第2章 生产菌种的来源

诱饵法
2.2
菌种的分离
2．2．1 施加选择性压力分离法
在自然界获得的标本,是很多种类微生物的
混杂物,一般采用平板划线或平板稀释法进行纯
种分离。但大多数采集的样品中，所需微生物并
不一定是优势菌或数量有限。
为了增加分离成功率，可通过富集培养增加
待分离菌的数量。
富集培养
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖
诺卡氏菌 游动放线菌属 小瓶菌属 角质菌属
处理方法 加热，55℃，6分钟
100℃，1h或40℃， 2—6h 膜过滤法 离心法 空气搅拌法
土壤、根土 水 海水、污泥 发霉的稻草
化学方法
含1%几丁质培养基 用CaCO3提高pH进 行培养
用涂石蜡的棒置于碳 源培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
2.2.2.4 抗病毒药物产生菌的分离
• 由于病毒增殖是在细胞内，药剂难以达到。利用 作用于核酸的方法筛选得到的药物毒性高。
– 如利用鸡胚线维芽细胞的噬菌斑形成法，发现了抗病 毒的壳二孢氯素（Ascochlorin）和衣霉素 （Tunicamycin）。 – 用小平板测定由病毒引起的细胞变性效果（CPE）也 是一种有用的筛选方法。 – 检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶 抑制剂，也是一种选择性更高的筛选方法。
• 一般认为能作用于细胞表面酶的物质，可能具有 免疫修饰作用。 • 因此以存在于细胞表面的氨基肽酶B，白氨酸氨 基肽酶，氨基肽酶A，碱性磷酸脂酶为靶性物质， 研究了这些酶的抑制剂，发现抑制这些酶，会增 强细胞性免疫或抗体产生能力。 • 这说明可以用细胞表面酶的抑制法，筛选免疫激 活剂产生菌（见书p21）。
细菌菌种筛选的原则
在什么地方、如何筛选产生新的生物活性
物质的微生物呢？关键在于要根据生产实际 需要，目的代谢产物的性质，可能产生所需 产物微生物菌种的分类地位，这类微生物分 布、特性以及生态环境等，设计选择性高的 分离筛选方法，才能快速从可能的环境和混 杂的多种微生物中获得所需菌种。
一般菌种分离纯化和筛选步骤如下:
2、恒化富集式培养技术：
是通过改变限制性基质的浓度，来控制两类不 同菌株的比生长速率。
A
比 生 长 速 率 m
B
-----------------------------------------------n
基质浓度
图2-1 基质浓度对A、B两种不同的菌种比生长速率的影响
2．2．2 随机分离方法 2.2.2.1 抗生素产生菌的分离 • 尽管目前已发现了大量的抗生素，并且也 开展了多种抗生素的半合成生产，但发现 新的抗生素仍然极具吸引力。 • 筛选抗生素产生菌的方法包括
1、分批式富集培养(摇瓶培养)
2、恒化富集式培养(连续培养)两种方式。
1、分批式富集培养：
是指将富集培养物转移到新的同一种培养
基中,重新建立选择性压力,如此重新转种几
次后,再取此富集培养物接种到固体培养基上,
以获得单菌落。
在这种分批式富集培养中，转种的时间是
关键，应在所需菌种占优势情况下转种。
摇床培养
2.2.2.3 酶抑制剂产生菌的分离
• 酶抑制剂在酶催化机理，生化代谢中至关重要， 直接与生理机能和病理有关，因此是重要的临床 药物。 • 从微生物的代谢产物中筛选酶抑制剂的原理是， 如果某种化合物能在体外抑制某种关键的人体酶， 它就可能在体内有药理作用。 • 酶抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理 关系明确的酶为靶酶进行筛选。 • 表2-5给出了一些基于酶靶的药理活性物质筛选的 例子。
• 在临床上有效的抗肿瘤药物大部分是直接 作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质。
– 由于从微生物到人类的核酸结构和生物合成方 式有许多共同之处，因此大部分抗肿瘤药物也 会具有抗菌或抗真菌活性。 – 目前发展出利用微生物筛选作用于DNA的抗肿 瘤药物的方法，具有高灵敏度和简便快速的特 点（见书p19－20）。
– 抗体等建立起来的高灵敏度、专一的筛选技术 （见书p18－19）。
2.2.2.2 抗肿瘤药物产生菌的分离
目前抗肿瘤药物放线菌素、阿德里亚 (阿)霉素、博莱霉素、光神霉素、丝裂霉 素、内瘤霉素、满霉素、长春霉素、5氟尿嘧啶等已在临床上广泛使用，但其
疗效并不明显，寻找新的高效、低毒的
抗肿瘤药物仍是人们追求的目标。
2．1．3 标本的预处理 在分离之前，含微生物材料的标 本首先进行预处理，可大大提高菌 种分离的效率。 含微生物材料的标本预处理方法 见P10表( 2-1)
表2-1
方 法 物理方法
含微生物材料的标本预处理方法
材 料 水、土壤、粪肥 分离出的菌株 嗜粪红球菌 （Rhodococcus coprophilus）、小单孢 菌属等 链霉菌属、马杜拉菌属、 小双孢菌属等 小单孢菌属、内孢高温 放线菌等 链霉菌属 嗜热放线菌等 链霉菌属 链霉菌属
2.2.2.5 生长因子产生菌的分离
• 生长因子如氨基酸和核苷酸的产生不能作 为分离中的选择压力，也可以用随机分离 法进行初筛，然后通过进一步的检测得到 产生菌。 • 其方法主要是通过观察分离菌能否促进营 养缺陷型菌株的生长来检出生长因子产生 菌（见书p20－21）。
2.2.2.6 免疫激活剂产生菌的分离
标本采集→标本材料的预处理→富 集培养→菌种初筛→菌种复筛→性能 鉴定→菌种保藏。 以上许多步骤都可以引入选择压力，
以提高筛选的效率。
2．1．2 含微生物材料的标本采集
采集标本遵循的原则： 材料的别是极端环境的材料。 极端环境：高温、低温、高盐、高酸、
高碱、海洋等。
§ 2．生产菌种的来源
微生物工程的工业生产水平由三个要素所 决定，即生产菌种的性能，发酵及提纯工艺 条件和生产设备。
其中第一步也就是优良的菌种是最重要的。 生产上有用的菌种，最初都是来源于自然界， 如土壤、空气、江、河、湖、海等各种自然 环境。人类通过数千年的知识积累和科学研 究，已经发明创造了许多行之有效筛选有用 菌种的方法。
– 抑菌圈法 – 稀释法 – 扩散法 – 生物自显影法等。
• 在这些方法中，试验菌的选择是成功 的关键，它直接与检出的灵敏性、抗 菌素的活性和抗菌谱有关。
• 除使用高灵敏度的试验菌外，采用专一性 很强的筛选技术也可检出新的抗生素。
– 主要是利用与抗生素作用机理相关的酶、 – 酶抑制剂、
– 激活剂、
2.1
生物物质产生菌的筛选
2.1.1 微生物是生物活性物质的丰富资源
微生物是地球上分布最广泛、物种最丰富的 生物种群，种类之多，至今是一个难以估计的 未知数。它们除了能生活在动物、植物可以生 长的环境中外，还可以生活在动物、植物不能 生长的环境中。为适应环境对它们生存造成的 压力，它们进化出许多特殊的生理活性物质。 所以微生物过去、现在以及将来都是人类获取 生物活性物质的丰富资源。
2.2.2.7 多糖产生菌的分离
• 曾从各种环境中分离到多糖产生菌，但一 般认为制糖工业、食品加工厂等污水中可 能含有较多的多糖产生菌，并且这类菌的 菌落外观一般比较粘稠，可以通过菌落外 观的观察来识别。
对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透 使之利于某种微生物生长，而不利于其他种类 微生物的生存，以达到使目的菌钟占优势，而 得以快速分离纯化的目的。这种方法叫施加选 择性压力分离法。
压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，
施加选择性压力分离法举例见P11（表2-2、
表2-3）。
施加选择性压力分离培养方法可采用：