术优势：（1）快速：流式细胞术可以在几秒钟内完成大量细胞的分析；（2）灵敏：细胞可以通过可调的激光强度以及多样的滤波器在流式细胞术下被准确检测；（3）准确：使用低酵母可以对细胞表面抗原以及内在细胞特性有更加准确的测定；（4）方便：整个实验过程只需要较少的样本量即可完成，且可以重复性进行，从而可以进行大量的分析和比较。
综上所述，流式细胞术是目前用于研究表型分析、免疫细胞排序以及细胞表面抗原及细胞内特性检测等多个研究领域，功能强大，分析快速准确，整个实验过程便捷、经济等特点，极大地拓展了体外实验、单细胞研究和诊断测试领域，成为细胞及分子生物学研究的有力工具。
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荧光素直接与FcR结合
做多色分析时，要尽量选择荧光波谱重叠
较小的荧光染料进行组合。
荧光素的搭配
依据
流式细胞仪检测的通道数
需要同时检测的荧光抗体数
厂家提供的荧光素种类和数目
3. 仪器调整及数据获取
荧光补偿：指在流式细胞多色分析中，纠正荧
光素发射光谱重叠的过程，即从一个被检测的 荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。
Mean：平均荧光强度 Geo mean：几何均数 CV：细胞荧光变异细胞 Median：荧光强度的中值
Peak Ch：峰值道数
多参数分析-二维散点图
散 射 光 越 强 ， 细 胞 内 部 颗 粒 和 细 胞 器 越 多
与 细 胞 内 部 的 精 细 结 构 和 颗 粒 性 质 有 关
侧 向 角 ： 细 胞 通 过 测 量 90° 方 向 的 散 射 光 前向角：激光检测区正向收集的小角度散射光。 与细胞的大小和细胞表面光滑度有关。
临床检验诊断学研究生课程
流式细胞术
检验科
参考书
实用流式细胞术
北京大学医学部出版社 刘艳荣 主编
临床流式细胞分析
上海科学技术出版社 王建中 主编
教学目的
掌握流式细胞术的基本工作原理
熟悉流式细胞术的临床及科研应用 了解流式细胞术的质量控制
流式细胞术定义
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞 理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。
域，对其中的细胞进行单参数或多参数分析。
门的形状：线性门、矩形门、圆形门、多边形
门、任意形状门和四象限门
分析
单参数分析 多参数分析 二维散点图 二维等高图 假三维图 三维图 多参数组合分析
单参数分析
Events：分析区域内的细胞数
M2 M1
%gate：门内细胞百分比
%total：检测细胞总数百分比
膜表面抗原染色-溶血-洗涤-透膜与固定（透膜 剂使用参照说明书）-细胞内抗原染色-洗涤-上 机检测
细胞内细胞因子检测
原理：通过细胞内蛋白分泌物抑制剂，阻断细
胞内高尔基体介导的蛋白质转运，使细胞因子
积聚在细胞浆中，增强了细胞因子信号。
刺激培养（刺激剂+阻断剂）-细胞表面抗原
染色-固定和破膜-细胞内细胞因子染色-洗涤-
散射光强，细胞大；反之，细胞小。
临床应用
淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞功能分析 血液病免疫分型 肿瘤耐药基因筛查 免疫缺陷病 自身免疫病 器官移植
流式细胞仪与显微镜的区别
区别 流式细胞仪 显微镜
光源
对象 承载工具 检测信号 放大方式
激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路
肝素常用于白细胞功能研究，其可以更好的维 持细胞活性，放置更长时间，但是不适合血小
板的相关检测
2. 荧光染色
免疫荧光染色
细胞表面抗原标记
细胞内或核内抗原标记
细胞内细胞因子测定
细胞周期和DNA分析—应用比较少
细胞表面抗原标记
染色-溶血-洗涤-上机检测
细胞内或核内抗原标记
透膜剂的选择
结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速
测量并可分类收集的高科技产品。
流式细胞仪常检测的细胞特性
细胞组成 大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核--特异性PH值, 膜电位 酶活性
基本工作原理
流式细胞仪的结构组成
荧光补偿的调节
荧光补偿
除去某一荧光素误入另一荧光通道的发射光信
号
荧光素的特性：某一种荧光素被任何通道上检
测的荧光信号的比值（如FITC被FL1和FL2检
测到的值）是恒定不变的。
4. 数据分析与报告
数据分析过程中，设门对于数据分析至关重要
某一抗原差异表达的细胞群 错表达细胞群
设门
设门：在细胞分布图中指定一个范围或一片区
实验技巧的掌握（刺激培养？膜分子丢失？破
膜？）
实验突发事件的处理能力（实验原理的掌握）
数据的处理与分析（百分数？荧光强度？凋亡 ？）
试验后 数据的处理与分析（***）
开始试验
1. 标本制备
外周血、采集物或骨髓：肝素或EDTA抗凝
组织细胞：单细胞悬液（机械法）
培养细胞：
体液：肝素抗凝
抗凝剂的选择
常用抗凝剂：EDTA、肝素、ACD
EDTA：同时可进行白细胞计数与分类，标本 48h内是稳定的； 肝素：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态
学观察
ACD：标本72h内是稳定的；试验前要进行形态
学观察
骨髓标本优先选择肝素抗凝 EDTA适用于白细胞免疫分型分析，可以防止 成熟的髓系细胞贴壁造成细胞损失，且具有较 强的抗血小板凝集的能力；缺点：fsc特征丢 失较快
上机检测
荧光信号检测-荧光抗体组合
荧光信号强弱： PE>APC>PE-Cy5>PerCp-Cy5.5>FITC>PerCp
如何选择荧光抗体
荧光素的荧光强度
荧光素标记效率：
抗体检测抗原的密度：
自发荧光：自发荧光水平高的细胞，应使用
发射波长较长的荧光染料
（APC）
如何选择荧光抗体
非特异性结合
从基因水平进行验证？ 从蛋白水平进行验证？ 从细胞水平进行验证？ 功能研究？
复习题
流式细胞仪的分析检测原理是什么？
何谓荧光补偿？
FCM分析中有哪些数据显示方式，如何解
读结果及其设门分析的意义？
流式细胞术有哪些临床应用价值？
激光及光束形成系统
液流系统
光信号收集系统
电子系统
数据的存储、显示与分析系统
流式细胞术检测的几个重要过程
试验前
实验目的与方法的选择 实验流程的熟悉（说明书） 标本的收集与保存 荧光抗体的选择与染色（是否需要同型对照？
空白对照？阴性对照？阳性对照？）
试验中
标本的处理
流式细胞术特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞 器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通
过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信
号对细胞进行定量分析或纯化分选。
流式细胞仪
是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分
析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起
来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部
自然光、灯光
细胞、组织等 载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大
统计
结果
计算机，>5000
多参数，综合分析
人工，200
简单，单参数
科研设计
研究目的明确 研究方法清晰 研究指标明了 研究结果预测 科研论文写作 实验前 框架 实验中 填补数据，图表 试验后 讨论
为什么要做流式细胞