流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术是一种在液流中快速检测和分析细胞特性的技术，广泛应用于医学、生物技术、免疫学等领域。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，必须实施严格的质量控制措施。
本文将探讨流式细胞术的质量控制。
1、样本制备的质量控制样本制备是流式细胞术的关键步骤之一，包括细胞样本的收集、处理和标记。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）样本的收集和保存：应尽可能缩短样本采集到分析的时间，避免细胞状态的改变。
对于血液样本，应使用肝素抗凝，避免细胞聚集。
（2）细胞的分离和洗涤：应根据实验需求，采用合适的分离方法（如密度梯度离心法、贴壁培养法等）对细胞进行分离。
在洗涤过程中，应使用无菌、无内毒素的缓冲液洗涤细胞，去除杂质和死细胞。
（3）抗体标记：选择高质量的抗体，并遵循制造商的建议进行标记。
应避免抗体非特异性结合，确保标记的特异性和敏感性。
2、仪器设备的质量控制流式细胞仪是流式细胞术的核心设备。
为确保实验结果的准确性，应对仪器进行定期校准和维护。
具体措施包括：（1）校准激光功率：定期使用标准样本对激光功率进行校准，确保光路准直，提高光散射数据的准确性。
（2）清洗流动室：定期清洗流动室，防止样品残留物堵塞喷嘴，影响流速稳定性。
（3）校准光电倍增管：使用标准样本校准光电倍增管，确保光电倍增管输出的线性范围。
3、数据分析的质量控制数据分析是流式细胞术的关键步骤之一，包括数据的获取、处理和解析。
在此过程中，应遵循标准化操作流程，并注意以下几点：（1）数据获取：设置合适的参数和门控，确保获取最佳的数据。
（2）数据预处理：去除噪声和无效数据，进行数据归一化处理，提高数据质量。
（3）数据分析：选择合适的数据分析方法（如聚类分析、主成分分析等），对数据进行深入挖掘。
同时，应使用多个对照样本，评估实验结果的可靠性和稳定性。
4、实验室环境的质量控制实验室环境对流式细胞术的结果也有重要影响。
为确保实验结果的准确性，应采取以下措施：（1）温度控制：保持实验室温度稳定，避免温度波动对细胞状态的影响。
免疫荧光间接法流式细胞法
免疫荧光间接法流式细胞法引言免疫荧光间接法流式细胞法是一种常用的细胞学技术，通过结合免疫荧光染色和流式细胞术，能够快速、准确地分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况。
本文将介绍该方法的原理、步骤以及应用领域。
一、原理免疫荧光间接法流式细胞法基于免疫荧光染色的原理，利用免疫学技术中的特异性抗原与抗体结合的原理，将标记有荧光物质的二抗与目标细胞上的特定抗原结合，通过流式细胞仪的激光器激发荧光物质，从而实现对细胞的定量和定位分析。
二、步骤1. 细胞准备：将待检测的细胞样本收集并处理，如血液样本需要进行红细胞溶解，组织样本需要进行细胞分离等。
2. 免疫反应：将细胞与特异性的一抗进行孵育，使一抗与细胞表面或内部的特定抗原结合。
3. 洗涤：用含有缓冲剂的洗涤液洗去未结合的一抗。
4. 二抗结合：加入标记有荧光物质的二抗，使其与一抗结合。
5. 洗涤：用洗涤液洗去未结合的二抗。
6. 流式细胞术：将样本放入流式细胞仪中，通过激光激发荧光物质，收集并分析细胞的荧光信号。
三、应用领域免疫荧光间接法流式细胞法在许多领域都有广泛应用。
1. 免疫学研究：该方法可用于分析细胞表面或内部的蛋白质表达情况，从而研究免疫细胞的功能和相互作用机制。
2. 肿瘤学研究：通过检测肿瘤细胞上的特异性抗原，可以实现肿瘤细胞的鉴定和分类，进而指导肿瘤的诊断和治疗。
3. 感染病原体检测：该方法可用于检测感染病原体在宿主细胞中的定位和表达水平，为感染病原体的诊断和治疗提供重要依据。
4. 免疫监测：通过定量分析细胞表面的特定抗原，可以评估免疫功能的状态，如淋巴细胞亚群的分析、免疫细胞活化的检测等。
5. 药物研发：该方法可用于评估药物对细胞表面或内部蛋白质的影响，为药物研发提供重要参考。
结论免疫荧光间接法流式细胞法是一种快速、准确的细胞学技术，通过免疫荧光染色和流式细胞术的结合，能够对细胞表面或内部的蛋白质表达进行分析。
该方法在免疫学研究、肿瘤学研究、感染病原体检测、免疫监测以及药物研发等领域有着广泛的应用前景。
流式细胞术的质量控制
⑷ DNA二倍体标准不稳定，Schutter等发现用新鲜正 常组织的二倍体细胞或者用其他生物细胞 DNA含量 (例如，鸡红细胞，鳟鱼血细胞等)作为石蜡包埋组 织细胞DNA含量的标准不适用，石蜡包埋组织比新 鲜组织细胞DNA荧光强度低，且样品间的荧光强度 不稳定，解决DNA二倍体标准不稳定的办法，可将 正常组织与肿瘤组织作为一个内标的二倍体标准参 照，可减少DNA倍体分析的误差，对存档中的石蜡 包埋组织材料，可以采用正常组织石蜡包埋标本， 作为一个外参的二倍体标准，但要求采用的外参二 倍体样品和肿瘤样品中加入内标准样品(例如鸡血细 胞等)。
流式细胞术的质量控 制和影响因素
河北省肿瘤研究所 左连富
一、标本的采集和固定方法的质量控制
标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程， 需注意： ①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要 避免出血坏死组织。 ②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织 发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。 ③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。
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在组织脱蜡的过程中，一定将蜡脱净，残留的石 蜡可，影响酶的消化活性，检查是否将蜡脱净的 方法是弃去二甲苯(Hedley强调用Histoclear，即 组织清洗剂代替二甲苯脱蜡，效果更好)，加入 100%乙醇，如果无絮状物浮起，示蜡已脱净 梯度酒精(100% 70% 50%)水化要充分,使组织还 原到与新鲜组织相似的状态。 消化酶液要掌握适当的浓度、pH值、温度等，不 造成酶的活性降低为宜，消化时间很重要，时间 短细胞消化不下来，时间长，消化下来的细胞又 被破坏，在制备石蜡包埋单细胞时，常规使用 0.5%胃蛋白酶PH 1.5。
二、单细胞悬液制备的质量控制
流式细胞术的质量控制
流式细胞术的质量控制流式细胞术的质量控制介绍:流式细胞术是一种广泛应用于生物学研究中的实验技术。
它利用机器读取细胞表面或细胞内的特定标记以获得细胞的详细信息。
在进行流式细胞术之前，需要进行一系列的质量控制步骤来确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍流式细胞术中的质量控制步骤。
⒈样本制备和处理⑴样本收集和保存●确保样本采集时的准确性和一致性，尽量避免引起细胞损伤或死亡的因素。
●根据所选择的荧光探针或抗体，选择合适的保存液保存样本，并按照推荐的存储温度和时间进行保存。
⑵细胞处理●避免细胞在处理过程中受到机械或酶的损伤。
选择适当的细胞处理方法（如胶凝、裂解或染色）。
⒉样本质量控制⑴细胞数目和浓度●使用细胞计数仪或显微镜对观察区域内的细胞进行计数，并计算细胞的浓度。
⑵细胞活性●使用细胞活性染料（如细胞渗透性染料）检测细胞的活性。
确保细胞在实验过程中保持完整和活跃。
⑶细胞纯度●利用细胞表面标记物或细胞核染色物进行细胞表型分析，以检测细胞样品中的污染物。
⑷细胞均一性●对样本进行混合和搅拌，确保细胞在整个样本中均匀分布。
⒊仪器校准和控制⑴流式细胞仪校准●使用流式细胞仪提供的校准粒子进行仪器校准，包括流速、散射光校准和荧光信号校准等。
⑵仪器控制●使用流式细胞仪的软件设置合适的参数，如触发门、荧光通道选择和数据采集速率。
⒋数据分析和解释⑴数据收集●使用流式细胞仪采集样本数据，并确保数据的完整性和正确性。
⑵数据分析●使用专业的数据分析软件对采集到的数据进行分析和解释。
⑶数据报告●根据实验需求和要求，使用适当的图形、表格和文本来呈现数据结果。
附件：⒈样本收集和保存记录表⒉样本质量控制记录表⒊仪器校准记录表法律名词及注释：⒈样本：指用于流式细胞术的生物样本，如细胞悬液或洗涤液。
⒉流式细胞仪：一种用于分析和计数细胞的仪器，透过仪器对细胞进行流式测量。
⒊标记物：用于识别和分析特定细胞类型或分子的抗体或染料。
⒋数据分析软件：用于处理流式细胞术数据并图形和数据表的计算机程序。
流式细胞仪的简要介绍与注意事项
流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)来源：评论：0我要评论[流式细胞仪的简要介绍与注意事项(流式细胞仪,注意事项)] 一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
[关键词:流式细胞仪注意事项]…••一、流式细胞仪的检测范围1．流式细胞仪可以检测细胞结构，包括：细胞大小、细胞粒度、细胞表面面积、核浆比例、DNA含量与细胞周期、R NA 含量、蛋白质含量。
2．流式细胞仪可以检测细胞功能，包括：细胞表面/ 胞浆/ 核的特异性抗原、细胞活性、细胞内细胞因子、酶活性、激素结合位点和细胞受体。
二、流式细胞仪的临床应用1．流式细胞术在肿瘤学中的应用：流式细胞术可以检测肿瘤细胞增殖周期、检测肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物、进行多药耐药性分析、检测凋亡；2．流式细胞术在血液学中的应用：检测白血病和淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞（CD34+）计数、白血病与淋巴瘤的免疫分型、网织红细胞计数、细胞移植的交叉配型和免疫状态监测；3．流式细胞术在免疫学中的应用：可以进行淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、检测细胞因子。
三、流式细胞仪的科研应用主要有细胞动力学功能研究、环境微生物分析、流式细胞术与分子生物学研究。
四、流式细胞术常规检测时的样品制备(一) 直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1×106细胞/ml），直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入），孵育20～60分钟后，用PBS（pH7.2 ～7.4）洗1～2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
流式细胞术质量控
流式细胞术质量控预览说明:预览图片所展示的格式为文档的源格式展示,下载源文件没有水印,内容可编辑和复制一、流式细胞术常规项目操作流程二、样本采集和处理些？荧光染色的两种方法意义和注意事项是什么？三、免疫荧光染色3．单克隆抗体的质量控制IVD抗体和ASR试剂，是临床常规项目的首选抗体，性能参数符合临床常规检测要求，已经对两种抗体的特异性、灵敏度、精密度、适用范围进行了验证。
对于商品化质控物可以帮助监测部分单抗的检测效率，如淋系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数、细胞绝对荧光强度、阳性表达、可以作为CD55和CD59抗体的阳性对照和室内质控物。
对于自做阳性或阴性质控物，监测单克隆抗体的质量。
因为有些抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，如健康人红细胞和中性粒细胞膜上CD55和CD59，在正常人中是阳性表达，可作为阳性对照和室内质控物。
（二）荧光染色方法1．细胞膜免疫荧光染色大多数免疫表型分析是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液的目的，保证细胞膜表面抗原活性不被破坏；防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰。
注意事项：红细胞裂解或分离后至少洗涤1次；减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰；进行绝对计数抗原表达量时，不能洗涤红细胞裂解液，因不能改变初始细胞浓度。
2．细胞内免疫荧光染色细胞内免疫荧光染色是采用荧光素或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法。
他的意义在于诊断疾病和判断预后；细胞内髓性过氧化物酶（MPO）、CD3和CD79a的表达帮助白血病免疫分型。
细胞内染色的关键之处，是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性；细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记；确保固定和透膜的步骤不影响抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合。
细胞内免疫荧光染色的破膜剂有皂角素和70％冷乙醇，皂角素最常用最稳定。
流式细胞仪分析技术
二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 双参数直方图: 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析 设门分析: 设门分析:REGION和GATE设置 和 设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光) 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 构成， 构成 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 双参数直方图： 量细胞的两个测量参数， 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。 就可以确定细胞在图上的表达位置。 • 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 双参数信号通常采用对数信号， 通常采用对数信号 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动 流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴 不充电 弃去
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。
液中细胞的含量成正比。 液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 分选纯度：
FS） 激光束照射细胞时， 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 (0.5° 10° 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比
流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
• 功能特点
（1）多参数定量分析每一个细胞；
（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。
（3）高通量（分析分选）． 分析150，000个/ 秒 分选100，000个/秒
的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。
HIV通过多种直接和间接的病理机制导致CD4+T细胞数量的缺失，最 终引起感染者免疫功能缺陷。
HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用
CD4 T cells/ml
Infection
Seroconversion
1000
500 200
0 2-6 weeks
Flu-like Disease
HAART
Death
CD4 T cell depletion
mean of 10 years
Asymptomatic phase
Symptom-atic
CD4<200/ul和/或出现艾滋病指针性症状（如卡氏肺囊虫肺炎等）时，就可定义为 进入艾滋病期。如表中A3，B3，C1-3期。
判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防
CD4计数（/ul）
任意值 <200 <100 <75 <50
主要机会性感染的预防
结核（皮试阳性） PCP
弓形体病（抗体阳性） MAC
CD4绝对计数的原理、方法和质量控制
张子宁 卫生部艾滋病免疫学重点实验室
HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义
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流式细胞术中免疫荧光染色的质量控制
摘要】流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等基础医学和临床医学的研究中，并提供了成熟的临床常规检测项目。
流式细胞术广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
【关键词】流式细胞术；免疫荧光染色；质量控制
【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2016）15-0026-02
流式细胞术已广泛用于临床常规检验中，为保证检验结果的可靠性，提高准确度和室间结果的可比性，流式细胞术质量控制越来越受到重视。
流式细胞术常规测定由一系列繁琐的步骤组成，大体可分为样本采集和处理、免疫荧光染色、流式细胞仪检测、数据分析及结果报告解释，做好这些步骤中每一环节的工作可以确保室内质量控制（IQc）和室间质量控制（EQA）顺利达标。
现对免疫荧光染色的质量控制方法进行分析如下。
1.单克隆抗体和荧光素
流式细胞术免疫荧光染色分析所用的荧光探针来源于两方面：一是荧光素标记的单克隆抗体或探针，二是单纯的荧光素。
1.1 单克隆抗体的选择
用于流式细胞术测定的单克隆抗体可分为两类，即直标抗体和纯抗体，前者指单克隆抗体与荧光素已按比例连接，不需要二次染色即可直接用于流式细胞仪测定，这类抗体产生的非特异性结合较少，适于临床常规检测[1]。
纯抗体是指抗体本身不连接有荧光素，需要在标本制备过程中对抗体进行荧光素标记，又称间接染色，间接染色容易产生较多的非特异性荧光信号，可用于研究，但不建议临床常规使用，除非抗体是明确标志的体外诊断（IVD）试剂或分析特异性（ASR）试剂。
1.2 抗体组合的原则
有些情况下，一种荧光抗体的单一免疫荧光染色(单染色法)不能满足临床检测的要求，往往需要两种或以上荧光抗体组合染色进行双色或多色分析。
如在进行T4或T8淋巴细胞亚群分析时，不能采用单一的荧光素标记的CD4或CD8抗体进行荧光染色，必须将二者与CD3抗体进行组合染色，才能准确通过
CD3+CD4+CD8-和CD3+CD4-CD8+组合抗体检测到的细胞群来分析T4和T8细胞亚群。
1.3 单克隆抗体的质量控制
（1）IVD抗体和ASR试剂是临床常规项目的首选抗体，其特异性、灵敏度、精密度和适用范围均符合临床常规的流式细胞术检测要求。
（2）商品化质控物可以帮助监测部分单克隆抗体的检测效率，现有的商品化室内质控物主要是针对淋巴细胞系系列抗体、免疫表型分析、CD4绝对计数、CD34绝对计数及细胞绝对荧光强度的监控[2]。
（3）部分抗原在正常或异常细胞上表达是已知的，因此，实验室可以自做阳性或阴性质控物以检测抗体的质量。
2.免疫荧光染色和质量控制
2.1 细胞膜免疫荧光染色
目前，大多数流式细胞术免疫表型分析主要是针对细胞膜表面抗原进行免疫荧光染色分析，即细胞膜免疫荧光染色。
为保证细胞膜表面抗原活性不被破坏和
防止细胞内抗原对膜表面抗原检测的干扰，在进行细胞膜染色时，应特别注意正确使用红细胞裂解液和淋巴细胞分离液。
除非在绝对计数抗原表达量时不能改变初始细胞浓度，否则，建议红细胞裂解或分离后至少洗涤1次，以减少红细胞碎片、血小板、血浆蛋白和淋巴细胞分离液对检测的干扰。
2.2 细胞内免疫荧光染色
有些细胞内抗原的表达情况对疾病的诊断和预后判断非常重要，如细胞内髓性过氧化物酶(MPO)、CD3和CD79a的表达可以帮助白血病免疫分型。
采用荧光索或荧光抗体对细胞内抗原进行免疫标记和分析的方法，称为细胞内免疫荧光染色。
细胞内染色的关键是使细胞膜通透增强但不影响细胞骨架的完整性，细胞膜通透增强后抗体或核酸染料可以进入细胞内与细胞内抗原进行免疫标记，同时，抗原与相应抗体的结合力或核酸与染料的结合力不受固定和透膜的影响。
皂角素是目前用于分析细胞内抗原表达的较好的破膜剂，70%冷乙醇作为破膜剂通常用于荧光染料PI与细胞内 DNA结合分析细胞倍体和周期时相，但细胞内染色不能与细胞活性检测同时进行[3]。
某些情况下，当荧光染料分子的颗粒足够小时，细胞内染色不需要破膜也可以进行，如活细胞染料DAPI、TO和AO等对细胞内核酸的染色。
3.讨论
3.1 制备样本的保存
为避免荧光淬灭，无论是细胞膜染色还是细胞内染色，整个荧光染色过程和流式细胞仪测定前都需要避光；染色完成后标本保存在4℃下并尽快在4小时内完成测定。
如不能在短时间内测定，可保存在终浓度为1％多聚甲醛溶液中达72小时；
3.2 对照设置
对照可以分为两类，一类对照用于设定流式细胞仪的检测阈值，包括同型对照、空白对照和正常对照等；另一类对照用于监测抗体和试剂的质量及整个实验过程，类似于质控品，包括阳性对照、阴性对照和正常对照等。
①同型对照：理论上是理想的对照，主要用于监测细胞自发荧光和抗体的非特异结合，但实际使用时同型对照与测试抗体对细胞的标记偶尔会出现偏差，尤其对表达量很低的抗原进行细胞计数时；②空白对照：主要用于监测细胞的自发荧光，在无法设置同型对照时，可采用空白对照设置检测阈值，如采用荧光素TO对网织红细胞染色时。
同型对照或空白对照通常在每个实验组进行流式细胞仪测定时都需要设定，以本人多年的体会，这两种对照都不是绝对的“对照”，只能作为一种参考，在某些情况下，如阴性峰和阳性峰分界很清楚时，对照的作用不是很大；③阳性对照和阴性对照：对于某些实验无法得到商品化质控品时，必须设置实验室内阳性对照和阴性对照用于监测整个实验过程。
如针对PNH诊断进行CD55和CD59计数和针对血小板无力症和巨大血小板综合征进行血小板膜糖蛋白检测时，必须设置来源于健康人的标本作为阳性对照。
④正常对照：除具有质控品的作用外，正常对照在某些实验中也起到设定阈值的作用，如在PI染色进行细胞周期和倍体分析时，正常淋巴细胞和鸡红细胞的二倍体峰所在位置决定了待测细胞倍体是否正常或异常。
【参考文献】
[1]何丽容，冯海林.流式细胞仪的保养和常见故障的排除[J].分子诊断与治疗
杂志.2000(2):32-33.
[2]何怡青，刘鷖雯，高锋.双质控法在流式细胞分析室内质量控制中的应用[J].
检验医学.2008, 23(05):536-537.
[3]温厚津，陶家平.流式细胞术免疫荧光测量中的直标及间标[J].生物化学与生物物理进展.1995.22(02):159-162.。