微生物浸入试验 Microsoft Word 文档
微生物侵入试验报告
微生物侵入试验文件编号：SOP-YZ-001-02小组人员：：验证时间：2015年3月30日至2015年4月15 FI《微生物相关的生产验证》项目任务书项目名称：注射剂微生物浸入试验项目完成时间：2015年3月30 |£ 4月16日项目负责人：蔡青佑项目组成员：陈柳谷杨宇康乍凌程茜温少威项目背景：某药品或生物制品企业的GMP认证或复认证工作，按要求需要对注射剂灌封进行挑战试验（微生物浸入试验），本项目结合企业验证工作完成项目任务。
导师：敏审阅:1.简介微主物形体微小，极易通过各种途径入侵、扩散，LI前的检疫、检测措施乂难以及时发现和阻隔，而微生物入侵对人类健康、经济发展，乃至社会稳定和国家安全均构成严重威胁。
因此有必要对注射剂的容器密封系统完好性进行挑战性实验，确定工艺流程的稳固程度，防止微生物入侵以确保产品质量安全可靠。
微主物侵入试验是对最终灭菌容器/密封件系统完好性的挑战性试验。
在验证试验中，取输液瓶或西林瓶（小瓶），灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖灭菌。
此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物侵入，确认容器密封系统的完好性。
此同时，需作阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。
2.系统描述本次密封系统的完好性试验采用灌装大豆胰蛋口腺肉汤培养基，经压塞、轧盖、灭菌、微生物侵入试验，试验分为两组，A组为正常微生物侵入试验，B组为微生物挑战试验，检查产品密封可靠性是否达到要求，并对试验结果进行分析研究。
3.验证目的通过密封系统的完好性试验确认10ml瓶塞盖组成的密封系统完好性良好，能够保证产品能防止外界污染的工艺要求。
4.验证方案4.1验证方案起草验证方案审批批准人：敬日期：2015年3月304. 2检查确认确认结论：各项检查合格，实验可进行检查人：宇康日期：2015年3月30日复核人：蔡青佑日期：2015年3月31日4. 3人员及职责4. 3.1人员培训及健康检查检查验证小组成员对《密封系统完好性试验验证文件》的培训，要求参与人员熟悉验证的步骤和方法及工作容。
微生物试验rd 文档
海桐皮药材微生物试验1.药液的制备： 各海桐皮提取液：取海桐皮、川桐皮、浙桐皮药材粉末各三份，每份10g ，加入不同溶剂{ 100ml 。
水浴回流提取3h ，放冷过滤，再在药渣中分别加溶剂，作第二、三次加热回流，分别约30min ，用各自溶剂清洗残渣一同过滤，将滤液浓缩至25ml ，得到质量浓度为0.4g/ml 的提取液。
2.抑菌效力测定将定性滤纸用打孔器打成直径为5mm 的纸片，高压灭菌后烘干。
然后将滤纸片用无菌镊子夹取放入各提取液中浸泡。
用涂抹法将各供试菌液（菌液浓度约为107~108cfu/ml)接种在培养基上，再用无菌镊子夹取沾有提取液的滤纸片放入培养皿中，溶剂浸润的滤纸片作阴性对照。
然后放入37℃的培养箱中培养24h ，测量抑菌圈的直径，并记录测量数据，每组实验重复3次。
（抑菌圈直径大于6mm 小于10mm 为低度敏感；大于10mm 小于15mm 为中毒敏感；大于15mm 为高度敏感）。
3.最低抑菌浓度（MIC ）试验将0.4g/ml 的海桐皮提取液用PBS 液（磷酸氢二钠2.83g ，磷酸二氢钾1.36g 溶于1000ml 蒸馏水）做对倍系列稀释成不同浓度的受试液（0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125g/ml)，取各稀释度受试液1ml 加入到含1ml 双倍浓度营养肉汤的试管中。
取0.1ml 含菌量约为107cfu/ml 菌悬液接种于试管中，作为实验组样本（试管号：2-9）。
以同样方法接种菌液于不含受试液的营养肉汤的试管中，作为阳性对照组样本（试管号：10）。
取含营养肉汤（不接菌种）的试管作为阴性对照组样本（试管号：1）。
将实验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置37℃培养箱中，培养24h ，观察结果。
4.最低杀菌浓度（MBC ）试验取最低抑菌浓度试验结果中，无菌生长的各培养管中的培养液0.1ml ，分别移种在相应的新鲜的琼脂培养基上，37℃培养24h ，观察结果。
(完整word版)微生物挑战性实验方法
微生物挑战性实验方法1.0目的新产品防腐效果的测试2.0 范围公司新产品3.0参考：4 材料与方法4. 1化妆品中常用的防腐体系[ 6]营养琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、0.9%氯化钠溶液、平皿、接种环、培养箱等4. 2微生物挑战性实验4. 2. 1受试用微生物测试用细菌和霉菌均由浙江省食品和药品检验所提供。
细菌包括: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巨大芽胞杆菌、绿脓杆菌。
霉菌包括: 黑曲霉、黄曲霉、变色曲霉、桔青霉、拟青霉、腊叶芽枝霉、球毛壳霉、绿色木霉。
实验前，将各菌种接种于合适的培养基中, 于37℃( 细菌) 或28℃( 霉菌) 下培养。
细菌培养在2天后, 霉菌培养在3-5 天后，挑选适量菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌( 1×108个/ ml) 或混合霉菌悬液( 1×107个/ ml) , 置于4℃贮放备用。
4. 2. 2一次加菌的28 天微生物挑战试验此方法参照美国药典( 第2 1 版) 上微生物挑战性试验检测防腐剂效果的方法。
称取各受试样品30g, 加入混合细菌或混合霉菌悬液, 每克受检膏霜最终含菌量分别为5×106个细菌和3 ×105个霉菌。
然后充分混匀, 置于28℃下。
在接菌的0、7、14、2 1 和28天取样分析: 准确称取3g样品, 加到含有玻璃小珠的灭菌锥形瓶内, 加入27ml灭菌生理盐水, 充分震荡混匀, 此悬液为1∶10稀释液；然后再用灭菌生理盐水按10倍依次稀释。
按平板倾注法计数受试品中含菌量, 细菌培养是37 ℃下24h～48h，霉菌培养为28℃下3～5 天。
此实验用以评判防腐剂的有效与否。
评判标准为: 当每克样品中一次接菌( 1×106细菌和1×105霉菌) 后, 在第14天存活菌量减少至不高于起始浓度的0. 1%, 以后逐渐减少, 在28 天为0 。
符合标准为防腐剂有效( 通过测试) , 不符合为防腐剂无效(不通过测试)。
Microorganism微生物11页word文档
Microorganism 微生物: 微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。
Microbiology 微生物学: 研究微生物的生命活动规律、技术方法和开发应用的科学。
Procaryotic organism原核生物：即广义的细菌，指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始单细胞生物，包括真细菌和古生菌两大类群。
Bacteria细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。
基本形态:球状、杆状、螺旋状缺壁细菌：指细胞壁缺乏或缺损的细菌。
包括原生质体、球状体、 L型细菌和支原体。
Protoplast原生质体：指在人为条件下，用溶菌酶除去细胞壁或用青霉素抑制细胞壁合成后，所得到的仅由一层细胞膜包裹的圆球状、对渗透压变化敏感的细胞。
一般由G+形成。
Spore芽孢：某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成一个圆形或椭圆形的、壁厚、含水量低、抗逆性强的休眠构造，称为芽孢（又称内生孢子）。
Parasporal crystal伴孢晶体：少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体，称为伴孢晶体（即ð内毒素）。
Colony菌落：在适宜的培养条件下，微生物在固体培养基表面（有时为内部）生长繁殖，形成肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞群体称为菌落。
Lawn菌苔：如果将某一纯种的大量细胞密集地接种到固体培养基表面，结果长成的各“菌落”互相连成一片，这就是菌苔。
Eucaryotic microbes 真核微生物：是指一大类有完整细胞核、结构精巧的染色体和多种细胞器的微生物。
包括真菌（广义，菌物界）、显微藻类（植物界）和原生动物（动物界）。
Yeast酵母菌：是一个通俗名称，泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌。
Life cycle生活史：又称生命周期，指个体经一系列生长、发育阶段后而产生下一代个体的全部过程。
生物膜法论文 Microsoft Word 文档
目录目录 (1)摘要 (I)Abstract (II)第一章引言 (1)1．1绪论 (1)1．2生物膜法概念 (1)1．3生物膜法的性质 (2)1．4生物膜法的分类 (2)1．4．1润壁型生物膜法 (2)1．4．2浸没型生物膜法 (2)1．4．3流动床型生物膜法 (3)1．5生物膜法的特点 (3)1．6生物膜法净化污水机理 (3)1．7生物膜的应用 (4)1．8生物膜法在我国城市污水处理中的前景 (4)第二章举例说明 (5)2．1环境中磷的污染 (5)2．2淹没式生物膜法除磷 (5)2．3淹没式生物膜法除磷原理 (6)2．4淹没式生物膜法除磷工艺流程 (7)2．6试验材料 (9)2．7实验方法 (10)2．8系统运行应特别注意的问题 (11)2．9异常问题及解决对策 (11)第三章结果与讨论 (12)3．1实验结果 (12)3．2实验结果与讨论 (13)3．3结论 (13)第四章展望 (14)参考文献 (15)致谢 (16)摘要生物膜法的分类、性质、应用、特点以及生物膜法净化污水的机理和生物膜法在我国城市污水处理中的前景。
以淹没式生物膜法除磷为例，详细的介绍了生物膜法除磷的工作原理、工艺流程，以及生物膜法系统运行应特别注意的问题和异常问题及解决对策。
总结实验结果，对生物膜法处理废水的展望。
关键词：生物膜法；淹没式生物膜法；磷沈阳职业技术学院专业综合能力考核(论文)AbstractThe biological membrane method's classifications, the nature, apply the characteristic as well as the biological membrane method purification sewage mechanism and the biological membrane method in our country urban sewage processing prospect. Take the submergence type biology membrane method eliminates the phosphorus as an example, the detailed introduction biology membrane method has eliminated the phosphorus the principle of work, the technical process, as well as the biological membrane method systems operation should the special attention question and the unusual question and the solution countermeasure. Summary experimental result, to biological membrane method processing waste water forecast.Key ：Biological membrane method; Submergence type biology membrane method; Phosphorus第一章引言1．1绪论在自然界中，存在大量依靠有机物生存的微生物。
微生物实验报告
微生物实验报告实验名称：微生物实验实验目的：1. 掌握微生物的培养方法。
2. 了解微生物的形态特征和生长规律。
3. 观察和比较不同微生物产生的效应。
实验步骤：1. 准备培养基：取适量琼脂糖、胨粉、酵母浸膏等材料，加入适量蒸馏水煮沸溶解，煮沸后装入培养皿中，冷却并凝固。
2. 无菌操作：将培养皿放入高温高压锅中，进行高温高压处理，杀灭培养基中的微生物，避免外来微生物污染。
3. 接种微生物：选择需要培养的微生物菌株，用无菌棉签取少量微生物悬液在琼脂糖培养基表面涂抹均匀。
4. 培养条件控制：将培养皿放入恒温培养箱中，设置适当的温度和湿度，以促进微生物的生长。
观察培养皿中微生物的生长情况，并记录生长的时间和形态特征。
5. 结果观察与分析：观察不同微生物在培养基上的生长情况，比较不同微生物产生的效应。
实验结果：通过实验观察，发现不同微生物在培养基上的生长情况存在着明显差异。
有些微生物在培养基上形成了均匀的菌落，有些则形成了不规则的斑点状。
同时，可以观察到菌落的颜色、大小、形状等也存在差异。
实验结论：1. 不同微生物菌株在培养基上的生长速度和形态特征不同。
2. 微生物的生长受环境因素的影响较大，如温度、湿度等。
3. 微生物在培养基上的生长情况可以用于鉴定和分类微生物。
存在的问题：1. 对微生物的培养条件控制不够精细，可能导致结果的偏差。
2. 对微生物形态特征的观察和描述不够准确。
改进方案：1. 对微生物的培养条件进行更加精确的控制，确保实验结果的准确性。
2. 对微生物的形态特征进行更加准确的观察和描述，可以通过借助显微镜来观察微生物的细节结构。
备注：本报告中的微生物实验为虚构实验，仅作为示例展示微生物实验报告的基本结构和内容，实际实验应根据具体需要进行设计和操作。
病原微生物实验室生物安全管理条例Microsoft Word 文档
病原微生物实验室生物安全管理条例第一章总则第一条为了加强病原微生物实验室（以下称实验室）生物安全管理，保护实验室工作人员和公众的健康，制定本条例。
第二条对中华人民共和国境内的实验室及其从事实验活动的生物安全管理，适用本条例。
本条例所称病原微生物，是指能够使人或者动物致病的微生物。
本条例所称实验活动，是指实验室从事与病原微生物菌（毒）种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。
第三条国务院卫生主管部门主管与人体健康有关的实验室及其实验活动的生物安全监督工作。
国务院兽医主管部门主管与动物有关的实验室及其实验活动的生物安全监督工作。
国务院其他有关部门在各自职责范围内负责实验室及其实验活动的生物安全管理工作。
县级以上地方人民政府及其有关部门在各自职责范围内负责实验室及其实验活动的生物安全管理工作。
第四条国家对病原微生物实行分类管理，对实验室实行分级管理。
第五条国家实行统一的实验室生物安全标准。
实验室应当符合国家标准和要求。
第六条实验室的设立单位及其主管部门负责实验室日常活动的管理，承担建立健全安全管理制度，检查、维护实验设施、设备，控制实验室感染的职责。
第二章病原微生物的分类和管理第七条国家根据病原微生物的传染性、感染后对个体或者群体的危害程度，将病原微生物分为四类：第一类病原微生物，是指能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。
第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。
第三类病原微生物，是指能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。
第四类病原微生物，是指在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。
第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。
第八条人间传染的病原微生物名录由国务院卫生主管部门商国务院有关部门后制定、调整并予以公布；动物间传染的病原微生物名录由国务院兽医主管部门商国务院有关部门后制定、调整并予以公布。
三大导管 Microsoft Word 文档 (4)
留置导尿管医院感染预防与控制措施一、插管前准备与插管时的措施：1、尽量避免不必要的留置导尿；2、仔细检查无菌导尿包，如过期、外包装破损、潮湿等，不得使用；3、根据年龄、性别、尿道情况选择合适的导尿管口径、类型，通常成年男性悬16F、女性选14F；4、规范手卫生和戴手套的程序；5、常规的消毒方法：用0.1%的新洁尔灭消毒尿道口及其周围皮肤粘膜，程序如下：男性：自尿道口、龟头向外旋转擦拭消毒，注意洗净包皮及冠状沟。
女性：先清洗外阴，其原则由上至下，由内向外，然后清洗尿道口、前庭、两侧大小阴唇，最后会阴肛门。
每一个棉球不能重复使用。
6、插管过程严格执行无菌操作，动作要轻柔，避免尿道粘膜损伤；7、对留置导尿患者，应采取密闭式引流系统。
二、擦管后的预防措施1、保持尿液引流系统通畅和完整，不要轻易打开导尿管与集尿袋的接口；2、如果留取尿标本，可以从集尿袋采取，但此标本不用于普通细菌和真菌学检查；3、导尿管不慎脱离或导尿管密闭系统被破坏，需要更换导尿管；4、疑是导尿管阻塞应更换导尿管，不得冲洗；5、保持导尿口清洁，日常用肥皂和水保持清洁即可，但大便失禁的患者清洁以后还需消毒；6、患者洗澡或擦身时要注意对导尿管的保护，不要把导尿管浸入水中；7、不主张使用含消毒剂或抗菌药物的生理盐水进行膀胱冲洗或灌注来预防泌尿道感染；8、悬吊集尿袋，不可高于膀胱水平，并及时清空袋中尿液；9、长期留置导尿管病人，定期更换导尿管（1次/周）和集尿袋（2次/周)；10、疑似出现尿路感染而需要抗菌药物治疗前，应先更换导尿管；11、每天评价留置导尿管的必要性，尽早拔出导管。
呼吸机相关性肺炎医院感染控制措施呼吸机相关性肺炎（VAP）指开始机械通气48h后出现的肺实质感染，是病人在气管插管时不存在肺炎，也无潜在肺炎，而在机械通气后发生的一种医源性细菌性肺炎。
呼吸机相关性肺炎常见和高发于危重病人,一旦出现,将造成脱机困难,住院时间延长,病死率增加。
微生物的指示作用 Microsoft Word 文档
废水污水处理、活性污泥等常见微生物图片照片：漫游虫钟(形)虫鞭毛虫吸管虫变形虫草履虫栉毛虫轮虫鞭毛虫累枝虫寡毛虫桡足虫轮虫线虫藻类真菌一、微生物与污泥龄Young sludge: Amoebae and flagellates predominate with a few free swimming ciliates. 年轻的污泥中含有较多的变形虫（阿米巴，amoeba，也作ameba，复数形式为?）和鞭毛虫（flagellates），也有一些自由游动的纤毛虫。
变形虫借助于伪足进行运动和捕食，导致形体一直变化。
Mature sludge: For municipal wastewater treatment plants the most desirable stage of the ecological succession is the stage where both stalked ciliates and free swimming ciliates are observed with possibly a few rotifers. This stage is is correlated with rapid settling of solids and easy separation of solids from water. The resulting effluent is correspondingly low in turbidity, suspended solids and biochemical oxygen demand (BOD). 成熟的污泥是污水厂最想要的，往往同时含有有柄的纤毛虫(柄纤毛虫, stalked ciliates)和自由游动的纤毛虫(free swimming ciliates)。
并且同时看到一些轮虫（rotifers）。
Older sludge are characterized by increasing numbers of rotifers and nematodes with fewer stalked ciliates. 较老的污泥中轮虫和线虫（nematodes）增加，有柄（茎）的纤毛虫(stalked ciliates)减少。
微生物限度检查法标准操作规程(参考Word)
1. 目的：建立微生物限度检查法标准操作规程2. 范围：适用于原辅料及成品的微生物限度检查。
3. 责任人：QC负责实施，QC主管负责监督。
4. 程序：4.1 检验依据《中华人民共和国药典》2005年版一部附录P704.2 检验规程4.2.1 微生物限度检查法总则4.2.1.1微生物限度检查法系指检查非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌的检查。
4.2.1.2微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
4.2.1.3供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。
4.2.1.4除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃，控制菌培养温度为35～37℃。
4.2.1.5检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告。
4.2.2 供试品的检验量：检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
除另有规定外，一般供试品检验量为10g 或10ml ；中药膜剂为50cm2,贵重药品、微量包装药品检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。
检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4 丸，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
4.2.3供试液的制备按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
4.2.3.1液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。
油剂可加适量无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
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容器/密封系统完好性实验
——微生物浸入试验
概述
微生物浸入试验是对最终灭菌容器/密封件系统完好性的挑战性试验。
在验证试验中，去输液瓶，灌装入培养基，在正常生产线上压塞、压盖，经最长时间灭菌。
此后，将容器密封面浸入高浓度运动性菌液中，取出、培养并检查是否有微生物浸入，已确认容器密封系统的完好性。
此同时，需做阳性对照试验，确认培养基的促菌生长能力。
试验步骤
1试验样品的制备
1.1在生产线上去足够量的容器，灌装SCDM/2(大豆胰蛋白胨肉汤)培养基，使
用自动压塞和压盖设备将容器密封。
1.2将灌装后的容器经最长灭菌程序灭菌。
1.3从灭菌柜中取出试样，冷却，将一试样倒转，使培养基与容器内表面充分接
触，在30~35℃下竖放培养14天。
1.4小心去除至少50个试样的铝盖，注意不要破坏其密封口。
将去铝盖时不慎
损坏容器密封性的所有试样剔除。
按1.3要求培养样品。
2确认培养基促菌生长能力——营养性试验
2.1所有试样培养14天均不长菌时，随机取20个戴盖试样，每个试样内接种0.1ml 的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027,菌液浓度：10-100CFU/0.1ml。
2.2在30~35℃下竖放培养7天，或培养至所有试样都呈阳性结果。
2.3 若7天内，所有接种铜绿假单胞菌的试样中，微生物生长良好，则容器内培养基的促菌生长能力可判为合格。
使用格兰染色和紫外灯下肉汤呈蓝绿色荧光的性质来鉴定并确认试样容器内生长的菌为接入的铜绿假单胞菌。
3挑战菌悬浮液的制备
3.1从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027的新斜面上取一整环
培养物，分别接入含10ml无菌培养基的试管中，在30~35℃下培养16~18h。
3.2将每管的培养物分别转入含1000ml相同培养基（SCDM/2）的容器内，于
30~35℃下培养22~24h。
在培养结束时，能明显见容器内培养基出现浑浊。
3.3培养结束后的菌悬液既可用来作容器/密封系统完好性试验
4 微生物侵入操作实验步骤
本实验需在生物安全柜内或其他不影响生产环境的地方进行。
4.1 将新鲜的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027的菌悬液倒入合适的盆中，用金属丝架固定试验容器，使试倒置在菌悬液中。
4.2 将50个经最长灭菌程序灭菌的试样倒置，并浸入菌悬液中。
改组试样为A 组。
试样容器内的无菌培养基应充分接触封口内表面，样品的颈部及封口的外表面应完全浸泡在菌悬夜中。
4.3 同时将25个去铝盒的试样容器倒置入菌悬夜中，该组试样为B组。
4.4 实验开始时取一份菌悬液，平板计数每毫升所含的活菌数。
按2.3.1确认试验用微生物是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
4.5 将A组和B组试样容器在菌悬液中持续浸泡约4h.
4.6 浸泡结束时，再用平板计数菌悬液的浓度。
4.7从菌悬液中取出试样，擦干试样容器外残余的菌悬液，然后用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒容器外表面。
4.8 取装满培养基有铝盖和去铝盖的试样各两个，作阳性对照。
阳性对照用样品制备方法同试样，但不经菌悬液浸泡，其外表用含0.5%过乙酸的70%异丙醇消毒。
此后接种入10-100CFU铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC9027，按步骤2进行培养基的营养试验。
4.9 将消毒后的容器放在塑料袋中，置30-35摄氏度培养7天，操作中应特别注意不要损坏B组无铝盖试样胶塞的密封性。
4.10 挑战试验用菌悬液进灭菌后丢弃。
4.11 将挑战实验用的试样培养7天，观察检查试样容器内培养基中微生物的生长情况。
4.11.1 对每一试样进行观察检测，有生长的记+，无生长的记-。
4.11.2 如果试样容器长菌，按2.3.1方法确认生长菌是挑战微生物——铜绿假单
胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。
4.11．3 如果所有容器都不长菌，则从浸过菌悬液的，A组中取10个试样，B 组中5格试样，分别按2，进行培养基的营养检测。
5 结果评价
5.1 步骤2、步骤4.8、步骤4.11.3中进行的营养试验都合格，试样的挑战试验才有效。
5.2 在挑战实验开始时，挑战用菌悬液浓度（活菌数）必须达到1*10^6CFU/ml。
5.3 挑战实验中A组和B组如有长菌，需记录长菌的试样数。
在A组如出现长菌试验，则需按下述要求做进一步调查。
5.3.1 仔细去除微生物生长的容器的盖和塞，检查容器封口是否有缺损，造成微生物侵入。
5.3.2 将观察到试样容器封口的缺陷采用拍照或其他适当详细记录。
5.4 如果任何挑战实验中长菌的容器不是由于容器封口明显的物理缺损所致，容器/密封系统挑战实验做失败论处。
6 贮存稳定性
6.1 将剩余未经过挑战试验的容器放入箱中，保存在室温黑暗处。
6.2 在适当的时间间隔（如12个月，24个月，36个月等）取出一些容器，重复挑战试验。
在药品生产验证指南第一版大容量注射剂验证中，曾对本法作了介绍，与第一版不同点主要有两方面，一是简拼在菌液中浸泡的时间，前版为14天，本版为4h，但新版将样品分为A、B两个组，苛刻条件的组成部分来处理；二是新版按FDA 1994年11月对灭菌制剂注册申报材料的要求，增加了贮存稳定性考察的内容。
企业在事实验证时，还可将部分缺陷的瓶子列入试验范围，考察瓶口缺陷与密封完好性之间的相关性，以便为指定药包材料的内控标准提供实验依据。