应用胰蛋白酶裂解反相HPLC法分析rHuEPO肽图
RP-HPLC-MS 方法分析几种蛋白的 胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化
RP-HPLC-MS方法分析几种蛋白的胰蛋白酶酶解多肽产物的条件优化引言在生物体内，蛋白的翻译后修饰过程是蛋白发挥各种不同生化功能的基础，这些翻译后修饰包括糖基化、氧化、甲基化和磷酸化等。
作为生物药物的蛋白在生产、运输、保存过程中会产生变体，从而影响到药物的活性和稳定性。
因此蛋白的肽谱经常被用来研究蛋白的翻译后修饰过程以及蛋白变体的存在。
同时也用于生物制药行业蛋白产品初级结构的确认 [1-3] ，从而更好地控制生化药品的质量和确保病人的用药安全。
本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物-多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。
仪器配置Thermo Ultimate 3000系统：泵：DGP-3600RS；自动进样器：WPS-3000TRS；柱温箱：TCC-3000RS；检测器：DAD-3000RS 质谱：TSQ Vantage色谱软件：Chromeleon 6.8测试条件与紫外检测器兼容的液相色谱条件色谱柱： 1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691, S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相： 95%超纯水+5%乙腈+0.1%TFA：5%超纯水+95%乙腈+0.08%TFA, 梯度洗脱：Time/min A/%B/%098240406040.1208045208045.198260982流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min检测器波长：214 nm进样量：20 µL柱温：35 ℃与质谱兼容的液相色谱条件色谱柱：1- Acclaim 120 C18, 3mm×150mm, 3µm (P/N063691,S/N001119)；2-Acclaim 120 C8, 2.1mm×100mm, 3µm (P/N059123, S/N001337)；3-Hypersil GOLD C4, 2.1mm×150mm, 1.9µm (S/N1008512×7, LOT10603)；流动相：A：2%乙腈, B：98%乙腈, C：10 mmol/L 醋酸铵，用乙酸调节pH=3.75, D：10mmol/L 醋酸铵，用氨水调节pH=9.79,梯度洗脱：Time/min A/%B/%C/D% -5.0782200.0782206030502060.108020650802065.1782207578220张婷婷金燕赛默飞世尔科技（中国）有限公司2流速：0.5 mL/min (ID=3mm), 0.25 mL/min (ID=2.1mm)分析时间：60 min质谱条件：离子化方式： ESI, Positive Voltage: 3000 V; Capillary Temperature: 350.0 ℃ Vaporizer Temperature: 400.0 ℃Sheath Gas Pressure: 40.0 arb, Ion Sweep GasPressure: 0 arb Auxiliary Gas Pressure: 12.0 arb; Scan Range ：150- 1500 m/z 质谱扫描参数：Scan time 0.286 s 分辨率：Q1Peak Width 0.7 FWHM.进样量：20 µL 柱温：35 ℃样品前处理准备牛血清白蛋白(BSA)、马肌红蛋白、细胞色素C 以及胰蛋白酶(Trypsin)四种蛋白标准品。
聚合物分析测试—裂解色谱和反相色谱法
聚合物分析测试—裂解色谱和反相色谱法裂解色谱（PGC）和反相色谱（IGC）由于高分子材料不能汽化，一般气相色谱不能直接测定高分子材料本身。
在普通气相色谱的进样部位加一个热裂解器，就成了裂解色谱。
裂解色谱是将高分子裂解成易挥发的较小分子，然后再将裂解产物进行气相色谱分析，从而来推断原样品的组成、结构和性质的分析方法。
科标分析以成熟的分析技术为理论依据，创建“光-色-热-质-元-化”联用的检测技术，在微量模块化方法学模拟技术中对产品的成分进行全方位的解析，科标分析聚合物分析测试服务，根据样品实际情况，制定专项检测方案，提供精准权威的检测数据。
常用的裂解器有：灯丝裂解器、管式炉裂解器、居里点裂解器和激光裂解器。
PGC在聚合物上的应用主要如下：（1）高聚物的直接鉴定，以整个谱图为“指纹图”；（2）共聚组成的分析；（3）鉴别共聚物和共混物；（4）高聚物链结构分析；（5）聚合物的热稳定性和热解机理研究。
在普通气相色谱中，固定相是已知的，被测的样品在流动相里。
反相色谱却相反，以被测的高分子为固定相，以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子（一般选择正构烷烃）。
IGC的测定方法与普通气相色谱相同，所不同的是IGC谱图只有一个峰，即一个保留体积。
测定随温度或流速的变化，可以研究高聚物的各种性质。
主要应用如下：（1）测定和。
结晶性高分子的IGC典型谱图见图11-5。
图11-5结晶性高分子的IGC谱图（2）结晶度的测定和结晶动力学研究；（3）齐聚物的分子量测定；（4）测定探针分子在聚合物中的扩散系数；（5）研究高分子溶液的热力学；（6）研究高分子的表面性质。
Q-TOF肽图分析步骤
Q-TOF肽图分析步骤
Q-TOF（Quadrupole-Time of Flight）质谱仪是一种集四极杆和飞行时间质谱（TOF）两种技术于一身的质谱装置。
其结合了四极杆质谱的选择性离子传输和飞
行时间质谱的高分辨率、高精度测量能力，常用于肽的质谱分析，尤其是蛋白质鉴定和蛋白质组学研究中。
Q-TOF质谱对肽段的测定具有高质量精度和高解析度的特点。
图1。
Q-TOF肽图分析的基本步骤大致如下：
1、样品准备：
蛋白质提取：从生物样品中提取蛋白质。
蛋白质消化：使用酶（如胰蛋白酶）将蛋白质消化成肽段。
2、肽段分离：
HPLC：选择合适的色谱柱和梯度条件，通过高效液相色谱（HPLC）来分离混合肽段。
3、质谱分析：
肽段电离：在Q-TOF离子源中，肽段被电离并转化为气态离子。
母离子选择：四极杆选择特定的母离子进入碰撞单元。
碰撞诱导解离：母离子在碰撞单元被加能并解离生成子离子。
飞行时间分析：通过TOF分析器测量子离子的m/z值。
4、数据处理与分析：
肽段鉴定：通过配对肽段的碎片离子谱和预测的或数据库中的谱来鉴定肽段序列。
蛋白质鉴定：通过关联鉴定到的肽段来鉴定对应的蛋白质。
定量分析：如果进行定量实验，需要比较不同样本或条件下肽段的丰度变化。
生物信息学分析：深入挖掘蛋白质和修饰的生物学含义。
5、结果验证：
（1）核对鉴定出的蛋白质是否与实验背景和目的相符。
（2）对重要的蛋白质或肽段进行进一步的验证实验，如再次进行质谱分析或其他生物化学实验。
重组人白细胞介素_11的胰蛋白酶切肽图分析
重组人白细胞介素211的胰蛋白酶切肽图分析饶春明3,张 翊,韩春梅,王军志(中国药品生物制品检定所生化室,北京100050)摘要:目的 建立标准肽图分析法,用于rhIL211的质量控制。
方法 应用Alliance HPLC系统及其温控自动进样器探索最佳胰蛋白酶切和色谱条件。
结果 连续3批rhIL211样品的RP2HPLC图谱完全一致,与rhIL211对照品比较,有20个峰与对照品吻合,但第6峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10峰之间多一个峰,说明rhIL2 11样品蛋白质结构与对照品比较存在细小差别。
这种差别经多肽片段分离和氨基酸序列测定证明是由于样品N端多2个氨基酸引起的。
结论 本法精确度高、重复性好、自动化程度高,可用于rhIL211的质量控制。
关键词:重组人白细胞介素211;肽图;Alliance HPLC系统;胰蛋白酶切中图分类号:R927 文献标识码:A 文章编号:0513-4870(2000)05-0378-03 重组人白细胞介素211(rh IL211)为血小板生长因子,可刺激造血干细胞和巨核细胞母细胞的增殖,并诱导巨核细胞的成熟,从而增加血小板的生成[1,2]。
由美国G enetic Institute(简称GI)研制的rh IL211为177个氨基酸,比天然成熟的人IL211在N端少一个氨基酸;成都地奥九泓制药厂生产的大肠杆菌表达的rh IL211为179个氨基酸,比天然成熟的人IL211在N端多一个氨基酸,目前已进入新药研究阶段。
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有CNBr 裂解SDS2PA GE微量肽图法和胰蛋白酶切RP2 HPLC肽图法[3]。
本文用Alliance HPLC系统及其温控自动进样器摸索rh IL211肽图分析最佳胰蛋白酶切条件,在此条件下对成都地奥九泓制药厂生产的连续三批重组人白细胞介素211进行肽谱分析,并与GI公司研制的rhIL211比较,得到较好结果。
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的.
细胞裂解液中RH123的HPLC的检测方法及其在细胞摄取实验中的应用药学院陆渊指导老师郁韵秋摘要：本实验拟采用体外培养小鼠脑微血管内皮细胞（BCEC s）的方法，研究伊曲康唑对BCECs上P-gp功能的影响。
实验将主要包括建立细胞裂解液中罗丹明123的HPLC-FLD的检测方法，并进行方法验证；小鼠脑微血管内皮细胞的分离、纯化和培养；RH123细胞摄取实验以及数据的处理和分析。
通过本实验对伊曲康唑对P-糖蛋白功能的潜在影响进行探究。
建立一种细胞裂解液中罗丹明123的HPLC的检测方法，并将其应用于研究伊曲康唑对小鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。
关键词：罗丹明123、BCECs、P-糖蛋白、HPLC、伊曲康唑、细胞裂解液Abstract: The aim of this study is to figure out whether Itraconazole is an inhibitor of P-gp. To achieve this, we use brain capillary endothelial cells (BCECs) as a model and Rhodamine 123 as the substrate to evaluate the effect of Itraconzaole on P-gp. A sensitive and rapid high-performance liquid chromatography (HPLC) method with fluorometric detection after simple sample preparation procedure was developed for the determination of Rh123 in P-gp efflux studies. This method has been successfully applied to the qualification of Rhodamine123 in cell lysate obtained from P-gp efflux study conducted in brain capillary endothelial cells and can be employed for determination of the potential effect on P-gp.Keywords:Rhodamine 123, BCECs, P-gp, HPLC, Itraconazole, cell lysate前言伊曲康唑( Itraconazole，ITZ)是一种高效、广谱的口服三唑类抗真菌制剂，临床用于治疗浅部和深部的真菌感染，其对人体的毒副作用较小[1]。
胰蛋白酶水解全酪蛋白反应过程中的色谱分析
第２ ０卷第 １ 期
２０ ０ ２年 １月 ｛Ｎ ． ０ ２ ｏ１ Ｉ
翌
Ｃ Ｎ Ｓ ＯＵＲ ＨＩ Ｅ ＥＪ ＮＡＬ Ｏ Ｈ Ｆ Ｃ ＲＯＭＡ Ｔ
胰 蛋 白酶 水解 全 酪 蛋 白反应 过 程 中的 色谱 分 析
ＱＩ ｅ ，ＨＥ Ｍ ｉｇ ｘａ Ｅ ｈ— ｎ ＨＩ — ．ｇ ｉ Ｗ ｎ — ｉ，Ｈ Ｚ ｉ ｍｉ ，Ｓ ｑｎ Ｄｅ ，
（ ｎ ｙｎ Ｔ ＇ｎｌ ｙＬ ｂ ｒ ｔｒ ，Ｃ ｅ ｃｌ ｎ ｉｅｒ ｇＲｅ ａ ｃ Ｅ ｚ ｅ ￣ｈ ｏｏ ｇ ａ ｏａｏ ｙ ｈｍｉ Ｅ ｇ ｎｅｉ ａ ｎ ｓ ｒｈ ｅ ，
齐 崴 ， 何 明霞， 何 志敏 ， 史德 青
（ 天津大学化学工程研究 所酶工程研究室 ，天津 ３０ ７ ） ０ ０ ２
摘要 ： 将高效凝胶 排阻色 瞎（ Ｐ Ｅ ） Ｈ Ｓ Ｃ 技术与水解度（ Ｈ） Ｄ 概念相结台 ， 酪蛋白一 对 胰蛋 白酶 水解体 系的酶解反应过程 进行色谱分析 ， 得到定量表征复杂酶解 反戊进程 和不 删 Ｄ Ｈ值时 多样性 酶解产物 相对分子 质量 分布的二维 图线 ； 依据蛋 白质结构信息 ， 结台 Ｈ Ｓ Ｃ实验谱图 ， ＰＥ 对胰蛋 白酶作用 于酪 蛋白时 的酶解断裂位 点进行 剖析 ， 步推断 反 初 应历程 ， 并得到理论酶 解肽段 的相对分子质量分布图及酶解物中活 多肽酪 蛋白磷酸肽 （ Ｐ ｓ肽谱 。 Ｃ Ｐ） 关键词 ： 酪蛋白 ； 胰蛋 白酶 ； 酶促水解 ； 水解 度 ； 菏效凝胶排阻色谱 ； 酪蛋白磷酸肽 ； 肽谱
ｃ ｒｍａｏ ｒｐ ｙ（ Ｓ Ｃ）ｉ ｃｍｂｎ ｔ ｎｗ ｔ ｈ ｅ ｒ ｆ ｙ ｒｌ ｉ ＤＨ） ｎｔｒ ｆ Ｓ Ｃ ｈｏ ｔｇａ ｈ ＨＰ Ｅ ｎ ｏ ｉａｉ ｉ ｔｅｄｇｅ ｏ ｄｏ ｓ ｏ ｈ ｏ ｈ ｙ ｓ（ ．Ｉ ｅｍｓ ｏ ＨＰ Ｅ
反相液相色谱在蛋白质及多肽分离分析中的应用_朱晓囡
RPLC 的一个主要应用领域就是多肽和蛋白质的制备和分析 。对于分子结构比较简单的多肽和某 些蛋白质 , 在不影响产物的活性或产物在 RPLC 后很容易重新折叠复性的前提下 , 用 RPLC 进行纯化制 备是一项高效的手段 。同时 , RPLC 分辨率高和重复性好的特点 , 使它在蛋白质及多肽分析领域占据核 心地位 。 尽管在 RPLC 中有机溶剂的存在及疏水固定相的影响可能导致蛋白质三维结构的改变 , 但这 对分析鉴定并不重要 , 虽然被分析的蛋白质发生了变性 , 却能够给出该蛋白质的结构特征及疏水性等信 息 , 并将其精确地与其它蛋白质相区分 。 3 .1 多肽及蛋白质纯化
RPLC 与其它色谱方法相比具有分辨率和回收率高 、重复性好 、操作简便等优势 。 由于 RPLC 可使 用挥发性体系如水溶三氟乙酸(TFA)-乙腈(ACN), 纯化产物不必进行脱盐 , 因此 , 可大大简化操作步骤 。 另外 , 在其它模式的色谱中 , 保留时间主要决定于天然蛋白质分子表面的某些基团与固定相配基间的相 互作用 。 而在 RPLC 中 , 蛋白质分子通过色谱柱时会发生或多或少的去折叠 , 内部某些疏水残基暴露并 与固定相相互作用 , 从而表现出与其它色谱及电泳方法不同的选择性 , 提供其它方法不能提供的信息 , 这成为 RPLC 在蛋白质及多肽分离分析中的又一个有利因素[ 3] 。 由于以上种种原因 , RPLC 已成为广泛 使用的一种分离模式 , 普遍用于多肽和蛋白质的分离分析 。 2 .2 分离机理
34检测蛋白质构象改变rplc应用中的另一个重要方面是对多肽和蛋白质的不同构象中间体及其之间相互转变的研究这方面已有大量工作如对胰岛素46溶菌酶47重组生长因子和n2甲基重组生长因子48及细胞色素c49等多种蛋白质及多肽在rplc的疏水环境中构象变化的研究
1-亲和分离纯化胰酶课件
6-2、测定酶活力试剂与配制
6-2-1、试剂
（1）、Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐 (BAPNA)
（2）、三乙醇胺
（3）、氯 化 钙
（4）、硫 （5）、盐 酸 酸
6-2-2、 试剂的配制
(1）、底物（B）的配制 [ mg/ml ] ： （2）、缓冲溶液（S）[TEA-2]： （3）、0.5 mol/L H2SO4溶液的配制： （4）、样品溶液的配制： 直接按照测定步骤，分别吸取自动部分收集器收集的各管样 品原液。
（1）、表1：酶活力的测定方法与结果表
试剂 / 管 号 缓 冲 液（ml）
0
1
2
3
4
5
6
2.0 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8
样 品 溶 液 (ml)
1.4 1.2 1
A 405 nm
0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8 管 号
胰蛋白酶分离效果图 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 2 4 6 8
管 号
吸光度[280nm]
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 10 -0.2
蛋白质洗脱峰
胰蛋白酶活力峰
亲和层析
分离纯化胰蛋白酶
一
实验原理
我们都知道酶和它的底物或竞争性抑制剂，特异性抗原和抗体， 激素及其受体等具有专一性很强的亲和能力。亲和层析是利用生物分 子间所特有的专一亲和力而设计的一种层析技术。 亲和层析就是在一种载体上，用化学偶联的方法，接上特定的配 基作为固相支持物，然后装柱，并在适当的条件下当样品通过柱子时， 其中与配基具有特异性亲和力的组分被吸附在柱上，然后通过改变洗 脱条件，使得该组分被洗脱分离开来。 亲和层析是具有快速、高效等特点，对于那些分离流程长、难度 大、浓度低、杂质多、采用常规方法难以进行分离的生物分子来说， 亲和层析显示出其独特的优越性。 通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可高达数百倍，活 性回收率纯度也非常之高。亲和层析先决条件是，不同的分离对象需 要选择接有专一性配基的固相化亲和载体，有关载体的活化、接臂、 偶联，详见相关一书。