抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase ,APX)活性测定试剂盒 使用说明
抗氧化物活性测定方法总结
抗氧化物活性测定方法总结抗氧化物活性测定方法是通过对样品中的抗氧化物质含量和抗氧化活性进行定量分析，评估其对自由基的清除能力和抗氧化能力。
随着抗氧化研究的不断深入，测定方法也逐渐完善。
以下是对常见的抗氧化物活性测定方法的总结。
1. ORAC法（氧化应激反应活性测定法）：该方法通过测定样品清除自由基的能力来评估其抗氧化活性。
实验中，将样品与荧光试剂（如2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)）共同作用，观察其清除自由基的能力，并通过建立标准曲线计算样品的ORAC值。
2.DPPH法（1,1-二苯基-2-苦味基-苦味酸磷）：该方法是一种常用的快速测定抗氧化活性的方法。
实验中，将样品与DPPH稳定自由基共同作用，通过比色反应观察DPPH自由基被样品清除的程度，从而评估抗氧化活性。
3.ABTS法（2,2'-联氮双5-苯砜酸）：该方法通过ABTS离子自由基的生成和清除反应来测定样品的抗氧化活性。
实验中，ABTS与过氧化氢反应生成ABTS离子自由基，通过观察样品对其的清除能力来评估抗氧化活性。
4.FRAP法（亚铁离子还原能力）：该方法基于样品对人造抗坏血酸（Fe3+）的还原能力，通过测量还原后的Fe2+离子的生成量来评估抗氧化活性。
实验中，将样品与Fe3+离子反应生成Fe2+离子，通过比色反应来测定Fe2+的含量。
5. 碘标法（Iodine value）：该方法用于测定油脂、脂肪等样品的抗氧化活性。
实验中，将已知量的碘与样品中的不饱和化合物反应，在光反应下观察反应终点的颜色变化，并根据标准曲线计算样品的抗氧化活性。
6. 硝酸盐法（Nitrite method）：该方法用于测定样品中亚硝酸盐的含量，从而评估其抗氧化活性。
实验中，样品经过还原反应生成亚硝酸盐，然后与DANO（N-乙基-N-（2-苯基乙基）-对硝基苯胺）反应生成稳定的偶氮染料，通过比色测定反应终点的吸光度来计算样品中亚硝酸盐的含量。
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶活性测定
过氧化物酶（peroxidase）是一类广泛存在于各种生物中的酶。
它们能够催化过氧化物与底物之间的氧化还原反应。
此类酶有多种生物功能，其中最重要的是用于废弃物的代谢和细胞保护。
在工业和农业领域中，过氧化物酶也常被用作催化剂。
因此，对于过氧化物酶的活性测定十分重要。
传统的过氧化物酶活性测定方法主要包括光谱分析法、吸光度法、滴定法、电化学法等。
今天我们主要介绍光谱分析法的原理和步骤。
过氧化物酶在酸性pH下的催化活性主要是由其含有的含铁金属离子（Fe3+）决定的。
Fe3+构成的氧桥结构能够与底物发生氧化还原反应，同时产生吸收峰。
因此，利用曲线拟合的方法可以测定样品中过氧化物酶的活性。
具体操作步骤如下：
1. 处理样品。
将待测样品加入一定比例的磷酸盐缓冲液（pH 5.0）。
若含有颜色物质需添加过滤效果的吸附剂。
2. 加入反应液。
向样品中加入过氧化氢，使其浓度为0.1%。
3. 反应后读取吸收度。
反应结束后，利用紫外-可见光谱仪读取其吸收值。
4. 分析数据。
根据吸收峰的强度和波长，利用标准曲线计算出过氧化物酶的活性。
总之，过氧化物酶活性的测定对于研究生物学和工业化学等领域都具有重要的意义。
随着科学技术的不断发展，相信在未来，这一领域的研究也将不断深入，为我们带来更多的新发现和应用。
香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析
香蕉抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析作者：王卓徐碧玉贾彩红李健平来源：《热带农业科学》2015年第12期摘要抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase， APX）是植物重要的过氧化氢（Hydrogen peroxide， H2O2）清除酶之一。
通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）方法从香蕉根系cDNA均一化全长文库中获得一个抗坏血酸过氧化物酶基因，命名为MaAPX2基因。
MaAPX2基因是香蕉APX基因编码框全长cDNA，包含一个750 bp的最大开放阅读框（Open Reading Frame， ORF），编码249个氨基酸的蛋白质。
蛋白质序列结构域比对发现，在MaAPX2 N端具有典型的APX活性位点（APLMLPLAWHSA）和过氧化物酶近端血红素配体序列（DIVALSGGHTL）的保守结构域，属于典型的APX蛋白。
系统进化树比对分析表明，MaAPX2与马蹄莲ZaAPX（AAC08576.1）的亲缘关系较近。
组织特异性研究表明，MaAPX2基因组成型表达于香蕉各个组织，在叶片中表达量最大。
在耐病和感病品种中，MaAPX2基因均上调表达，但在耐病品种中MaAPX2基因在所有时间点相对于对照增加的倍数均高于感病品种，表明该基因在香蕉的抗病性中起着重要作用。
MaAPX2基因可以作为一个新的响应枯萎病侵染的标记基因。
关键词香蕉；抗坏血酸过氧化物酶；基因克隆；表达分析分类号 S668.1Molecular Cloning and Expression of Ascorbate Peroxidase Genefrom Banana（Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish）WANG Zhuo1） XU Biyu1） JIA Caihong1） LI Jianping1）LIU Juhua1） ZHANG Jianbing1） MIAO Hongxia1） JIN Zhiqiang1，2）（1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China；2 Haikou Experimental Station， CATAS， Haikou， Hainan 570102 China）Abstract Ascorbate peroxidase （APX） is one of the key enzymes of hydrogen peroxide scavenging in plants. In this study，we reported the molecular characteristics of APX gene cloned from banana （Musa acuminata L. AAA group，cv. Cavendish） using a RACE-PCR-based strategy. MaAPX2 contained an open reading frame （ORF） of 750 bp which encoded a polypeptide of 249amino acids. Protein alignment showed that MaAPX2 contain the complete typical conserved APX active-site signature and proximal heme-ligand motif， which belongs to a typical APX protein. Phylogenetic analysis showed that the deduced amino acid sequences of MaAPX2 also have high similarity to ZaAPX （AAC08576.1） from Zantedeschia aethiopica. Tissue-specific studies showed that the expression of MaAPX2 was constitutively expressed in various tissues of banana seedling. In resistant and susceptible varieties of banana after inoculation Foc TR4， the expression of MaAPX2 was decreased. While in resistant varieties the time point of MaAPX2， compared to control，increased higher than that in susceptible varieties at time points，indicated that this gene played an important role in banana resistance. MaAPX2 could be a new marker gene in banana seedling under the infection of Foc TR4.Keywords banana ； ascorbate peroxidase ； gene clone ； expression analysis在正常生理活动时，活性氧（Reactive oxygen species， ROS）含量处于一定的动态平衡。
超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶_概述说明
超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶概述说明1. 引言1.1 概述：在细胞内，氧化还原反应是生物体正常代谢过程中不可或缺的部分。
然而，在这些氧化还原反应中产生的活性氧种（ROS）却可能对细胞结构和功能造成损害。
为了保护细胞免受活性氧物质的侵害，细胞内存在着一系列抗氧化酶系统。
其中包括超氧化物歧化酶（SOD），抗坏血酸过氧化物酶（APX）和过氧化物酶（POD）。
这些抗氧化酶通过催化活性氧的转化和清除，起到维持细胞内稳态、减少氧自由基对生物体的伤害的重要作用。
1.2 文章结构：本文将分为五个部分来探讨超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶的定义、功能、结构、机制以及其在生理作用和临床意义方面的研究。
在第二部分，我们将详细介绍超氧化物歧化酶。
首先，我们将解释其定义和功能，包括其在生物体内的重要作用。
然后，我们将探讨其结构和催化机制，揭示超氧化物歧化酶如何通过催化超氧阴离子（O2.-）的转化来清除活性氧物质。
第三部分将聚焦于抗坏血酸过氧化物酶。
我们将解释该酶的定义和功能，并探究它在细胞中是如何通过消除过氧化氢（H2O2）来保护细胞免受氧自由基的损伤。
第四部分将涵盖过氧化物酶。
我们将描述该酶的定义、功能和结构，并讨论其通过催化有机底物或无机底物的转变来减少细胞内活性氧物质积累的机制。
最后，在第五部分结论中，我们将总结本文提到的要点，并展望未来对这些抗氧化酶系统研究的方向。
1.3 目的：本文旨在增进读者对超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶和过氧化物酶这些重要抗氧化酶系统的认识。
通过了解它们的定义、功能、结构和机制，以及在生理作用和临床意义方面的研究进展，我们可以更好地理解细胞对抗活性氧物质的保护机制，并为未来的研究提供一定的指导和启示。
2. 超氧化物歧化酶:2.1 定义和功能:超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）是一种重要的抗氧化酶，它参与细胞内超氧阴离子（O2-）的清除，以保护细胞免受过氧化损伤。
抗坏血酸过氧化物酶
未知驱动探索，专注成就专业
抗坏血酸过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）是
一种重要的氧化酶，负责在植物体内催化抗坏血酸（维生
素C）与过氧化氢之间的氧化还原反应。
该酶可以将有害的过氧化氢转化为水和氧气，起到清除细胞内部过氧化氢的
作用。
抗坏血酸过氧化物酶广泛存在于植物体内，尤其在叶片和
根部等活跃代谢组织中含量较高。
它是维持植物细胞内氧
化还原平衡的关键酶之一。
在植物遭受各种逆境胁迫时，
如高温、干旱、盐碱等，会导致植物体内产生过量的过氧
化氢，进而引发氧化应激反应。
抗坏血酸过氧化物酶的活
性会得到显著增强，从而帮助植物对抗逆境胁迫。
此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与植物生长和发育的调控。
研究发现，抗坏血酸过氧化物酶的缺失或突变会导致植物
叶片发生病斑、失绿、畸形生长等异常现象，甚至影响到
植物的种子萌发和幼苗生长。
因此，抗坏血酸过氧化物酶
在植物生理生化过程中具有重要的功能和调控作用。
1。
各种酶活性测定方法
抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定过氧化氢酶（CAT）活性测定过氧化物酶（POD）测定方法超氧化物歧化酶（SOD）活性测定小组第一次讨论结果：一、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定1.原理APX 是植物体内重要的抗氧化酶, 主要功能是分解H2O2, 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。
此外, 它还直接参与抗坏血酸的氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。
因此，APX被认为与果实的抗热性直接相关。
2.所用方法（1）采用碘液滴定法:称取新鲜材料1 g，剪碎置研钵中，加少量石英砂及pH值6.0 的磷酸盐缓冲液，迅速研磨成浆，20 ℃下浸提30 min，中间摇动数次，3000 r /min 离心后保留上清液即为酶液。
反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL，20 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 mL，终止酶的活动，抗坏血酸被消耗的量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂，以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值，用底物被消耗的量来表示APX 的活性。
每个处理设3 个重复。
（2）紫外吸收法：称取1g芥蓝叶片组织，加入1.6 mL预冷的磷酸缓冲液（PBS-K）（pH 7.8）提取液（含1 mmol·L-1 AsA，3 mmol·L-1β-巯基乙醇，0.5 mmol·L-1PMSF，2% PVP，1 mM EDTA）。
用液氮研磨，提取液于4℃，12000×g离心20 min，上清液用于酶活性的测定。
取0.10 ml 酶液（可视情况调整），加入1.70 ml 含0.1 mM EDTA-Na的PBS（0.05 mol/L，pH7.0），再加入0.10 ml 5 mM的AsA，最后加入0.10 ml 220mM H2O2，立即在20℃下测定D290（紫外）值在一定时间内的变化，计算单位时间内AsA减少量，并求酶活性（室温下测定，缓冲液调零）。
抗坏血酸氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定
儿茶酚＋O2
儿茶醌＋H2O
儿茶醌+抗坏血酸→儿茶酚＋脱氢抗坏血酸
三、实验材料
梨果肉
四、实验步骤
1．酶液提取 2．酶活性的测定（按下表配制反应体系）
瓶 号 1 2 3 4 5 6
缓冲液 4 4 4 3 3 3
抗坏血酸 焦儿茶酚 偏磷酸 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1
酶溶液 2 2 2 2 2 2
偏磷酸 (保温一定时间后) 1 1 1 1 1 1
五、试验结果
(1)抗坏血酸氧化酶活性按下式计算： 抗坏血酸氧化酶活性[氧化抗坏血酸毫克数/(克鲜重· 分)] =[ V′-( V 1- V 2)] ×0.44 (V/a)/(w×a) 式中：V′=滴定3号空白所用去的碘液毫升数； V1=滴定1号瓶所用去的碘液毫升数； V2=滴定2号瓶所用去的碘液毫升数； 0.44=每毫升5/6mmol碘液氧化抗坏血酸毫克数； V=提取液总体积（ml）； a=测定时所用提取液的ml数 w＝样品鲜重(g) t＝测定时间(分)。
抗坏血酸
CH2OH
脱氢抗坏血酸
利用碘液滴定剩余抗坏血酸
O
C HO HO H HO C C C C H O + C O C C C C H O O
I2
O H HO
+
2HI
CH2OH 抗坏血酸
CH2OH 脱氢抗坏血酸
利用单位时间内单位植物材料抗坏血酸的氧化量 利 用 间接表示多酚氧化酶的活性：
多酚氧化酶
抗坏血酸氧化ihoho利用碘液滴定剩余抗坏血酸儿茶酚o多酚氧化酶儿茶醌抗坏血酸儿茶酚脱氢抗坏血酸利用单位时间内单位植物材料抗坏血酸的氧化量间接表示多酚氧化酶的活性
抗坏血酸氧化物酶和多酚氧化 酶活性的测定
抗坏血酸过氧化物酶
抗坏血酸过氧化物酶简介抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate Peroxidase，APX）是一种存在于植物组织中的重要酶类，主要参与抗氧化反应。
它是抗氧化系统中的关键酶之一，通过催化还原型抗坏血酸（维生素C，Ascorbate）与过氧化氢（H2O2）之间的反应，起到抗氧化保护细胞的作用。
结构和特点抗坏血酸过氧化物酶是一种二聚体酶，由两个相同或相似的亚基组成。
每个亚基都包含一个铁离子，这个铁离子嵌入在酶的催化中心中，起到催化反应的关键作用。
抗坏血酸过氧化物酶的活性中心由一个高度保守的四个氨基酸残基组成，分别是组氨酸（His），赖氨酸（Arg），维氨酸（Trp），以及两个半胱氨酸（Cys），这些氨基酸残基通过配位到铁离子上形成催化中心。
催化机制抗坏血酸过氧化物酶的催化过程包括两个连续的步骤：1.还原步骤：还原型抗坏血酸通过供体氧化过程被氧化为脱氢抗坏血酸。
这个过程中，活性中心的铁离子接受还原型抗坏血酸的氢原子，并同时失去一个电子形成五价铁，还原型抗坏血酸则被氧化为脱氢抗坏血酸。
2.氧化步骤：将过氧化氢与脱氢抗坏血酸反应生成水和抗坏血酸。
在这一步骤中，五价铁复原为二价铁，并将过氧化氢还原为水。
这两个步骤交替进行，完成抗坏血酸和过氧化氢之间的催化反应。
生理功能抗坏血酸过氧化物酶在植物的抗氧化防御系统中发挥着重要的作用。
它通过催化还原型抗坏血酸与过氧化氢之间的反应，将有害的过氧化物转化为无害的物质，起到保护细胞免受过氧化物伤害的作用。
此外，抗坏血酸过氧化物酶还参与调节细胞内抗氧化系统的平衡。
当细胞受到外界胁迫或环境压力时，抗坏血酸过氧化物酶的活性会上调，以增加细胞对抗氧化应激的能力。
应用价值抗坏血酸过氧化物酶广泛应用于生物学和农业领域。
在生物学研究中，抗坏血酸过氧化物酶是测定细胞抗氧化能力的重要指标之一。
通过测定抗坏血酸过氧化物酶的活性，可以评估细胞对氧化应激的抵抗能力。
在农业方面，抗坏血酸过氧化物酶的研究对提高作物的抗逆能力具有重要意义。
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抗坏血酸过氧化物酶（ascorbateperoxidase ，APX）活性测定试剂盒使用说明
微量法100T/96S
产品简介：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。
APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。
APX 催化H 2O 2氧化AsA，是植物AsA 的主要消耗者。
APX 的活性直接影响到AsA
的含量，在胁迫和解胁迫条件下，APX 与AsA 具有一定的负相关性。
APX 催化H 2O 2氧化AsA，通过测定AsA 的氧化速率，可计算得APX 活性。
试验中所需的仪器和试剂：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。
产品内容：
试剂一：液体×2瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加3mL 蒸馏水充分溶解。
试剂三：液体×1支，4℃保存。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约0.1g 样品，加1mL 试剂一，冰上充分研磨，13000g 4℃离心20min，取上清液。
二、测定操作表：
1.分光光度计预热30min 以上，调节波长到265nm，用蒸馏水调零。
2.试剂一在25℃中预热30min 以上。
3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL 蒸馏水、140µL 预热的试
剂一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。
4.测定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20µL上清液、140µL预热的试剂
一、20µL试剂二和20µL试剂三，迅速混匀后在265nm测定10s和130s光吸收。
APX活力计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1µmol AsA为1U。
APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：每克样品每分钟氧化1µmol AsA为1U。
APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.0924×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；V反总：反应体系总体积（L），200µL=2×10-4L；106：1mol=1×106µmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20µL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。
b.使用96孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化1µmol AsA为1U。
APX(U/mg prot)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(Cpr×V样)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
活性单位定义：每克样品每分钟氧化1µmol AsA为1U。
APX(U/g鲜重)=(△A测定管-△A空白管)÷(ε×d）×V反总×106÷(V样÷V样总×W)÷T=0.1848×(△A测定管-△A空白管)÷Wε：AsA在265nm处摩尔吸光系数为5.42×104L/mol/cm；d：96孔板光径（cm），0.5cm；V反总：反应体系总体积（L），200µL=2×10-4L；106：1mol=1×106µmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL），20µL=0.02mL；V样总：提取液体积，1mL；T：催化反应时间（min），2min。