天根 快速定点突变试剂盒说明书
Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明
咨询电话：4006663029Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明一、产品概述本试剂盒是Fasta快速定点突变试剂盒的升级版，采用同源重组的原理，用PCR手段将目标质粒从待突变位点反向扩增，其产物经重组环化后直接转化即可完成定点突变。
与原Fasta试剂盒相比具有以下优势：1.升级了原有的高保真酶，采用新型的2×Fasta-II Mix高保真扩增体系，扩增速度比原有酶快了一倍（15s/kb）且降低了扩增过程中引入新突变的可能性。
2.酶、buffer、dNTP均整合到2×Fasta-II Mix里，PCR体系只需要加引物和模板。
3.长片段扩增能力卓越，可以广泛适用于长度不超过20kb的任何质粒扩增。
4.省略了Dpn酶消化的步骤，节省1h时间。
PCR扩增产物对模板的数量优势已足够保证突变成功率。
5.大多数情况下PCR产物无需纯化即可直接做下一步重组反应。
由于使用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环或连接成环，因此使用本试剂盒进行定点突变不但引物设计灵活，还可以同时突变距离较远的两个点。
二、产品组成（15次反应）2×Fasta-II Mix：375ul5×Fasta-II Recombination Buffer：30ulFasta-II Recombination Enzyme:15ul三、贮藏与保质期本产品应置于-20℃储存，保质期一年。
四、单碱基或连续多碱基定点突变实验方案图1实验流程概况4.1引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可。
引物设计原则为：(1)正、反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，GC含量40-60%为佳。
(2)各引物非互补区域长度至少为15bp。
(3)待突变位点至引物3’端区域Tm值高于60℃为佳。
(4)需要引入突变的位点首选使其包含在互补区域内，即两条引物均引入点突变。
定点突变protocol
基因定点突变试剂盒产品简介：碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。
只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。
累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。
然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。
这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。
待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。
这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。
这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
图1. 基因定点突变试剂盒原理图保存条件：-20℃保存，一年有效。
注意事项：需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。
需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：1. 引物设计：用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：(1) 共需设计两条互补的引物。
可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
天根 快速定点突变试剂盒说明书
KM101 （20 rxn）
30 μl 200 μl 20 μl 40 μl 80 μl 20×50 μl
储存条件
收到本产品后， 请立即将FDM competent cells置于-70℃条件下保存，试剂盒其他组分 置于-20℃条件下保存。感受态细胞可在-70℃条件下保存3个月，试剂盒其他组分可在-20℃ 条件下保存1年。
50 μl 体系 2 μl 4 μl 10 μl 1.5 μl
至50 μl
终浓度 0.2 ng/μl 400 nM
1× 0.075 U/μl
－
4、将实验组及对照组按照如下PCR反应程序进行PCR反应。
PCR反应程序： 注：下表中PCR程序按照对照组实验条件设置，客户可根据自身实验进行相应调整。
阶段 预变性
■ PCR、RT-PCR系列 ■ 核酸DNA、RNA分离纯化系列 ■ DNA分子量标准 ■ 克隆载体、感受态细胞 ■ 细胞生物学产品 ■ 蛋白分子量标准 ■ 蛋白质染色、检测及定量相关产品
版本号: KM131204
Order: 010-59822688 Toll-free: 800-990-6057 /400-810-6057 TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD
PCR反应
补充延伸
循环 1×
18×
1×
温度 95℃ 94℃ 55℃ 68℃ 68℃
时间 2 min 20 sec 10 sec 2.5 min 5 min
二、质粒模板的消化
1、按照下表所述配制酶切体系： 组成成分
PCR产物 Dpn I restriction enzyme （20 U/μl） Total Volume 2、充分混匀后，将上述酶切体系于37℃条件下消化1 h。
天根 一步法逆转录PCR试剂盒说明书
通用型一步法RT-PCR试剂盒说明书前言本试剂盒适用于对各种动、植物、病毒RNA进行PCR 检测。
用户可根据被分析基因，配合一对引物，或同时采用Taqman 荧光探针，先将提取的RNA反转录(reverse transcription).成cDNA，再经过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)技术对特异性片段进行扩增，进行电泳或实时荧光分析。
一步法RT-PCR可使RT及PCR过程在单管中完成，比分开进行RT及PCR更方便。
由于不需要在RT完成后打开反应管，尽可能地避免了样品间的相互污染。
规格20人份适用仪器适用于各种普通PCR仪器和实时荧光PCR仪器。
试剂盒组成试剂准备根据下表配制反应液：振荡混匀后，按每管 40 μl(可根据需要调整)分装，备用。
PCR扩增将均一化后的RNA提取样本10 μl加入各反应管，混匀、离心后，置普通PCR仪器或实时荧光PCR仪器上进行扩增及实时检测。
结果判断扩增产物可直接进行电泳检测；实时荧光检测可根据相应仪器的配套软件进行结果分析。
保存及有效期-20℃保存，有效期为6个月。
注意事项1. 开始检测前请仔细阅读本说明书全文。
2. 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增（荧光检测）应分区进行以避免污染。
3. 操作人员应戴口罩，经常更换一次性手套，以避免RNA酶的污染；实验中所用器具均应经过除RNA酶处理。
4. 试剂盒组成中的试剂使用前应充分融化并混匀。
5. 进行实时荧光分析时，应使用透光性能较好的一次性薄壁离心管；.荧光探针应避光保存，加入缓冲液中后，应尽快进行扩增。
6. 注意适当处理检测中遗留的样品、扩增产物及可能被污染的试剂。
生产企业：上海蓝创生物科技发展有限公司。
Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明
咨询电话：4006663029Fasta-II快速定点突变试剂盒使用说明一、产品概述本试剂盒是Fasta快速定点突变试剂盒的升级版，采用同源重组的原理，用PCR手段将目标质粒从待突变位点反向扩增，其产物经重组环化后直接转化即可完成定点突变。
与原Fasta试剂盒相比具有以下优势：1.升级了原有的高保真酶，采用新型的2×Fasta-II Mix高保真扩增体系，扩增速度比原有酶快了一倍（15s/kb）且降低了扩增过程中引入新突变的可能性。
2.酶、buffer、dNTP均整合到2×Fasta-II Mix里，PCR体系只需要加引物和模板。
3.长片段扩增能力卓越，可以广泛适用于长度不超过20kb的任何质粒扩增。
4.省略了Dpn酶消化的步骤，节省1h时间。
PCR扩增产物对模板的数量优势已足够保证突变成功率。
5.大多数情况下PCR产物无需纯化即可直接做下一步重组反应。
由于使用高效的同源重组反应替代了传统的退火成环或连接成环，因此使用本试剂盒进行定点突变不但引物设计灵活，还可以同时突变距离较远的两个点。
二、产品组成（15次反应）2×Fasta-II Mix：375ul5×Fasta-II Recombination Buffer：30ulFasta-II Recombination Enzyme:15ul三、贮藏与保质期本产品应置于-20℃储存，保质期一年。
四、单碱基或连续多碱基定点突变实验方案图1实验流程概况4.1引物设计向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可。
引物设计原则为：(1)正、反向扩增引物5’端包含15-21bp反向互补区域，GC含量40-60%为佳。
(2)各引物非互补区域长度至少为15bp。
(3)待突变位点至引物3’端区域Tm值高于60℃为佳。
(4)需要引入突变的位点首选使其包含在互补区域内，即两条引物均引入点突变。
天根RNA提取说明书
2) 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS 洗涤细胞，吸除PBS ，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-Free 的离心管中，300×g 离心5 min ，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA 的产量降低。
d. 细胞悬液：离心取细胞。
每5×106-107动物细胞和植物细胞加入1 ml TRNzol-A +。
加入TRNzol-A +前不要洗涤细胞，以免降解mRNA 。
e. 血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积TRNzol-A +(推荐0.25ml 全血加入0.75 mlTRNzol-A +)，充分振荡混匀。
2. 将匀浆样品在15-30℃放置5 min ，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 离心10 min ，取上清。
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA ，上清中含有RNA 。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1 ml TRNzol-A +加0.2 ml 氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 sec ，室温放置3 min 。
注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min 。
5. 4℃ 12,000 rpm(~13,400×g)离心10-15 min 。
样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 主要在水相中，把水相（约500 μl ）转移到新管中。
(如果要分离DNA 和蛋白质，可向天根公司索取提取方法)。
6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30 min 。
天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书
For personal use only in study and research; not for commercial use产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。
注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。
2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
3.使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
7.实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
8.用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
点突变试剂盒SMK-101操作流程详解
[３] 制品内容............................................................................................................... 3
[４] 注意事项............................................................................................................... 3
（１）相关培养基和试剂的组成 ............................................................................. 10 （２）相关产品 ......................................................................................................... 11
四正柏生物科技基因定点突变试剂盒说明书
基因定点突变试剂盒保存条件及效期：−20℃保存，有效期一年。
产品描述：定点突变是一种广泛应用的分析蛋白和DNA 的非常有力的工具。
普通的定点突变试剂盒通常是基于反向PCR 技术，采用高保真耐热DNA 聚合酶和互补的突变引物向目的基因引入单个碱基或多个邻近碱基的突变、缺失、或插入。
当遇到多个位点突变的需求时，利用单点突变试剂盒只能对目标位点逐一引入突变，耗时费力。
Mut Multi Site-directed Mutagenesis(MSDM)Kit 针对每一个目标突变只采用一条突变引物，利用Mut MSDMEnzyme 的耐热DNA 聚合酶活性合成与模板互补的带有引物突变的DNA 链，然后通过其耐热的连接酶活性修复突变DNA 链之间的切刻(nicks)，使其连接成为一条与模板互补的突变单链DNA 。
经过多个PCR 循环反应后，带有多个特定突变的DNA 链成倍增长。
PCR 反应结束后，采用DpnI 限制性内切酶消化含有甲基化的双链质粒模板，而带有突变的环形单链质粒则通过转化而在大肠杆菌体内复制，最终得到带有不同突变组合的质粒DNA 。
本试剂盒适用于≤6kb 质粒的多点突变，根据质粒性质不同，最多可引入5个位点的突变、插入或删除(通常以1~3个位点突变为主)。
该方法操作简单快捷，突变阳性率高。
产品组分:产品编号规格MSM5303-1010rxnMut MSDM Enzyme12μl 10x MutMSDM Buffer 100μl MutdNTPs25μl Dpn I (10U/ l)12μl ddH 2O1ml版本号:2016-02-19产品说明书图1.Mut 多点基因定点突变试剂盒原理和操作流程示意图使用方法：1.模板准备：(1)请使用6kb以下的质粒作为模板；如果模板质粒过大，可将所需突变的序列亚克隆到较小的载体中，完成突变后再克隆到目的载体中。
(2)对于非甲基化的质粒(例如从大肠杆菌JM110或SCS110菌株中提取的质粒)，可通过转化dam＋的大肠杆菌菌株(如DH5α、TOP10、JM109、XL1-Blue等)，再抽提获得甲基化的质粒作为PCR反应模板。
gibson天根说明书
室温孵育即可完成片段的连接,无需50℃。
不受载体或插入片段酶切位点限制在任意位置进行无缝克隆
不依赖于T4连接酶，高效连接，无碱基缺失
可同时高效ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ接一个或多个PCR片段
无需额外的亚克隆，菌检阳性率高达95%
三、产品原理
T5外切酶可从双链DNA5端切割形成3突出末端， 从而促进重叠区域的具有互补序列的片段进行退火。
一、产品介绍
gibson天根试剂盒是一种混合酶系统，其可将任意方法线性化的载体和与其两端具有重叠区域的一个或多个PCR片段定向重组连接。该方法不依赖于T4 DNA连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，可在30分钟内实现PCR片段高效定向无缝克隆至载体的任意位置，从而获得完整的双链DNA分子。该试剂盒使用简单，只需加入合适比例的载体和PCR片段在室温孵育15-30min即可完成片段的连接。
高保真DNA聚合酶可使退火的片段向3端延伸，从而填补片段缺口。Taq DNA连接酶可封闭缺刻从而获得完整的双链DNA分子。
四、产品储存
-20℃可保存2年，-80℃可保存5年，避免反复冻融。
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2、本试剂盒支持多引物多位点突变，这样可以在基因内更广泛的范围内进行突变实验。突 变位点个数的上限仍然是5个。
3、建议在进行新的突变实验时要带上试剂盒附带的对照质粒和引物，以便于对实验问题进 行分析。
适用范围
本试剂盒适用于：改造优化目的基因和载体；分析启动子上与调控蛋白结合的关键位点； 研究蛋白质结构和功能之间的关系。
4
5
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引物设计原则
1、两条引物上都要包含突变位点，且除突变位点以外的碱基都要与质粒模板互补配对。 2、若引物中只有一个突变位点，则需采用图2-A的设计原则。此类引物包括5’重叠区和3’
延伸区两部分。引物总长度大约为30 nt，其中5’重叠区为15-20 nt，3’延伸区至少为 10 nt。突变位点在正向突变引物的重叠区以后，反向突变引物的5’末端。 3、若引物上含有2-5个突变位点，则需采用图2-B的设计原则。此类引物的两条序列完全互 补，分为突变区和非突变区两部分。引物总长度大约为40 nt，其中突变区为15-20 nt，非 突变区至少为10 nt为保证高突变率，突变引物需通过FPLC或PAGE方式纯化。 5、突变引物Tm值的计算按下列公式进行：
5×PCR反应Buffer的反复冻融。
图1 TIANGEN 快速定点突变试剂盒操作流程 试剂盒提供的FastAlteration DNA Polymerase是一种快速高保真DNA聚合酶，该酶保 真性能优良，灵敏度高，扩增速度可达15~30 sec/kb，并且最高可扩增长度为10 kb的质粒 DNA。试剂盒附带的FDM感受态细胞具有体内降解甲基化质粒的功能，可以对未被Dpn I降 解掉的质粒模板进行进一步的降解，因此可以保证试剂盒具有更高的阳性率。同时，本试剂 盒还为客户提供了对照质粒和引物，方便客户查找实验问题。
Tm = 81.5 + 0.41(GC%) - 675 / N- mismatch% （N：引物长度）
注意事项
图2 TIANGEN 快速定点突变试剂盒引物设计原则
1、在进行单引物多位点突变时，由于增加了突变位点个数，所以突变率较单点突变时会有 所降低，根据我们的实验数据，当突变位点个数达到5个时，突变阳性率会降低到50%。 因此建议客户要增加验证的克隆子数。
酶切阶段，加入Dpn I后一定要用移液器轻轻吸打多次以 保证Dpn I与PCR体系混合均匀。
质粒模板过剩会极大的影响突变效率。若排除其他影响 后，突变率仍然很低，可以考虑增加Dpn I的用量至2 μl
或延长酶切时间至1.5 h。 此Buffer中含有dNTP等容易降解的成分，反复冻融会加 速这些物质的降解，因此，在实际操作中应尽量避免对
2、对照组突变率低或者菌落数少
原因
解决办法
PCR程序不适宜 扩增产物不足
感受态细胞保存不当
X-gal和IPTG的用量不足
5×PCR反应Buffer 反复冻融
确定PCR程序适宜对照组要求，并用确定后的程序再进 行一次对照组实验以彻底排除PCR程序的影响。 可将PCR反应的循环数增加至25个。
收到试剂盒以后应第一时间将感受态细胞转入-70℃冰箱 中保存，且应将感受态放于冰箱的里面而不要放在门口。
3
操作方法
一、建立 PCR 反应体系：
注意：以下举例仅供参考，实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据实 际情况，设定最佳反应条件。
1、将-20℃下保存的PCR反应相关试剂，突变引物及模板质粒解冻并混匀。
2、按照下表中各组分的加入量进行反应液的配制。
反应体系：
组成成分 DNA Template 正向突变引物（10 μM） 反向突变引物（10 μM） 5×FastAlteration Buffer FastAlteration DNA Polymerase （2.5 U/μl） RNase-Free ddH2O
50 μl 体系 10~100 ng
2 μl 2 μl 10 μl 1.5 μl 至50 μl
终浓度 －
400 nM 400 nM
1× 0.075 U/μl
－
3、按照下表体系配制对照组PCR体系。
反应体系：
组成成分 4.5 kb Control plasmid （5 ng/μl） Control primers （5 μM, each） 5×FastAlteration Buffer FastAlteration DNA Polymerase （2.5 U/μl） RNase-Free ddH2O
突变率。对于单点突变而言，本试剂盒的突变率可达90%以上。
2
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四、根据对照组统计突变结果
试剂盒提供的对照质粒和对照引物主要用于评估试剂盒的突变率。在氨苄抗性的平板 上，涂布20 μl 0.2 M的IPTG和40 μl 40 mg/ml的X-gal，正常情况下，对照组在上述平板上的 菌落生长数应该在50个以上，且阳性突变菌株显蓝色，因为对照质粒上的lacZ基因是经过改 造的，而成功的突变会使其回复成野生型。因此可根据菌落的颜色推断本次操作的阳性突变 率，具体计算公式如下：
KM101 （20 rxn）
30 μl 200 μl 20 μl 40 μl 80 μl 20×50 μl
储存条件
收到本产品后， 请立即将FDM competent cells置于-70℃条件下保存，试剂盒其他组分 置于-20℃条件下保存。感受态细胞可在-70℃条件下保存3个月，试剂盒其他组分可在-20℃ 条件下保存1年。
浓缩国际权威精华， 铸就TIANGEN优秀品质！
TIANGEN为您提供国际化标准的生物学产品和服务
■ PCR、RT-PCR系列 ■ 核酸DNA、RNA分离纯化系列 ■ DNA分子量标准 ■ 克隆载体、感受态细胞 ■ 细胞生物学产品 ■ 蛋白分子量标准 ■ 蛋白质染色、检测及定量相关产品
版本号: KM131204
呈蓝色的菌落数(cfu)
突变率=
×100%
平板上所有的菌落数(cfu)
注意：对于突变实验而言，需要通过测序来最终验证突变是否成功，及突变位点以外的 碱基未发生改变。
常见问题及解决办法
1、转化效率低或菌落数少 原因
反应体系中扩增出的突变 质粒量不足
PCR反应体系中模板 质粒量不足
解决办法
增加转化体系的量至10 μl。 将模板质粒进行琼脂糖凝胶电泳及定量分析， 以确定质粒的质量和浓度是否符合试剂盒要求。
3、实验组突变率低或者菌落数少
原因 PCR程序不适宜 反应体系混合不均匀 加入Dpn I后未混匀充分
转化体系中质粒 模板过剩
5×PCR反应Buffer 反复冻融
解决办法 确定PCR程序适宜实验组要求，并用确定后的程序再进
行一次对照组实验以彻底排除PCR程序的影响。 用移液器轻轻吸打将反应体系混合混匀。
试剂盒特点
1、简便快速：试剂盒采用非链取代式质粒扩增技术，只需4步即可实现由非突变菌株到突变 菌株的转变，而不需要多轮PCR及亚克隆等耗时耗力的步骤。
2、高效引物：试剂盒采用部分重叠的引物设计原则，可以扩增得到更多的突变质粒。 3、应用广泛：本试剂盒不但可进行单点突变，还可以进行多点突变，且突变点数可达5个。 4、适应性强：本试剂盒最大可对10 kb的质粒进行定点突变，基本覆盖所有常用质粒。 5、突变率高：本试剂盒具有体外和体内双重消化甲基化质粒模板的功能，可以保证更高的
对本试剂盒而言，应在氨苄抗性的平板上，涂布20 μl 0.2 M的IPTG和40 μl 40 mg/ml的X-gal，才能 保证阳性突变株的菌落变为蓝色。
此Buffer中含有dNTP等容易降解的成分，反复冻 融会加速这些物质的降解，因此，在实际操作中应尽量
避免对5×PCR反应Buffer的反复冻融。
PCR反应
补充延伸
循环 1×
18×
1×
温度 95℃ 94℃ 55℃ 68℃ 68℃
时间 2 min 20 sec 10 sec 2.5 min 5 min
二、质粒模板的消化
1、按照下表所述配制酶切体系： 组成成分
PCR产物 Dpn I restriction enzyme （20 U/μl） Total Volume 2、充分混匀后，将上述酶切体系于37℃条件下消化1 h。
8
本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
产品简介
体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，多用于改造、 优化目的基因；探索启动子的调节位点；以及研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系。本试 剂盒采用目前领先技术，可在目标载体上直接对靶基因进行单点突变，多点突变及插入或缺 失突变，并且单点突变的突变率可达90%以上。另外，与以往的突变试剂盒需要多轮PCR及 亚克隆等耗时耗力的步骤不同，本试剂盒的操作更为简便，从未突变菌株到突变菌株的构建 只需要4步（如图1所示）。
51 μl 体系 50 μl 1.0 μl 51 μl
内容 预变性 变性 退火 延伸 补充延伸
终浓度 -
0.4 U/μl -
三、转化宿主菌
注：此转化流程为通用流程，可用于实验组及对照组。 1、从-70℃冰箱中取出1支FDM感受态细胞置于冰上解冻。 2、感受态细胞解冻后，加入5 μl Dpn I 消化产物（在感受态细胞刚刚解冻时加入产物），继 续冰浴30 min。 3、42℃准确热激90 sec，立即置于冰上2 min。 4、加入350 μl无菌的SOC或LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养 45～60 min（150转/分钟），使菌体复苏。 5、孵育结束后，将离心管内菌液混匀，并将所有菌液涂布到含相应抗生素的LB固体琼脂培 养基上，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12~16 h。 6、待菌落长出后，进行突变克隆筛选。
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