考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
测量蛋白质三种方法测定原理
测量蛋⽩质三种⽅法测定原理测定蛋⽩质含量的三种⽅法原理院系：xxx专业：xxx姓名：xxx学号：xxx测量蛋⽩质三种⽅法测定原理【摘要】了解测量蛋⽩质三种测定⽅法的基本原理和优缺点。
三种⽅法为考马斯亮蓝法（Bradford法），Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
【关键词】蛋⽩质含量测定考马斯亮蓝法 Folin－酚试剂法紫外吸收法蛋⽩质含量测定法，是⽣物化学研究中最常⽤、最基本的分析⽅法之⼀⽬前常⽤的有两种古⽼的经典⽅法，即Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有⼀种近⼗年才普遍使⽤起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最⾼，⽐紫外吸收法灵敏10～20倍。
每种测定法都不是完美⽆缺的，都有其优缺点。
在选择⽅法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋⽩质的性质；③溶液中存在的⼲扰物质；④测定所要花费的时间。
简单列表为：考马斯亮蓝法双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋⽩质溶液测定的⽅法。
1976年由Bradford建⽴的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋⽩质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋⽩质测定法具有超过其他⼏种⽅法的突出优点，因⽽正在得到⼴泛的应⽤。
这⼀⽅法是⽬前灵敏度最⾼的蛋⽩质测定法。
它是⼀种蛋⽩定量法（⼀）实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是⼀种甲基取代的三苯基甲烷，分⼦中磺酸基的蓝⾊染料，在465nm处有最⼤吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋⽩质通过范得华相互作⽤形成蛋⽩质—考马斯亮蓝复合物蓝⾊溶液，引起该染料的最⼤吸收λmax的位置发⽣红移，在595nm处有最⼤吸收值。
由于蛋⽩质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远⾼于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可⼤⼤地提⾼蛋⽩质的测定灵敏度。
(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用综述共26页文档
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
试剂与器材
1.试剂: (1)标准蛋白质溶液，用牛血清蛋白配制成
0.1 mg/ml (2)考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg
考马斯亮兰G-250，溶于50ml 95%的乙 醇后，再加入120 mL 85 %的磷酸，用水 稀释至1L。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2.器材 (1)紫外可见光分光光度计 (2)试管8支
操作步骤
五种不同蛋白质含量测定方法的比较值得注意的是除凯氏定氮法外其余四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定有可能得出四种不同的结果
考马斯亮蓝法测定 蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）
➢在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中，反应式为: (NH4)3SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
➢用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量 计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量，反 应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
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4、比色
各管室温静置2-5min后，在分光光
度计上测定595nm处的光吸收值 A595，空白对照为1号试管，标准 和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能 用玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%乙醇润洗，洗去颜色。
5、制作标准曲线
以标准蛋白质浓度
（mg/mL）为横坐标，吸 光度A595为纵坐标作图， 得到一条标准曲线。
EDTA等均不干扰此法。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的
偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，
以减少这方面的偏差。
2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质
有：去污剂Triton X-100,SDS和0.1mol/L的NaOH
白配成系列浓度。
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L ） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝染色法 （ Bradford 法）
实验人员：董佳琦 潘立
一、实验目的
掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理 和操作技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原
理设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测
定溶液中蛋白质浓度的方法。
尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，
6、根据标准曲线计算待测蛋白浓度
在标准曲线上，根据测出的待测样品的
A595值，查处试管中蛋白质浓度，再按 照计算公式： 待测蛋白质的浓度（mg/mL）=查出的浓 度×稀释倍数 计算出待测蛋白浓度，如样品稀释合理 且操作得当，待测蛋白的三个数值应具 有同一性，取其平均值作为待测蛋白浓 度，如某一吸收值落在标准曲线线性范 围外，舍弃该点。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任
何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为 一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可 能得出四种不同的结果。每种测定法都不 是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方 法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏 度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中 存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突 出的优点，正得到越来越广泛的应用。
管号
Hale Waihona Puke 标准蛋白 质（μ L）缓冲液 （μ L）
总体积 （μ L ）
1 2 3 4 5 6 7
0 10 20 40 60 80 100
100 90 80 60 40 20 0
100 100 100 100 100 100 100
2、将待测蛋白配成合适浓度
另取3支清洁试管，编号8、9、10，
用微量进样器按下表操作，将待测蛋
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜 色的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，
因此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白
的含量。
考马斯亮蓝染色法的优点：
（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、
2．器材
（1）取样器及其架子 （2）试管及试管架
（3）漩涡混合器
（4）微量进样器
（5）VIS-7220可见分光光度计
1、标准曲线的制作
四、操作方法
（1）取7支试管，1号管为空白， 2-7号用微量进样器分别加 1.0mg/mL的牛血清白蛋白溶液 10，20，40，60，80，100μ L， 各管用0.015mol/LPBS缓冲液补 充剂100μ L，详见下表，混匀 待用
但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同，故
标准品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白
一致的样品做标准，能最大限度的提高该方法的
准确性。
考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色
的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，
反应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白 质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。
3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定 律进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度。
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝G250燃料试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入120 ml 85%磷酸，用蒸 馏水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 称取BSA50mg，以0.015mol/L的PBS溶 液50mL溶解，配制成1.0mg/mL的标准蛋 白质溶液，4℃存放。
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
五.计算 六.注意事项
1. 蛋白质反应液应该储存在棕色瓶内，可长 期使用，但如果变为绿色，则需要重配 2.比色皿只能用自来水冲洗，蒸馏水、95%乙 醇润洗，不可用试管刷或者其他物品直接 洗刷。 3.玻璃比色皿1套只有4只，可以同时使用， 严禁与其他比色皿混用。 4.分光光度计的吸光值在0.2-0.7时准确度最 高，低于0.1而超出0.1时误差较大，如未 知样品的读数不在此范围内，应将样品做 适当稀释或浓缩。