流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤
流式细胞术及其应用(1)
血小板检测指标：
质膜糖蛋白：CD41/CD61（gpⅡb/Ⅲa）、
CD42b(GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ)
颗粒膜糖蛋白：CD62P、CD63、TSP。
活化：gpⅡb/Ⅲa复合物—活化早期标志物
CD62P—活化后期的表面标志
血小ห้องสมุดไป่ตู้抗体（PAIgG）。
网织血小板计数：常用染料为TO。
应用 血小板无力症诊断：
而现代流式细胞术，更是由于结合 了单克隆抗体技术、定量细胞化学和定 量荧光细胞化学的应用，使其在生物学、 临床医学、药物学等众多研究领域的应 用将会越来越广泛。
五、流式样品的制备中应注意的几个问题
㈠荧光素和抗体的选择
⒈荧光素的选择：现在国内引进的大多数流式 细胞仪只装有一个激光光源，即488nm光源，所以 我们在选择荧光素时要选择能被488nm激光激发的 荧光素，常用的荧光素有：
选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光
在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打
彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3％的小牛血清
一、 流式细胞术的概念
流式细胞术（FCM）就是对在高速 流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分 析和分选的技术，这种细胞或粒子是经 过特异荧光标记的。其特点是测量速度 快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞， 且可进行多参数测量，另一特点是在分 析的同时可把具有指定特征的细胞分离 出来，这就是分选技术。
FCM(Flow Cytomytry 流式细胞术)
流式样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题
原因
解决对策
细胞密度低 制备过程中细胞损失 增加离心时间、吸弃上清
非特异荧光强 碎片多
细胞聚集
荧光弱
FCM技术
流式细胞分析（FCM）技术概述一、概述流式细胞分析（FCM）技术是诊断病理学的一项重要辅助诊断技术，一般用于组织病理学初步诊断后的进一步分析，应用日益广泛。
1．流式细胞分析技术主要用于肿瘤细胞的①免疫表型分析；②DNA含量分析；③非二倍体细胞定量分析；④细胞增殖活性分析等。
2．制备合格的检测样本是流式细胞分析技术的关键。
3．对样本进行荧光染色或免疫荧光染色流式细胞分析技术检测时，必须同时设立同型抗体对照、阳性对照和自发荧光对照。
4．流式细胞分析技术在淋巴造血组织肿瘤等的病理学诊断中正在成为评估预后和指导治疗的指标，有时可作为独立的病理学诊断报告项目。
5．流式细胞分析报告的内容为由流式细胞仪打印的原始检测结果。
作为病理学诊断报告书组成部分的流式细胞分析报告须经有关病理医师审核后签发，必要时可由病理医师对检测结果作出评论。
二、单细胞悬液的制备（一）新鲜实体瘤单细胞悬液的制备1．酶消化法（1）选取的组织立即放入预冷的组织培养液或生理盐水中，清洗血迹及其他污染物。
（2）解剖显微镜下弃除组织块中的坏死成分、纤维、脂肪以及血管等。
（3）用弯剪将组织块剪成约1.0mm3左右的小块，放在冷组织培养液或生理盐水中。
（4）用冷培养液或生理盐水漂洗剪碎的组织块，洗去被剪碎的细胞碎片。
（5）取约1.0g组织加入适宜的酶消化液。
（6）在37℃的恒温水浴中消化20～30min，消化期间要间断振荡或吹打。
（7）用冷培养液或生理盐水终止消化，收集单细胞悬液。
（8）先后用200目的筛网和350目的尼龙网过滤除去凝聚的细胞团块，收集细胞并计数，总量不少于106个。
根据检测目的作进一步测试。
如做DNA含量分析，须将细胞悬液用70%冰冷乙醇固定，置4℃冰箱保存；如做免疫荧光分析，则不必用乙醇固定。
2．机械法（1）剪碎法①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水或0.01mol/L（pH7.4）的PBS液；②用剪刀将组织剪至匀浆状；③加入0.01mol/LPBS10ml；④用吸管吸取组织匀浆，先以200目的筛网过滤至试管内；⑤离心沉淀（1500r/min，3～5min），再用PBS洗3次，每次离心（500～800r/min）5～8min，除去细胞碎片；⑥以350目的尼龙网过滤，除去凝聚的细胞团块。
FCM流式细胞术检测原理及临床应用
流式细胞术的临床应用
● 临床免疫学 ● 临床血液学 ● 临床肿瘤学 ● 血栓与止血 ● 骨髓和器官移植 ● 基础医学研究
FCM在临床免疫学中的应用
(1) 淋巴细胞亚群分析 ● T细胞： CD3+ CD4+ (Th) CD8+ (Ts/Tc) ● B细胞： CD19+ ● NK细胞： CD3- CD16+ CD56+
3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。
通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析 存储、显示。 具有智能化、自动化特点。
Principle of Flow Cytometry
Alive or fixed cells in single cells suspension
Sheath fluid
Computer for data analysis and result display
免疫荧光标记
直接免疫荧光染色法：选用荧光标记的McAb 是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗 体,如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗 CD8-PeCy5抗体。
间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相 应抗原结合后，再用荧光素标记的第二抗体进 行染色。
? CD8+: Tc1: CD8+ IFN-r + Tc2: CD8+ IL4 + Tc0: CD8+ IFN-r+ IL4+
成。
激光是较常用的光源, 稳定性好、单色性好。
检测信号： 散射光和荧光信号被收集、处理、 转化为数字信号。
Fluorescence signals
Focused lid
FCM检测信号
散射光信号 前向散射光 （foword scatter, FS ）：在激光束正前 方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属 性，如大小、形状等。反映 细胞颗粒的大小 。 侧向散射光 （side scatter ， SS）：与激光束垂直方 向的检测器为侧向检测器，主要用于 检测细胞内部结 构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。 反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。 荧光信号 (反映被染上荧光的细胞数量多少）
流式细胞术简介
流式细胞术简介一、流式细胞术发展简史流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。
其特点是：①测量速度快，最快可在1秒钟内计测数万个细胞；②可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量，并具有明显的统计学意义；③是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果；④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。
FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。
1953年Crosland -Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。
于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。
这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。
1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。
其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。
1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。
1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
第三节 流式细胞术的临床应用
白血病免疫分型 HLA-B27: 强直性脊柱炎 淋巴细胞亚群 造血干细胞计数：造血干细胞移植 网织红细胞 PNH诊断（CD55、CD59） 血小板活化试验
流式细胞白血病免疫分型
流式细胞的免疫分型
是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 适合于白血病的分型诊断，但不适合用 于确诊是不是白血病。 Minimal residual diseases (MRD)
阳性对照：检测阴性时
空白对照和阴性对照的比较：
实验标本的处理
单细胞悬液的制备：胰酶消化 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体
流式检测应用实例
凋亡 细胞内分子检测
凋亡检测-每一步都有检测试剂盒
细胞周期
G2
M
S
G1
G0 Quiescent cells
5）网织红细胞计数 6）白细胞分类计数
第七节 其他应用
溶液中细胞因子的测量: 利用吸附有特异性抗体的微球，与溶液 中的细胞因子结合，而检测溶液中是否 存在该种因子 HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。
第八节 细胞分选
FCM可将样本中所需要的细胞亚群从群体细胞 中分离出来，即所谓分选(Sorting)。被测细胞 的任何参数均可作为分选的依据。分选的方式 一般有静电分选和捕获管分选，分选方式不同 则决定分选的速度，分选纯度一般可达99%以 上。除细胞分选外还可进行染色体分选。 分选的细胞可用于克隆化培养、原位杂交、 分子生物学研究等。从孕妇外周血中分离富集 胎儿有核红细胞用于产前诊断，染色体分选可 用于基因诊断。
SORTING（细胞分选）
DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response
流式细胞术实验报告
一、实验目的本实验旨在通过流式细胞术技术，对细胞群体进行快速、精确的分析和定量测定，研究细胞的物理与化学性质，并对细胞进行分类和分选。
通过本次实验，掌握流式细胞仪的工作原理，了解其在细胞生物学研究中的应用。
二、实验原理流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒逐个进行快速定量分析和分选的技术。
其基本原理是将经过荧光标记的细胞或微粒，在流动系统中以高速通过，同时利用激光束照射细胞，通过光散射和荧光信号来获取细胞的大小、形态、表面标记物等信息。
最后，通过数据分析和可视化展示，对细胞进行计数、分类和分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 细胞样本：小鼠脾细胞、Jurkat细胞- 荧光标记抗体：CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC- 溶液：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、荧光染料（如PI）2. 实验仪器：- 流式细胞仪（如BD FACS Calibur）- 离心机- 恒温培养箱- 移液器四、实验步骤1. 细胞制备：- 收集小鼠脾细胞或Jurkat细胞，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×10^6个/mL。
- 加入荧光标记抗体，室温下孵育30分钟。
- 用PBS洗涤细胞两次，去除未结合的抗体。
2. 流式细胞术分析：- 将处理好的细胞加入流式细胞仪，设置合适的参数进行检测。
- 收集数据，进行细胞分类和分析。
3. 数据分析：- 利用流式细胞术分析软件（如CellQuest、FlowJo）对数据进行分析，包括细胞计数、分类、DNA含量分析等。
五、实验结果与分析1. 细胞分类：- 通过流式细胞术，成功将小鼠脾细胞和Jurkat细胞分为不同的亚群，如T细胞、B细胞等。
2. DNA含量分析：- 通过PI染色，检测细胞的DNA含量，发现小鼠脾细胞和Jurkat细胞均处于G0/G1期。
3. 表面标记物分析：- 通过CD45-FITC、CD3-PE、CD4-APC抗体检测，发现Jurkat细胞为T细胞，小鼠脾细胞中含有B细胞和T细胞。
fcm测定法
FCM测定法1. 引言FCM（Flow Cytometry）测定法是一种基于流式细胞仪的技术，用于对细胞进行多参数分析和定量测量。
该方法通过检测细胞在流式细胞仪中通过时的光散射和荧光信号来获得关于细胞特性的信息。
在生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域，FCM测定法被广泛应用。
本文将介绍FCM测定法的原理、仪器设备、操作步骤以及应用领域。
2. 原理FCM测定法基于细胞在流式细胞仪中通过时的光散射和荧光信号。
当细胞通过流式细胞仪时，细胞会被单个聚焦的激光束照射，并同时测量细胞的散射光和荧光信号。
根据散射光的特性，可以将细胞分为前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）。
FSC与细胞的大小成正比，SSC与细胞的复杂度和颗粒物的数量成正比。
通过测量FSC和SSC，可以初步分析细胞的大小和复杂度。
荧光信号的测量则依赖于细胞的特定标记物。
通过给细胞标记荧光染料，可以测量特定标记物的荧光强度，从而获得关于细胞表面分子、内部结构和功能的信息。
3. 仪器设备3.1 流式细胞仪流式细胞仪是进行FCM测定的关键设备。
它由激光器、光学系统、流体系统和数据分析系统组成。
激光器产生单色或多色激光束，通常使用氩离子激光器、固态激光器或半导体激光器。
光学系统包括透镜、滤光片和光电二极管。
透镜用于聚焦激光束，滤光片用于选择特定波长的荧光信号，光电二极管用于转换光信号为电信号。
流体系统用于将细胞悬浮液输送到流式细胞仪中，并控制细胞通过的速度和流量。
数据分析系统用于采集和分析细胞的光散射和荧光信号。
通常使用计算机软件进行数据处理和结果展示。
3.2 标记物在FCM测定中，常用的标记物包括荧光染料和荧光标记的抗体。
荧光染料可以直接与细胞结构或分子结合，荧光标记的抗体则可以特异性地识别细胞表面的分子。
常用的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、罗丹明（Rhodamine）、FITC （Fluorescein Isothiocyanate）等。
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流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤
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流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，•它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。
它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。
在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。
国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。
流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。
B-D•公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。
BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。
EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA
和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，•多用于科学研究。
二.流式细胞仪主要技术指标
1．流式细胞仪的分析速度：
一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。
2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。
4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统
流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。
流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。
流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息
准确无误。
见图12.1流动室示意图。
流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。
小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。
图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide)
四. 流式细胞仪主要构造和工作原理激光光源及光束形成系统
流式细胞仪可配备一根或多根激光管，常用的激光管是氩离子气体激光管，它的发射光波长488ηm，此外可配备氦氖离子气体激光管（波长633ηm）和/或紫外激光管。
流式细胞仪的主要测定信号荧光是由激发光激发的，荧光信号的强弱与激发光的强度和照射时间相关，激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度、高稳定性的光照，正是能达到这一要求的理想的激发光光源。
在激光光源和流动室之间有两个圆柱形透镜，将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束(22μm×66μm)，在这种椭圆形激光光斑内激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致。