流式细胞术质量控制
(完整版)精准检验对流式细胞术的发展和质量控制要求
精准检验对流式细胞术发展和质量控制需求盛慧明2016年11月11日一、流式细胞术发展历史和现状二、流式细胞术的最新进展三、BEAMing技术四、流式细胞术的质量控制一、流式细胞术发展历史和现状二、流式细胞术的最新进展三、BEAMing技术四、流式细胞术的质量控制一、流式细胞术发展历史和现状流式细胞术Flow Cytometry现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代，源于对细胞进行分选，所以最早是Fluorescence-activated cell sorting ，FACS；最早的omic 经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟并不断推陈出新，广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面；是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术；流式细胞术技术平台涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
流式细胞术完成FCM计数的主要历程◆1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于细胞的计数;◆1934年,Moldaven 是世界上最早通过光电仪记录细胞数量;◆1940年,Coons 提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白;◆1953年,Croslannd Taylor 应用分层鞘流原理,奠定了流式细胞术的液流技术基础;◆1956年,Coulter 生产了Coulter细胞颗粒计数器;◆1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;◆1967年, Holm 等设计了汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电设备计数的装置;◆1973年, Steinkmp设计了利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，达到计数和分选的装置.流式细胞术完成数据采集和分析技术整合◆1965年，Kamentsky开拓性的提出两大设想：:(1) 用分光光度计定量细胞成分; (2)结合测量值对细胞进行分类;◆1969年,Van Dilla 和美国的Los Alamos小组研制出液流束、光路轴、检测系统光轴三者相互正交的第一台流式细胞计数器；◆1972年, Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;◆1973年，与Stanford University合作开发世界上第一台商用流式细胞仪FACSI.Kamentsky Herzenberg流式细胞仪的基本构造流式细胞采用的抗体常用荧光素：•FITC,激发光488nm 发射光525nm；•PE,激发光488nm 发射光575nm;•PE-Cy5,激发光488nm 发射光667nm;•PE-Cy7,激发光488nm 发射光767nm。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
6流式细胞术的质量控制和影响因素
DNA倍体的标准是根据正常二倍体细胞 DNA含量的分布范围而确定的，对于二 倍体的标准的选择，应遵照如下原则：
◆采用同个体同源正常组织。
◆同种固定方法。
◆相同的样品处理方法。
◆同样的染色方法 , 同步染色。 ◆同样的仪器检测条件。
⒈ 温度对荧光染色强度的影响：
在一般情况下，环境温度的升高对荧 光染色有明显的影响。温度升高可造成溶 液粘滞性增加，溶剂和荧光染料分子的动 力增大，这就使荧光分子和其他分子之间 的相互碰撞几率增加，使荧光猝灭的可能 性增加。因此，影响了荧光分子发光量子 产额
温度升高时，荧光减弱，荧光减弱的
百分比称温度系数。就一般荧光物质而言， 温度系数大约为1%，如果温度在20℃时， 一般荧光染料即出现温度猝灭效应，随温 度的升高，荧光猝灭作用越强，以致造成 完全猝灭，温度在20℃以下，荧光分子发 光量子产额的变化不明显，基本上保持恒 量。因此在荧光测定时要保持染色后的样 品在适当低温环境下运行，尽可能减少样 品的照射时间，有条件时应使样品观察室 做到恒温装置，会得到更好的荧光定量结 果
例如细胞DNA的分析，使用醇类固 定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固 定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。 实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染 料与核酸的结合有很强的干扰作用，其 荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的 50-70%左右。
如果作流式免疫研究工作，采用新
鲜组织是最好的选择。在不能及时检测 又没有低温保存条件时，要根据所测物 质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表 面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽 管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强， 但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂 可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢 失，失去标记的位点。
石蜡包埋组织标本的材料选择，应经 病理医师仔细检查，选取无自溶，坏死 的组织对肿瘤组织标本，选取含肿瘤组 织细胞丰富的区域，且经病理形态或细 胞学核实病理诊断
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制一、引言流式细胞术是一种重要的细胞分析技术，可以用于细胞计数、细胞表型分析和细胞排序等。
在进行流式细胞术之前，进行质量控制是非常重要的，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术的质量控制方法。
二、仪器校准⒈流式细胞仪校准●清洁流式细胞仪的样品室，并检查激光器和光路系统是否正常工作。
●使用粒子标准物质检查细胞仪的散射、荧光和时间参数的准确性。
●清洗和校准流式细胞仪的液体系统，确保流速和样本量的准确控制。
⒉样品准备●均匀悬浮细胞样本，避免细胞团聚和沉积。
可通过离心和重新悬浮样本来实现。
●使用质量可靠的细胞染色方法，确保染色的准确性和一致性。
●调整样本的浓度，以避免过度聚焦和细胞过于稀疏而损失信号。
三、质量控制指标⒈样本纯度的质量控制●使用合适的负对照和正对照来评估染色的纯度。
例如，使用未染色细胞作为负对照，使用已知阳性标记的细胞作为正对照。
●定期检查染色结果的一致性，确保负对照细胞没有阳性标记，正对照细胞有预期的阳性标记。
⒉流式细胞仪性能的质量控制●定期检查流式细胞仪的性能参数，包括散射灵敏度、荧光检测灵敏度和时间分辨率。
●使用校准颗粒检验流速的准确性和一致性。
●根据实验需要，使用合适的质检颗粒进行分辨率和强度的调整。
四、数据分析和结果解释⒈数据质量控制●检查数据文件的完整性，确保数据文件包含所有需要的参数和样本。
●清除实验过程中的噪声信号和非特异性染色的细胞。
●根据预设的阈值和门控策略进行数据清洗和筛选。
⒉数据解释和结果报告●根据实验的目的和结果，选择合适的数据可视化方法，如频率直方图、散点图或密度图等。
●在报告中注明样本总数、阳性细胞比例、细胞亚群的比例等相关指标。
●提供结果的解释和分析，例如细胞表型的变化趋势、不同实验组间的比较等。
五、附件附件1、样本染色方案附件2、流式细胞仪校准记录表附件3、数据分析结果表格六、法律名词及注释⒈ IRB：Institutional Review Board，即伦理审查委员会，负责审查人体试验和研究项目的合法性和伦理性问题。
流式细胞分选技术的质量控制
理论与方法252 2015年24期流式细胞分选技术的质量控制汪艳胡锐刘伟乔志仙李婷婷中国科学院水生生物研究所，湖北武汉 430072摘要：越来越多科研者利用流式分选技术进行分选染色体、纯化细胞株、单细胞克隆、分选干细胞等稀有细胞或细胞富集，将获取细胞主要用于细胞基因、蛋白、功能水平的研究，为了保证分选的细胞直接用于培养、移植、核酸提取、单细胞PCR 扩增或原位杂交等后续实验，我们有必要考虑分选细胞的生物学活性、回收率、纯度等相关分选指标。
实际上，流式细胞仪在分选细胞过程中，通常受到细胞本身状态、仪器性能、操作者等多种因素的干扰，无法获取流式细胞仪理想的分选参数值，即高速、高纯度、高活性、高得率，这些参数往往是相互制约，不能同时满足，需要考虑和平衡实验目的侧重选择。
我们将从流式分选术影响因素来阐述分选的质控。
关键词：流式细胞仪；细胞分选；质量控制中图分类号：TN24 文献标识码：A 文章编号：1671-5780(2015)24-0252-02流式细胞术（flow cytometer）利用流式细胞仪对快速流动的状态的单个细胞或生物颗粒进行多参数、高通量、高速分析和分选的一门技术[1]。
随着单克隆抗体和流式细胞仪研制整体水平的发展，分选型流式细胞仪的性能逐步完善，特别是分选功能智能化、高速化、高精度，流式细胞分选技术真正实现自动监控技术，复杂的分选技术简单化[2，3]。
因而，许多科研者利用流式分选技术进行深层次单细胞水平研究，如分选染色体、纯化细胞株、单细胞克隆、分选干细胞等稀有细胞或细胞富集等[4，5，6]。
实际上，流式细胞仪在分选细胞过程中，通常受到细胞本身状态、仪器性能、操作者等多种因素的干扰，无法获取流式细胞仪理想的分选参数值，即高速、高纯度、高活性、高得率，这些参数往往是相互制约，不能同时满足，需要考虑和平衡实验目的侧重选择。
我们将从流式分选术影响因素来阐述分选的质控。
1 样本质控流式细胞仪分析和分选样本必须制备成单细胞悬液，来源不同的样本如细胞、组织、外周血、骨髓等，必须经过一系列消化、离心、染色等步骤进行前处理，在一定程度上影响细胞的活性状态，其中染色过程对细胞活性有极大的损伤[7，8]。
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术（Flow cytometry）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的细胞分析技术。
它通过利用光传感器和激光来检测细胞悬浮液中的细胞数量、大小、形态和表面标记物等信息，从而实现对细胞的分析和分类。
为了保障流式细胞术的准确性和可重复性，质量控制是非常重要的。
样本制备的质量控制在进行流式细胞术之前，样本制备是流式细胞术质量控制的第一步。
样本质量对于结果的准确性和可重复性至关重要。
以下是一些常见的样本制备质量控制步骤：细胞样品准备细胞浓度的准确计数：使用细胞计数仪准确计数细胞数目，以确保每个样本含有足够数量的细胞进行分析。
细胞的适当处理：根据不同实验要求，对细胞进行适当的处理，如洗涤、培养基的选择等，以确保细胞状态的一致性。
样品标记物的质量控制标记物的选择：根据实验需要，选择合适的标记物，并确保其特异性、亲和力和荧光强度等符合要求。
样品标记物的浓度和时间：对于标记物的浓度和反应时间进行优化，避免过高或过低的浓度导致信号失真或信号强度不足。
流式细胞仪的质量控制流式细胞仪作为流式细胞术的核心仪器，其性能的稳定和准确也是流式细胞术质量控制的关键。
以下是常见的流式细胞仪质量控制步骤：光谱校正与补偿荧光信号校正：使用校正颗粒进行荧光信号校正，校正光谱重叠和荧光强度的变化，以提高结果的准确性。
荧光信号补偿：通过对不同通道之间的荧光信号进行补偿，避免荧光信号之间的交叉干扰，确保结果的准确性。
流速标定流速标定：使用标定颗粒进行流速标定，保证流速的准确性，以便对细胞进行准确的定位和计数。
指标质量控制正质量控制：使用已知正样本进行实验，确保仪器的稳定性和结果的准确性。
负质量控制：使用未标记的负样本进行实验，排除背景信号和非特异性结合，保证结果的准确性。
识别和排除异物：通过故障检查和核查流式细胞术结果，识别和排除可能存在的污染源和异常情况。
数据分析的质量控制流式细胞术之后，对数据的准确分析和解读也是质量控制的重要环节。
流式细胞术质量控制
流式细胞术质量控制2010-01-08 14:04:03流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
白血病微小残留检测及其质量控制(流式细胞术)
2. 流式细胞术是直接进行定量，更为精确；而PCR是根据 产物的量进行推算。
3. 流式细胞术检测时可以区别活细胞和经化疗将要死亡的 细胞以及死亡细胞的碎片（而这些死亡的细胞以及细胞 碎片在PCR检测中都可能形成阳性信号）。
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Fluorescent Standard
Obtain Results
Troubleshoot Maintenance
Color Compensation
Generate Report
FAIL
Process/ Method Control
PASS
Test Reimbursement
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
Elaine Coustan-Smith, etal. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2000, 96(8):2691-2696
流式细胞术检测白血病MRD原理
利用抗原表达的差异，以直观的方式区分白血病 细胞和正常的骨髓细胞（正常生理状态下和骨髓重建期）
跨系表达的抗原 质的差异 时相混乱的抗原 与染色体异常相关的抗原 抗原表达量异常高 量的差异 抗原表达量异常低
上 海 市 临 床 检 验 中 心
Shanghai Centre for Clinical Laboratory
差异
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流式细胞术质量控制流式细胞术（flow cytometry,FCM）越来越广泛的应用在临床检验中。
由于临床检验本身的性质，它要求临床检验的管理者和操作人员必须把好常规操作已经结果分析的质量关。
同时还必须懂得如何判断分是在控还是失控。
作为临床检验工作，其工作的质量标准就是使检验的结果最佳地符合病人有无病变的实际情况。
在临床检验中分为分析前、分析中、分析后的质量控制。
分析前的质量控制主要内容是标本采集、保存和传送等；分析中的质量控制即实验操作过程的控制；分析后的质量控制主要是对数据结果的处理，对检验结果的可信度评价和及时将报告送给临床并听取反馈意见。
为此，从临床医师开出化验单，，直至拿到检验报告的整个过程都在质量控制的范畴之中，即所谓全程质量控制。
它包括质量保证、质量控制和质量评估。
质量保证，指围绕所有的步骤，监测和评估实验室规章制度与操作流程的效力。
主要利用质量控制和质量评估。
质量控制指建立一套完善的实验室监控方法，保证结果的可靠性，提高准确度、精密度、重复性和室间结果的可比性。
对于一个实验，应建立一套包括各种可变因素（仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等）的操作规程。
质量评估是由一个区域性的、国家的或国际性的机构，组织通过一系列的方法来比较实验室内或不同实验室之间的结果而建立的一套评价系统。
其主要目的是建立室间和仪器设备之间的可比性。
当一个标准品或参考标准存在时，质量评估通常被称为熟练度测试。
因此，严格的质量控制是先进的临床检验分析技术真正发挥作用的保证。
FCM作为一项先进的检测技术，对质量控制自然也不例外。
目前，FCM应用于临床检验的项目主要集中在几个方面：1，免疫表型分析，包括外周血淋巴细胞表型分析、白血病/淋巴瘤免疫分型、血小板膜糖蛋白分析、HLA-B27检测、阵发性血红蛋白尿（PNH）的检测等等。
2，细胞DNA、RNA检测及细胞周期分析，包括DNA倍体检测、细胞周期分析、网织红细胞检测、网织血小板检测等等。
3，定量分析，包括爱滋病划分中外周血CD4的绝对定量、OKT3治疗监测中CD3的绝对定量、干细胞移植中的CD34的定量等等。
FCM实验的质量控制自然也包括仪器设备、样本处理、试剂、操作过程、数据分析等整个实验过程的质控。
一、流式细胞仪的校准流式细胞仪的校准包括流路的稳定性、光路的稳定性、多色标记荧光颜色补偿、光电倍增管转换的线性和稳定性。
对仪器的校准主要是利用标准微球进行监测。
聚苯乙烯可以被做成各种大小的微球，也可被荧光标记或者拥有定量免疫球蛋白的结合位点。
这种制成固定荧光强度、大小和光散射性的聚苯乙烯微球，已成为流式质控中的一个常用的标准品。
BECKMAN COULTER公司拥有仪器校准所需全部标准微球（见表一）。
另外，在颜色补偿方面，BECKMAN COULTER公司的流式细胞仪除了可以用标准补偿试剂来完成外，还可以直接利用生物样品进行自动颜色补偿，这使多色标记变得非常容易。
BECKMAN COULTER公司的流式细胞仪所带的全程质控软件，使日常仪器性能的质控以及质量控制评估都可自动完成。
二、实验操作过程的质控（一）样本的质量控制用于流式分析的样本种类很多，包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜（内窥镜活检物）、细针穿刺物等等。
样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。
每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。
首先，观测样本外观：有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。
第二，单细胞悬液的获取：外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液；活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。
不同的实验要求适用不同的方法。
对于需要进行膜抗原标记的，不仅是要获得足够的单细胞悬液，还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性，机械法较适用。
只需进行细胞周期或DNA倍体分析的，在机械法的基础上加酶消化（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）较适用。
第三，抗凝剂的选择：外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。
如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析，则应用EDTA抗凝；对于血小板分析的实验，一般不用肝素抗凝。
骨髓穿刺液常用肝素或EDTA 抗凝。
由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题，通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。
第四，样本的保存：理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。
肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温（16-25）；EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温（16-25）；ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温（16-25）；对于只作胞内染色的样本，可固定细胞以长期保存。
但此“固定－染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。
第五，去除红细胞的方法：红细胞裂解法，操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。
最好在染色后溶血。
若在染色前溶血，需确认：1)抗原性不被溶血过程改变；2)溶血剂被彻底洗去，细胞和抗体结合的动力反应未受影响；3)所用溶血剂不含固定剂，否则会影响细胞活性及表面标记结果。
密度梯度离心法，靶细胞回收较好并可能得到富集，同时去除红细胞、碎片等，但费时，某些重要细胞群体可能被选择性丢失。
第六，细胞与抗体的比例：厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X105 ~1x106范围内。
有些标本没有足够的细胞，有些则由于细胞量大，正常浓度下的抗体相对过量或不足，导致假阳性或假阴性结果。
因此，每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法，调整细胞与抗体用量，得到最适的细胞/抗体比例。
第七，细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过了长时间运输和储存的样本。
检测的方法通常有两种：1）实时的流式检测：利用荧光染料碘化吡啶（PI）、7氨基放线菌素D（7-AAD）或EMA（ethidium monoacide）进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。
此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。
尤其适用于高度坏死的样本。
7-AAD 最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC 或PE进行多色标记。
但随着时间延长，7AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。
因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。
EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好地区分固定前的死活状态。
2）手工检测：使用Trypan blue 或其他细胞活性染料。
3)使用专门的仪器进行检测。
如Vi-cell.（二）、选择和确定单抗组合流式分析最基本的试剂就是抗体。
所选抗体的好坏直接影响结果。
影响抗体特性的因素很多，如F/P比值、亚型、全长或片段、种宿来源、标记荧光种类等等。
而且，有CD分类号的300多种单抗和大量没有CD分类号的单抗使抗体的选择更加困难。
一般，选择抗体组合遵循以下基本原则：1）所选的抗体组合应足够宽，可以鉴别样本中的所有细胞亚群包括正常和异常群体。
2）对表达少的抗原应尽可能选择荧光强度强的荧光素标记。
3）了解不同抗体的细胞反应谱，以及染色模式。
根据不同的实验目的选择抗体。
因为相同CD编号的抗体可能识别不同的抗原决定簇。
4）抗体的多种组合可能相互影响与抗原的结合（如通过空间构型的阻碍），所以对所用抗体组合，应先了解每个抗体在对照细胞上单色标记的表达情况。
5）对于临床实验尽量选择体外诊断（IVD）试剂和分析特异性（ASR）试剂，而仅供研究用（RUO）试剂一般不能用于体外诊断实验。
在我国，用于体外诊断的试剂还必须取得国内的SDA 认证。
这样，一个抗体组合内的抗体可能来源不同的公司，有不同的浓度、不同的亚型、不同F/P值，可能均需要自身的同型对照，而实际上，这是非常困难的。
那么，尽量选择同一家公司的试剂可以减少上述的干扰。
对于临床上常见的流式检测项目，所需的试剂组合基本都有参考或推荐的抗体组合。
如，T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。
但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。
在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。
75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。
淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。
对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。
其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。
几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。
但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。
大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。
抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。
对这一些，一些商业化的公司对常用单抗的检验均推出了一系列质控物。
如BECKMAN COULTER公司的Cyto-Trol、Immuno-Trol等（见表一）。
（三）染色方法细胞表面染色：大多数免疫表型分析均采用此方法。
但由于许多抗原也同时存在细胞内，所以在细胞表面抗原检测时应特别注意保持细胞膜的完整以保证检测的特异性。
表面标记又分溶血前标记和溶血后标记。
若红细胞对标记有影响或血浆成分对标记有影响的，适合溶血后标记，但要注意溶血剂膜抗原的影响，所以，溶血剂一般不含固定剂。
如免疫球蛋白轻链检测和阵发性血红蛋白尿的检测等。
细胞内染色：有些胞内抗原的检测对白血病的免疫分型尤为重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD79a 。
胞内染色的关键是使细胞膜通透，把抗体或核酸染料导入胞内而不影响细胞骨架的完整性。
还要保证固定和透膜的步骤不影响有关抗原与相应抗体的结合力和核酸与染料的结合。
某些适用于胞内染色的试剂可能不适于表面标记分析。
通常胞内染色不能与细胞活性的检测同时进行，除非用EMA的方法。
对于胞内染色，所用的荧光素应足够小到能穿透到胞膜内。
对于某些核酸染料（如DAPI、TO、AO等）为活细胞染料，无需固定或透膜。
胞膜和胞内染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞内染色，最后是DNA染色。