脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase,DHAR)活性测定试剂盒使用说明
Vc包括脱氢还原
Vc包括脱氢还原目前研究维生素C测定方法的报道较多，有关维生素C的测定方法如荧光法、2，6-二氯靛酚滴定法、2，4-二硝基苯肼法、光度分析法、化学发光法、电化学分析法及色谱法等，各种方法对实际样品的测定均有满意的效果.为了解国内VC含量测定方法及其应用方面的现状及发展态势.方法以“维生素C或抗坏血酸和测定”为检索词对1994～2002年中国期刊网全文数据库(CNKI)中的理工A、B和医药卫生专辑进行篇名检索，对所得有关维生素C含量测定的文献数据分别以年代、作者区域、载刊等级、样品类型、测定方法等进行计量分析.结果核心期刊载刊文献占文献总量的45.06％，其中光度法占65.69％，电化法占18.63％，色谱法占12.75％；复杂被测样品文献占文献总量的45.06％，其中光度法占60.92％，色谱法占19.54％，电化法占10.34％。
结论目前国内维生素C含量测定仍以光度法为主流，但近年来色谱法，特别是HPLC法上升趋势尤为明显。
一．荧光法1．原理样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline），其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。
脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。
本方法的最小检出限为0.022 g/ml。
2．适用范围本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定3. 注意事项3.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生C。
3.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。
3.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。
玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究
玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆和特性研究袁进成;马海莲;宋晋辉;宋小青;刘颖慧【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2013(33)9【摘要】通过电子克隆方法得到玉米脱氢抗坏血酸还原酶基因,命名为ZmDHAR1.结果显示,ZmDHAR1基因全长723 bp,开放阅读框642 bp,编码214个氨基酸.ZmDHAR1基因与高梁、水稻及小麦等植物的脱氢抗坏血酸还原酶基因高度相似,其中与高梁的DHAR基因相似性为85％,与水稻的DHAR1基因相似性为83％.基因表达分析显示,ZmDHAR1基因在根以外的其他部位都可以检测到表达,而且ZmDHAR1基因可以在4℃低温、100μmol/L ABA、100 mmol/L PEG、250 mmol/L NaCl和机械损伤等多种逆境胁迫下均可应答表达.研究表明,ZmDHAR1基因可能在玉米抗逆境胁迫反应中发挥重要的作用.【总页数】5页(P1745-1749)【作者】袁进成;马海莲;宋晋辉;宋小青;刘颖慧【作者单位】河北北方学院,河北张家口075000;河北北方学院,河北张家口075000;河北北方学院,河北张家口075000;河北北方学院,河北张家口075000;河北北方学院,河北张家口075000【正文语种】中文【中图分类】Q789【相关文献】1.苹果脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)基因cDNA片段的克隆及序列分析 [J], 张燕子;马锋旺;张军科;梁东2.棉花单脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆及原核表达 [J], 钱雯婕;王斐;石峰;葛娟;李鸿彬3.辣椒单脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆与序列分析 [J], 邹礼平4.棉花脱氢抗坏血酸还原酶基因的克隆、原核表达与纯化 [J], 李学宁;杜军伟;李鸿彬5.大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析 [J], 李晓晓;李蕊;李雅轩;蔡民华;胡英考因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物线粒体中活性氧的产生与抗氧化系统
植物线粒体中活性氧的产生与抗氧化系统摘要活细胞中活性氧不仅在信号转导方面起着关键作用,而且还可以对生物大分子起到伤害作用,所以线粒体中的活性氧必须控制在一定的浓度。
植物线粒体中存在几种抗氧化系统,它们可以控制活性氧的产生,修补活性氧对大分子造成的损伤。
其中抗氧化系统包括依赖于抗坏血酸分子和谷胱甘肽分子途径的,依赖硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)分子和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxudase,GPX)途径的。
综述了线粒体中控制活性氧的各种氧化还原反应途径,并特别强调指出,TRX 和GPX系统,以期能给该方面的研究提供帮助。
关键字线粒体;活性氧;抗氧化系统需氧进行光合作用的生物是在大气中氧存在的情况下出现和进化的,陆生植物也是在大气中氧存在的情况下出现和进化的,结果陆生植物形成了不仅可以极大运用氧气的能力,而且也形成了能限制活性氧不良作用的新陈代谢方式。
单线态氧(1O2)、超氧负离子(O2-)、过氧化物和过氧化氢的氧代谢均可以产生活性氧。
一方面,由于这些氧化物的有害性,植物需要控制它们在细胞中的含量;另一方面,当植物体遭遇病原体入侵时,活性氧可以作为信号分子起作用。
同时,这些分子能使蛋白质发生变化,诱导基因转录。
这种信号系统是细胞与外环境通信的重要组成部分。
在植物细胞中,叶绿体、线粒体和过氧化物体是产生活性氧的部位,由于活性氧可以通过细胞空隙自由扩散进入线粒体,所以线粒体成为活性氧伤害的主要细胞器[1-6]。
最近研究表明,线粒体在信号转导中处于十分重要的地位。
1植物线粒体中活性氧的产生和性质在线粒体的电子传递过程中,电子沿着一系列的电子传递体传递到末端氧化酶,然后再传递给氧,最后质子与离子型氧结合生成水。
但是,位于呼吸链底物端的一些物质,如黄素蛋白、非血红素铁蛋白(non-heme iron proteins)、醌(qu-inols),尤其是半醌(semiquinols)等发生氧化还原的能障(en-ergy barier)是很低的,常常直接启动O2的单电子还原(one-electron reduction),产生O2-。
植物中抗坏血酸含量检测方案设计与抗衰老分析实验中注意事项
植物中抗坏血酸含量检测方案设计与抗衰老分析实验中注意事项实验概要测定植物中的抗坏血酸含量。
实验原理还原型抗坏血酸（AsA）可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉（4，7-二苯基-1，10-菲咯啉，BP）反应，形成红色螯合物，对534nm波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。
脱氢抗坏血酸（DAsA）可由二硫苏糖醇（DTT）还原成AsA；测定AsA总量，从中减去还原型AsA即为DAsA含量。
主要试剂5%三氯乙酸（TCA）；20%TCA；无水乙醇溶液；0.4%磷酸－乙醇溶液；0.5%BP－乙醇溶液；0.03%FeCl3－乙醇溶液；0.6g/LDTT；Na2HPO4－NaOH 溶液：以0.2mol/LNa2HPO4和1.2mol/LNaOH等量混合；60mmol/LDTT－乙醇。
主要设备离心机；分光光度计；研钵；试管。
实验材料受干旱、高温、低温等逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官。
实验步骤1.制作标准曲线配制浓度为2，4，6，8，10，12，14mg/L的AsA系列标准液。
各取1.0ml于试管中，加入1.0ml5%TCA，1.0ml乙醇，摇匀。
再依次加入0.5ml0.4%H3PO4－乙醇，1.0ml0.5%BP－乙醇，0.5ml0.03%FeCl3－乙醇，总体积5.0ml。
将溶液置于30℃下反应90min，然后测定A534。
以AsA 浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。
2.提取取植物叶片1.0g，按1︰5（W/V）加入5%TCA研磨，离心（4000×g）10min，上清液供测定。
3.测定AsA测定取1.0ml样品提取液于试管中，按上述测标准液相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。
DAsA测定向1.0ml样品液中加入0.5ml60mmol/LDTT－乙醇溶液，用Na2HPO4－NaOH混合液，将溶液pH调至7~8。
置于室温下10min，使DAsA 还原。
保护性酶
保护性酶保护酶系：1. 过氧化物酶POD2. 超氧化物歧化酶SOD3. 苯丙氨酸解氨酶PAL4. 过氧化氢酶CA T5. 多酚氧化酶PPO6. 丙二醛（MDA）含量、游离脯氨酸含量、7. 谷胱甘肽还原酶(GR8. 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)9. 抗坏血酸(ASA)过氧化物酶（APX）Ascorbic acid peroxidase活性氧酶促保护系统主要包括：1 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase ，SOD)、2. 过氧化氢酶（Catalase,CAT）3.抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate Peroxidase，AP)、4 脱氢抗坏血酸还原酶Dehydroascorbate Reductase，DR)5. 单脱氢抗坏血酸还原酶(Monodehydroascorbate Reductase，MR)6 谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase，GR)7.非特异性过氧化物酶(non—specific peroxidase，POD)等。
张家口农专学报, 2002年6月,第l8卷第2期自由基清除酶一抗坏血酸自由基还原酶抗坏血酸过氧化物酶（APX）亚硒酸钠对小麦幼苗中谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽转硫酶活性以及谷胱甘肽含量的影响--《植物生理学通讯》2004年02期谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）测试盒说明书一、测定意义谷胱甘肽过氧化物酶是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。
它特异的催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。
谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心是硒半光氨酸，硒是GSH-PX的必需部分，每克分子酶含4克原子硒。
测定GSH-PX的活力可以作为衡量机体硒水平的一项生化指标。
测定原理谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。
植物抗坏血酸的合成和代谢以及相关酶基因的调控
植物抗坏血酸的合成和代谢以及相关酶基因的调控邹礼平* ,陈锦华孝感学院生命科学技术学院,湖北孝感432000Biosynthesis and Metabolism of Ascorbic Acid and Regulation of Related Genes in PlantsZOU Li-Ping*,CHEN Jin-HuaCollege of Life Science and Technology,Xiaogan University,Xiaogan,Hubei432000,China提要:本文对植物抗坏血酸的生物合成与代谢途径以及相关酶基因调控的研究进展作介绍。
关键词:抗坏血酸;生物合成与代谢;基因调控抗坏血酸(ascorbic acid, AsA)即维生素C (Vc), 在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。
抗坏血酸是人类和动物维持生长、繁殖和保证健康所必需的营养物质, 抗坏血酸缺乏会导致坏血病。
一般来说, 抗坏血酸与植物的抗逆性呈正相关, 植物细胞内的抗坏血酸的含量增加, 植物耐炎热、寒冷和盐碱环境等逆境的能力即增强。
抗坏血酸还与植物细胞的分裂、伸长和植株生长有关。
植物、微生物和大多数动物体内可自行合成抗坏血酸, 但人类自身则已丧失合成能力, 必须从食物中摄取。
因此, 研究植物中抗坏血酸的生物合成与代谢途径, 克隆相关的酶基因, 了解其表达调控机制, 将有利于通过生物技术的方法改良植物, 提高抗坏血酸的含量, 这对于增加植物产品的营养品质和增强植物本身抗逆性, 都有重要意义。
本文介绍植物抗坏血酸生物合成与代谢途径及相关酶基因调控研究的进展。
1 抗坏血酸的生物合成植物和动物抗坏血酸生物合成途径是有差异的。
在动物中, 从D - 葡萄糖经D - 葡萄醛酸、L- 古洛糖酸和L- 古洛糖酸-1,4- 内酯的己糖醛酸途径合成L-抗坏血酸最早是在大鼠上报道的, 放射性示踪研究表明这条途径涉及碳链倒位。
过氧化氢酶在植物生长发育和胁迫响应中的功能研究进展
活性氧(reactive oxygen species,ROS)在植物生长发育和胁迫响应中扮演着十分重要的角色,研究其产生和清除机制有着十分重要的意义。
ROS 主要包括超氧阴离子(O 2-·)、过氧化氢(hydrogen peroxide,H 2O 2)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(1O 2)等[1]。
其中,H 2O 2是最稳定的存在形式,也是植物体内重要的信号分子,因此维持体内H 2O 2稳态具有十分重要的意义[2]。
过氧化氢酶(catalase,CAT)是发现最早也是目前研究最透彻的H 2O 2清除酶之一,其功能和相关调控机制仍是当下植物研究DOI:10.16605/ki.1007-7847.2023.01.0110过氧化氢酶在植物生长发育和胁迫响应中的功能研究进展刘聪,邓宇宏,刘选明*,林建中*(湖南大学生物学院植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室国家耐盐碱水稻技术创新中心,中国湖南长沙410082)收稿日期:2023-01-01;修回日期:2023-03-07;网络首发日期:2023-04-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(31871595);湖南省自然科学基金资助项目(2020JJ4004);国家耐盐碱水稻技术创新中心项目(2022PT1005);杂交水稻国家重点实验室(湖南杂交水稻研究中心)开放课题(2019KF02);海南省崖州湾种子实验室揭榜挂帅项目(B21HJ0108)作者简介:刘聪(1991—),男,河南郑州人,博士;刘聪和邓宏宇对本文的贡献相同,为本文共同第一作者;*通信作者:林建中(1975—),男,湖南会同人,博士,湖南大学副教授,主要从事植物生理与分子生物学研究,Tel:*************,E-mail:*****************.cn;刘选明(1963—),男,湖南邵阳人,博士,湖南大学教授,主要从事植物功能基因组学研究,Tel:*************,E-mail:*************.cn 。
211138217_燕麦种胚细胞和线粒体AsA
第31卷 第4期V o l .31 No .4草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2023年 4月A pr . 2023d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2023.04.015引用格式:李红玉,王雅聪,夏方山,等.燕麦种胚细胞和线粒体A s A -G S H 循环对外源H 2O 2引发的响应[J ].草地学报,2023,31(4):1067-1070L IH o n g -y u ,WA N G Y a -c o n g ,X I AF a n g -s h a n ,e t a l .R e s p o n s e o fA s A -G S H C y c l e s t oE x o g e n o u sH 2O 2Pr i m i n g i n t h eE m b r y o n i cC e l l s a n d M i t o c h o n d r i a o fO a t S e e d s [J ].A c t aA gr e s t i aS i n i c a ,2023,31(4):1067-1070燕麦种胚细胞和线粒体A s A -G S H 循环对外源H 2O 2引发的响应李红玉,王雅聪,夏方山*,王 勃,李尹琳,张杰敏(山西农业大学草业学院,山西太谷030801)收稿日期:2022-11-08;修回日期:2022-12-13基金项目:山西农业大学 十四五 生物育种工程项目(Y Z G C 134);国家自然基金项目(31702171);山西省重点研发计划项目(201903D 221091,202102140601006);内蒙古大学 省部共建草原家畜生殖调控与繁育 国家重点实验室开放课题(2021K F 0303)资助作者简介:李红玉(1973-),女,汉族,山西太谷人,硕士,高级实验师,主要从事草种子科学研究,E -m a i l :l i h o n g yu 289@126.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m a i l :d ql x f s 8583@163.c o m 摘要:本研究探讨了外源H 2O 2引发后,燕麦(A v e n a s a t i v a )种胚细胞和线粒体抗坏血酸(A s c o r b i c a c i d ,A s A )-谷胱甘肽(G l u t a t h i o n e ,G S H )循环的抗氧化性能的变化规律,以期为植物种子的长期贮藏技术研究提供理论依据㊂试验以燕麦种子为材料,用浓度为0,0.96,1.92,3.84和7.68m o l ㊃L -1的H 2O 2引发12h 后,分析其种胚细胞和线粒体脂质过氧化水平㊁A s A -G S H 循环中酶促和非酶促抗氧化物质的变化规律㊂结果表明:燕麦种胚细胞和线粒体内A s A 和G S H 含量会随外源H 2O 2浓度的增加而显著降低(P <0.05),其A s A -G S H 循环的酶活性㊁脱氢抗坏血酸和氧化型谷胱甘肽含量均呈先升后降的趋势,其H 2O 2和丙二醛含量显著升高(P <0.05),燕麦种子发芽率则显著降低(P <0.05)㊂燕麦种胚细胞和线粒体A s A -G S H 循环的抗氧化功能变化对H 2O 2浓度升高的响应具有协同性,其抗氧化能力下降导致高浓度(ȡ1.92m o l ㊃L -1)外源H 2O 2引发下燕麦种子发芽率降低,而其A s A 含量及再生能力的降低是造成这一现象的主要原因㊂关键词:抗坏血酸-谷胱甘肽循环;线粒体;过氧化氢;燕麦;种子引发中图分类号:S 512.6 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2023)04-1064-07R e s p o n s e o fA s A -G S HC y c l e s t oE x o g e n o u sH 2O 2P r i m i n g i n t h eE m b r yo n i c C e l l s a n dM i t o c h o n d r i a o fO a t S e e d sL IH o n g -y u ,WA N G Y a -c o n g ,X I AF a n g-s h a n *,WA N GB o ,L IY i n -l i n ,Z H A N GJ i e -m i n (C o l l e g e o fG r a s s l a n dS c i e n c e ,S h a n x iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,T a i gu ,S h a n x i P r o v i n c e 030801,C h i n a )A b s t r a c t :I n t h i s s t u d y ,t h e c h a n g e s i n t h e a n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s o f a s c o r b i c a c i d (A s A )-gl u t a t h i o n e (G S H )c y c l e sw e r e e x p l o r e d a s a r e s p o n s e t o e x o g e n o u sH 2O 2pr i m i n g i n t h e e m b r y o n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i ao f o a t (A v e n a s a t i v a )s e e d s ,w h i c h p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e l o n g -t e r ms t o r a geo f p l a n t s e e d s .O a t s e e d sw e r e p r i m e dw i t h0,0.96,1.92,3.84a n d 7.68m o l ㊃L -1H 2O 2fo r 12ha s t h e e x p e r i m e n t a lm a t e r i -a l s ,a n d t h e c h a n g e s i n l i p i d p e r o x i d a t i o n a n d e n z y m a t i c a n d n o n -e n z y m a t i c a n t i o x i d a n t s i nA s A -G S Hc y c l e s w e r e a n a l y z e d i nb o t h t h e i r e m b r yo n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h eA s Aa n dG S H c o n t e n t sw e r e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n t h e e m b r y o n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a (P <0.05),a n d e n z ym a t i c a c -t i v i t i e s o fA s A -G S Hc y c l e s a n d c o n t e n t s o f d e h y d r o a s c o r b a t e a n do x i d i z e d g l u t a t h i o n ew e r e a l lw i t ha p a t -t e r no f i n c r e a s i n g f i r s t l y a n d t h e nd e c r e a s i n g .H 2O 2an dm a l o n d i a l d e h y d ec o n t e n t sw e r ea l s os i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d (P <0.05),a n dt h u st h e g e r m i n a t i o n p e r c e n t a g eo fo a ts e e d sw a sr e d u c e ds i g n i f i c a n t l y (P <0.05).E m b r y o n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a s h o w e d s i m i l a r r e s u l t s o f c h a n g e s o fA s A -G S Hc y c l e s i n r e s po n s e t o t h e i n c r e a s e o fH 2O 2co n c e n t r a t i o n ,a n d t h e d a m a g e o n t h e i r a n t i o x i d a n t c a p a c i t y r e s u l t e d i n t h e d e c r e a s e o f s e e d g e r m i n a t i o nu n d e r p r i m i n g w i t hh i g hc o n c e n t r a t i o n (ȡ1.92m o l ㊃L -1)o fe x o g e n o u s H 2O 2.I t m i g h t b e c a u s e d l a r g e l y b y th e d e c r e a s e o fA s Ac o n t e n t a n d i t s c o n t i n u o u s p r o d u c t i o n .K e y wo r d s :A s c o r b i c a c i d -g l u t a t h i o n e c y c l e s ;M i t o c h o n d r i a ;H y d r o g e n p e r o x i d e ;O a t ;S e e d p r i m i n g Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第4期李红玉等:燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环对外源H2O2引发的响应种业是决定国家稳定发展的基础性和战略性核心产业,已成为推动我国农牧业高质量发展的重要引擎[1]㊂种子活力水平是直接决定着民族种业高质量发展的关键因素,其在储藏中会因为活性氧(R e-a c t i v eo x y g e ns p e c i e s,R O S)的不断积累而逐步降低[2]㊂H2O2的产生与清除是植物维持细胞内R O S 动态平衡的关键环节,其过量积累成为引起贮藏种子活力不断下降的关键原因[3-4]㊂线粒体是种胚细胞内最主要的细胞器,其既是种胚细胞内R O S产生的最主要来源,又是种胚细胞内R O S攻击的首要目标,因而是对种子劣变最敏感的细胞器[5]㊂抗坏血酸(A s c o r b i ca c i d,A s A)-谷胱甘肽(G l u t a t h i o n e, G S H)循环是种子内维持其寿命的诸多系统中最为活跃的核心环节,因而是种胚细胞和线粒体内维持R O S稳态的重要渠道[6-7]㊂研究发现,轻度老化会诱导植物种胚细胞和线粒体内A s A-G S H循环中抗坏血酸过氧化物酶(A s c o r b a t e p e r o x i d a s e,A P X),谷胱甘肽还原酶(G l u t a t h i o n e r e d u c t a s e,G R),超氧化物歧化酶(S u p e r o x i d ed i s m u t a s e,S O D),脱氢抗坏血酸还原酶(D e h y d r o a s c o r b a t e r e d u c t a s e, D H A R)和单脱氢抗坏血酸还原酶(M o n o d e h y d r o a-s o r b a t e r e d u c t a s e,M D H A R)活性升高,其H2O2和丙二醛(M a l o n d i a l d e h y d e,M D A)含量维持一个相对较低的水平,因而其种子活力也基本未降低,但重度老化时则出现完全相反的现象[8-11]㊂外源H2O2引发下燕麦种胚细胞和线粒体中也发现了相似的变化规律[12-13]㊂老化燕麦种子的种胚细胞与线粒体在引发过程中会协同发挥作用,且线粒体是其发挥清除R O S作用的最主要部位[14]㊂然而,植物种胚细胞及线粒体A s A-G S H循环如何协同响应外源H2O2引发处理尚未见报道,其是否与老化种子的引发处理具有相同的规律也仍然不清楚㊂所以本试验旨在探讨燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环对不同浓度外源H2O2引发的响应,以验证内源H2O2含量变化与种子活力水平的内在关系,从而为精确揭示种子老化的内在抗氧化机制提供理论依据㊂1材料与方法1.1H2O2引发处理将均匀饱满的 太阳神 燕麦种子(具体来源及详细信息见文献[12-13])分为约10g每份,并参照文献[15]的方法将其含水量调整至鲜重基础约10%,然后用200m L浓度分别为0,0.96,1.92,3.84和7.68 m o l㊃L-1的H2O2在室温黑暗条件下浸泡12h后,快速用蒸馏水冲洗3次,用滤纸吸掉其表层水分后,于室温黑暗环境中风干至含水量10%(鲜重基础)左右时进行密封,并于4ħ下保存备用㊂以未引发处理的燕麦种子作为对照(C K)㊂每个处理重复4次㊂1.2发芽试验按照国际种子检验协会发布的种子检验规程(2017)[16]规定的条件进行,具体操作方法参照文献[17]进行,并按照公式G p=(G10/N)ˑ100%来计算其发芽率,式中G p代表种子发芽率,G10代表末次计数第10天时的正常发芽种子数,N代表供试发芽种子的总数[16]㊂1.3生理指标的测定提取种胚细胞粗酶液参考K i b i n z a等[18]的方法,具体操作参照文献[12]进行;提取与纯化种胚线粒体则参照Y i n等[19]的方法,具体操作参照文献[13]进行㊂测定可溶性蛋白和H2O2含量采用了建成生物工程研究所的试剂盒,测定MD A含量参考B a i l l y等[20]的方法,测定S O D活性参考R a o等[21]的方法,测定A P X和D HA R活性参考N a k a n o等[22]的方法,测定MD HA R活性参考A r r i g o n i等[23]的方法,测定G R活性参考E s t e r-b a u e r等[24]的方法,测定A s A和脱氢抗坏血酸(D e h y d r o a s c o r b i c a c i d,D HA)含量参照K a m p f e n-k e l等[25]的方法,测定G S H和氧化型谷胱甘肽(O x i d i z e d g l u t a t h i o n e,G S S G)含量参照G r i f f i t h[26]的方法㊂1.4数据分析采用S P S S21.0和E x c e l2010统计软件整理试验数据,并进行方差分析,多重比较则用D u n-c a n s法(P<0.05),以 平均值ʃ标准误 表示最后结果㊂2结果与分析2.1燕麦种子发芽率的变化由图1可知,燕麦种子的发芽率在H2O2浓度为0m o l㊃L-1时与C K无显著性差异,但在H2O2浓度ȡ0.96m o l㊃L-1时显著低于C K(P<0.05),且在H2O2浓度为7.68m o l㊃L-1时为0㊂5601Copyright©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷图1 H 2O 2引发下燕麦种子发芽率的变化F i g .1 C h a n g e s i n g e r m i n a t i o n p e r c e n t a ge of o a t s e e d su n d e rH 2O 2pr i m i n g 注:不同字母表示存在显著性差异(P <0.05)㊂下同N o t e :D i f f e r e n t l e t t e r s i n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e s a t t h e 0.05l e v e l .S i m i l a r l y f o r t h e o f l o w i n g f i gu r e s 2.2 燕麦种胚细胞和线粒体内H 2O 2和MD A 含量变化燕麦种胚细胞和线粒体内M D A 和H 2O 2含量随H 2O 2浓度的增大呈不断上升趋势(图2)㊂0m o l ㊃L -1H 2O 2引发时,燕麦种胚细胞和线粒体内M D A ,H 2O 2含量均与C K 无显著性差异,但0.96~7.68m o l㊃L -1H 2O 2引发时,燕麦种胚细胞和线粒体内M D A 和H 2O 2含量呈显著升高趋势(P <0.05),且均显著高于C K (P <0.05)㊂H 2O 2浓度为0~1.92m o l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞内H 2O 2含量低于线粒体内,但H 2O 2浓度为3.84m o l ㊃L -1和7.68m o l㊃L -1时,燕麦种胚细胞内H 2O 2含量则高于线粒体内;H 2O 2浓度为0和0.96m o l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞内M D A 含量低于线粒体内,但H 2O 2浓度为1.92~7.68m o l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞内M D A 含量则高于线粒体内㊂图2 H 2O 2引发下燕麦种胚细胞和线粒体内H 2O 2(A )和M D A (B )含量的变化F i g .2C h a n g e s i nH 2O 2(A )a n d MD A (B )c o n t e n t s o f e m b r y o n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a i no a t s e e d su n d e rH 2O 2pr i m i n g 2.3 燕麦种胚细胞和线粒体内抗氧化酶活性变化燕麦种胚细胞和线粒体内S O D ,A P X ,G R ,M D H A R 和D H A R 活性随H 2O 2浓度的增大呈先升后降趋势(图3)㊂H 2O 2浓度为0m o l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞和线粒体内S O D ,A P X ,G R ,M D H A R 和D H A R 活性都与C K 无显著性差异㊂种胚细胞S O D和G R 活性在H 2O 2浓度为1.92m o l ㊃L -1时显著高于其他浓度时(P <0.05),但其种胚线粒体S O D 和G R 活性在0.96m o l ㊃L -1H 2O 2引发时显著高于其他浓度时(P <0.05);种胚细胞及线粒体S O D 活性在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时仍均显著高于C K (P <0.05),种胚细胞G R 活性在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时也仍显著高于C K (P <0.05),但其种胚线粒体G R 活性在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时则显著低于C K (P <0.05)㊂种胚细胞A P X 活性在H 2O 2浓度为0.96m o l ㊃L -1时显著高于其他浓度时(P <0.05),其种胚线粒体A P X 活性在1.92m o l㊃L -1H 2O 2引发时显著高于其他浓度时(P <0.05);种胚细胞A P X 活性在H 2O 2浓度为3.84m o l ㊃L -1时已显著低于C K (P <0.05),但其种胚线粒体A P X活性在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时才显著低于C K (P <0.05)㊂种胚细胞和线粒体M D H A R 和D HA R 活性在0.96m o l ㊃L -1H 2O 2引发时均显著高于其他浓度时(P <0.05);种胚细胞M D H A R 和D HA R 活性在H 2O 2浓度为3.84m o l ㊃L -1时均已显著低于C K (P <0.05),其种胚线粒体M D H A R 活性则在H 2O 2浓度为1.92m o l ㊃L -1时就已显著低于C K (P <0.05),而种胚线粒体D H A R 活性则在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时才显著低于C K (P <0.05)㊂6601Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第4期李红玉等:燕麦种胚细胞和线粒体A s A -G S H 循环对外源H 2O 2引发的响应图3 H 2O 2引发下燕麦种胚细胞和线粒体内As A -G S H 循环抗氧化酶的活性变化F i g .3 C h a n g e s i n t h e a n t i o x i d a n t e n z y m e s a c t i v i t i e s o f i nA s A -G S Hc y c l e s i ne m b r yo n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a o f o a t s e e d su n d e rH 2O 2pr i m i n g 2.4 燕麦种胚细胞和线粒体内A s A 含量变化随着H 2O 2引发浓度的增加,燕麦种胚细胞和线粒体内A s A 含量均呈现逐渐下降趋势,而两者D H A 含量则均呈现先升高后降低的趋势(图4)㊂H 2O 2浓度为0m o l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞内A s A 含量显著高于C K (P <0.05),但其种胚线粒体内A s A 含量则与C K 无显著性差异,燕麦种胚细胞和线粒体内D H A 含量均与C K 无显著性差异㊂燕麦种胚细胞和线粒体A s A 含量均在H 2O 2浓度为0.96m o l ㊃L -1时就显著低于C K (P <0.05),在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时显著低于其他浓度(P <0.05);燕麦种胚细胞D H A 含量在H 2O 2浓度为0.96m o l㊃L -1时快速上升,并显著高于其他浓度时(P <0.05),而其种胚线粒体D H A 含量在1.92m o l ㊃L -1H 2O 2引发时仍显著高于其他浓度时(P <0.05),且其种胚细胞和线粒体D H A 含量均在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时仍显著高于C K (P <0.05)㊂7601Copyright ©博看网. All Rights Reserved.草 地 学 报第31卷图4 H 2O 2引发下燕麦种胚细胞和线粒体内As A (A )及D H A (B )的含量变化F i g .4 C h a n g e s i n t h eA s A (A )a n dD HA (B )c o n t e n t s o f e m b r yo n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a i no a t s e e d s u n d e rH 2O 2pr i m i n g 2.5 燕麦种胚细胞和线粒体内G S H 含量变化随着H 2O 2引发浓度的增加,燕麦种胚细胞和线粒体内G S H 含量均呈现逐渐下降趋势,而其种胚细胞和线粒体内G S S G 含量则均呈现先升高后降低的趋势(图5)㊂H 2O 2浓度为0mo l ㊃L -1时,燕麦种胚细胞内G S H 和G S S G 含量均与C K 无显著差异㊂燕麦种胚细胞和线粒体G S H 含量均在H 2O 2浓度为0.96m o l ㊃L -1时已显著低于C K (P <0.05),在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时显著低于其他浓度(P <0.05);燕麦种胚细胞和线粒体G S S G 含量在H 2O 2浓度为0.96m o l㊃L -1时均显著高于其他浓度时(P <0.05),而在7.68m o l ㊃L -1H 2O 2引发时均显著低于其他浓度时(P <0.05);但燕麦种胚细胞G S S G 含量在H 2O 2浓度为3.84m o l ㊃L -1时已显著低于C K (P <0.05),而其种胚线粒体G S S G 含量则在H 2O 2浓度为7.68m o l ㊃L -1时才显著低于C K (P <0.05)㊂图5 H 2O 2引发下燕麦种胚细胞和线粒体内GS H (A )及G S S G (B )的含量变化F i g .5 C h a n g e s i nG S H (A )a n dG S S G (B )c o n t e n t s o f e m b r y o n i c c e l l s a n dm i t o c h o n d r i a i no a t s e e d su n d e rH 2O 2pr i m i n g 3 讨论H 2O 2在植物体内所发挥的生理生化作用具有明显的浓度效应,低浓度时是植物细胞内抵御各种非生物胁迫的小分子信号物质,但高浓度时则会引起植物细胞的程序性死亡[27-28]㊂因此,外源H 2O 2引发处理对种子萌发的影响与其浓度具有密切关系[17]㊂本试验发现,低浓度(0.96m o l ㊃L -1)H 2O 2引发处理时,燕麦种子发芽率与浓度为0m o l ㊃L -1及C K 间无显著性差异,说明低浓度的H 2O 2引发能使高活力(发芽率可达100%)燕麦种子的发芽率保持较高水平,这与前人在水稻(O r y z a s a t i v a )[29]㊁臭椿(A i l a n t h u sa l t i s s i m a )[30]及茎瘤芥(B r a s s i c aju n c e a )[31]等植物种子的研究中存在差异,主要是因为前人所有种子的发芽率几乎都不高于80%,而低活力种子需要一定的H 2O 2诱导才能激活其萌发代谢及相关免疫反应[17]㊂高浓度(ȡ1.92m o l ㊃L -1)H 2O 2引发处理时,燕麦种子发芽率显著降低(P <0.05),浓度为7.68m o l㊃L -1时已基本丧失活力,这与在水稻[29]㊁臭椿[30]及茎瘤芥[31]等植物种子中的研究结论相似㊂这可能是高浓度H 2O 2处理使其在植物种子内迅速积累而导致了细胞膜系统的损伤,从而造成种子内电解质和大量代谢物质的外渗,最终表现为种子丧失活力[32]㊂燕麦种子内H 2O 2的过量积累会使其抗氧化酶活性大幅度降低,并导致其种胚细胞和线粒体发生脂质过氧化损伤,表现为两者M D A 含量大量增8601Copyright ©博看网. All Rights Reserved.第4期李红玉等:燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环对外源H2O2引发的响应加[9-10]㊂因此,高浓度H2O2引发处理引起的脂质过氧化损伤可能是导致燕麦种子活力逐渐丧失的主要原因[17]㊂试验中,燕麦种胚细胞和线粒体S O D, A P X,G R,M D H A R和D H A R活性,以及两者内M D A,H2O2,A s A,G S H,D H A和G S S G含量变化均具有相同的规律,说明燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环对于外源H2O2引发的响应具有协同性,这与P E G引发下老化燕麦种子的响应一致[14]㊂低浓度(0.96m o l㊃L-1)H2O2引发处理时,燕麦种胚细胞和线粒体内H2O2含量已均显著高于浓度为0m o l㊃L-1及C K(P<0.05),这说明已经造成了燕麦种胚细胞和线粒体内H2O2积累,因而其M D A含量也显著高于C K(P<0.05),表明发生了脂质过氧化损伤㊂此时,燕麦种胚细胞和线粒体内S O D,A P X,G R,M D H A R和D HA R活性也均显著高于浓度为0m o l㊃L-1及C K(P<0.05),这说明此时燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环的关键酶仍具有较高的清除R O S的能力,因而其A s A 和G S H含量会显著低于浓度为0m o l㊃L-1及C K (P<0.05),且其D H A和G S S G含量则均显著高于浓度为0m o l㊃L-1及C K(P<0.05),这说明A s A和G S H被作为A s A-G S H循环的底物而大量用于清除种胚细胞及线粒体内R O S[33]㊂然而H2O2浓度为1.92m o l㊃L-1时,尽管燕麦种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环的关键酶的活性仍保持较高水平,但其抗氧化能力已经开始逐渐减弱,表现为其种胚细胞和线粒体M D H A R和D H A R活性显著低于H2O2浓度为0.96m o l㊃L-1时(P<0.05),其A s A和G S H含量也继续显著降低(P<0.05),因而其H2O2和M D A含量也继续显著增加(P< 0.05),燕麦种子的发芽率也显著降低(P<0.05)㊂种子内A s A-G S H循环中M D H A R,D H A R及G S H的主要功能是使循环中A s A能够再生[33],因而高浓度H2O2造成A s A含量及其再生功能降低是导致燕麦种子活力丧失的主要原因,这是因为燕麦种子内M D H A R和D H A R对于A s A的再生具有更重要的催化作用[15,34]㊂4结论燕麦种子发芽率在高浓度外源H2O2引发下降低是其种胚细胞和线粒体A s A-G S H循环的抗氧化功能降低造成的,二者对H2O2浓度升高的响应具有协同性,而种胚细胞和线粒体内A s A含量及其再生功能降低是高浓度H2O2造成燕麦种子活力逐渐丧失的主要原因㊂参考文献[1]郑怀国,赵静娟,秦晓婧,等.全球作物种业发展概况及对我国种业发展的战略思考[J].中国工程科学,2021,23(4):45-55[2] E B O N E L A,C A V E R Z A N A,C H A V A R R I A G.P h y s i o l o g i ca l t e r a t i o n si n o r t h o d o xs e e d sd u et od e t e r i o r a t i o n p r o c e s s e s[J].P l a n t P h y s i o l o g y a n dB i o c h e m i s t r y,2019(145):34-42 [3] L IY,WA N G Y,X U E H,e t a l.C h a n g e s i nt h em i t o c h o n d r i a lp r o t e i n p r o f i l e d u e t oR O Se r u p t i o nd u r i n g a g e i n g o f e l m(U l-m u s p u m i l a L.)s e e d s[J].P l a n tP h y s i o l o g y a n dB i o c h e m i s-t r y,2017(114):72-87[4] X I AFS,C H E N G H,C H E NLL,e t a l.I n f l u e n c e o f e x o g e n o u sa s c o rb ic a c i da nd g l u t a t h i o ne p r i m i n g o n m i t o c h o n d r i a l s t r u c-t u r a l a n df u n c t i o n a l s y s t e m st oa l l e v i a t ea g i n g d a m a g e i no a t s e e d s[J].B M CP l a n tB i o l o g y,2020(20):104[5] L I B E R A T O R E K L,D U K OW I C-S C HU L Z E S,M I L L E R ME,e ta l.T h er o l eo fm i t o c h o n d r i ai n p l a n td e v e l o p m e n ta n d s t r e s s t o l e r a n c e[J].F r e eR a d i c a lB i o l o g y a n d M e d i c i n e,2016 (100):238-256[6] MA R TíA M C,F L O R E Z-S A R A S AI,C AM E J O AD,e t a l.R e-s p o n s eo f m i t o c h o n d r i a la n t i o x i d a n ts y s t e m a n d r e s p i r a t o r y p a t h w a y s t o r e a c t i v e n i t r o g e n s p e c i e s i n p e a l e a v e s[J].P h y s-i o l o g i aP l a n t a r u m,2013,147(2):194-206[7] WA N G Y,L IY,X U E H,e t a l.R e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s-p r o-v o k e dm i t o c h o n d r i a-d e p e n d e n t c e l l d e a t hd u r i n g a g e i n g o f e l m (U l m u s p u m i l a L.)s e e d s[J].T h eP l a n tJ o u r n a l,2015,81(3):438-452[8] X I N X,T I A N Q,Y I N G K,e t a l.R e d u c e dm i t o c h o n d r i a l a n da s c o rb a t e-g l u t a t h i o n e ac t i v i t y a f t e ra r t i f i c i a l a g e i n g i ns o y b e a ns e e d[J].J o u r n a l o f P l a n tP h y s i o l o g y,2014,171(2):140-147 [9] X I AF,C H E N L,S U N Y,e t a l.R e l a t i o n s h i p sb e t w e e nu l t r a-s t r u c t u r eo fe m b r y oc e l l sa n d b i o c h e m i c a lv a r i a t i o n sd u r i n ga g e i n g o f o a t(A v e n a s a t i v a L.)s e e d sw i t hd i f f e r e n tm o i s t u r ec o n t e n t[J].A c t aP h y s i o l o g i a eP l a n t a r u m,2015(37):1-11[10]X I A F,WA N G X,L I M,e ta l.M i t o c h o n d r i a l s t r u c t u r a l a n da n t i o x i d a n t s y s t e mr e s p o n s e s t o a g i n g i n o a t(A v e n a s a t i v a L.)s e e d sw i t hd i f f e r e n tm o i s t u r ec o n t e n t s[J].P l a n tP h y s i o l o g ya n dB i o c h e m i s t r y,2015,94:122-129[11]唐嘉,毛培胜,毛春力,等.不同活力水平老芒麦种胚线粒体的抗氧化生理变化[J].中国草地学报,2021,43(5):1-7[12]李红玉,王雅聪,曾佳,等.外源H2O2引发对燕麦种胚细胞A s A-G S H循环的影响[J].草地学报,2022,30(7):1668-1674[13]李红玉,王雅聪,夏方山,等.外源H2O2引发对燕麦种胚线粒体A s A-G S H循环的影响[J].草地学报,2022,30(9):86-94 [14]夏方山,董秋丽,毛培胜,等.P E G引发对老化燕麦种胚细胞与线粒体结构及抗氧化性能的影响[J].草业学报,2018,27(5): 170-177[15]夏方山.不同老化处理对燕麦种子线粒体结构及抗氧化系统的影响[D].北京:中国农业大学,2015:20-219601Copyright©博看网. 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脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase,DHAR）活性测定试剂盒使用说明产品简介：
DHAR存在于线粒体、细胞质和叶绿体中。
DHAR催化GSH还原DHA生成AsA，调控细胞AsA/DHA比值，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶。
提高植物体内的DHAR活性，可提高植物食品中AsA含量，进而提高植物食品的营养品质。
DHAR催化GSH还原DHA生成AsA，通过测定DHA被还原量可计算得DHAR活性。
试验中所需的仪器和试剂：
研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL石英比色皿、可调式移液器、蒸馏水产品内容：
试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体35mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1瓶（棕色），4℃保存。
临用前加入5mL双蒸水充分溶解；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。
临用前加入5mL双蒸水充分溶解；
操作步骤：
一、粗酶液提取：
称取约0.1g样品，加试剂一1mL，冰上充分研磨，16000g4℃离心20min，取上清液待测。
二、测定操作表：
分光光度计预热30min，调节波长到265nm，蒸馏水调零。
试剂二在25℃水浴锅中预热30min以上。
空白管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL蒸馏水、100μL试剂三、100μL试剂四和700μL试剂二，迅速混匀后于265nm比色，记录30s和150s的吸光值。
测定管：在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、100μL试剂三、100μL试剂四和700μL试剂二，迅速混匀后于265nm比色，记录30s和150s的吸光值。
DHAR活力计算：
DHAR活力单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成1μmol AsA为1U。
计算公式：
DHAR(U/mg prot)=[(△A测定管-△A空白管)÷ε÷d×V反总×106]÷（Cpr×V样）÷T
=0.092×(△A测定管-△A空白管)÷Cpr
ε:AsA在265nm处摩尔吸光系数，5.42×104L/mol/cm；106：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，1mL=0.001L；V样：加入反应体系中上清液体积，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；T：反应时间，2min。