生物样品前处理方法资料
生物样品预处理技术
取500g有代表性的猪肉可食部分，用组织捣碎机充 分捣碎均匀；
样品均匀化
取2g 捣碎样品，加入8ml乙酸钠缓冲液(pH=5.2)，再
• 固相萃取
• • • • • • • 操作： 活化 上样 淋洗 洗脱 收集 直接进样或者 浓缩后进样 与色谱理论相同
二、生物样品预处理方法
二、生物样品预处理方法
• 采用离心或者抽真空 的办法，以一定离心 力或者流速，进行上 样、淋洗和洗脱
二、生物样品预处理方法
• 固相萃取的优点：
• 无乳化现象 • 使用溶剂安全价格低廉
有机强酸
季铵碱、盐
有机酸、酚类
示例 不同生物样品中虎杖苷预处理方法
• A：虎杖苷标准对照品 由海王集团技术中心天然药物室提供 批号：03050803 • 3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-葡萄糖苷 Mr390 • • B：二苯乙烯苷化学对照品 由中国药品生物制品检定所提供 • 2，3，5，4‘-四羟基二苯乙烯-β-D-葡萄糖苷 Mr406
• 萃取效率高
• 处理速度快，具有一定通量 • 易于同时萃取出目标药物及其代谢产物，包括极性 强的Ⅱ相代谢产物
• MCX固相萃取柱 • 反相作用和阳离子交换 作用
• 酸性环境中含氮碱性基 团与磺酸基结合 • 酸性药物呈分子状态发 生反相结合作用
对有机碱: 对有机酸、酚类 对有机强酸 对季铵碱、盐 pKa 2-8 pKa 2-10 pKa <1.0 pKa >10 选择 Oasis® MCX 选择 Oasis® WAX 选择 Oasis® WCX 选择 Oasis® MAX
• 储存条件
–20℃：大部分药物 –80℃：阿莫西林等抗生素 加稳定剂：卡托普利等
生物样品前处理方法
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生物样品前处理的考虑因素
▲药物的理化性质和存在形式 ▲待测药物的浓度范围 ▲选用的生物样品类型
▲样品预处理与分析技术的关系
▲药物测定的目的
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生物样品前处理-有机破坏法
▲湿法破坏
硝酸-高氯酸法、电热消化器法、电热板消化法、烘箱消化 法。
▲干法破坏
高温电阻炉灰化法、低温等离子灰化法。
中某些组分，再用适当溶剂冲出杂质。 然后用少量溶剂洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目 的。
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法适用范围
大多数液体生物样品的前处理（如血浆、尿等）。
固体、半固体样品经过处理后也可使用SPE进行分离。
▲固相萃取法操作步骤
活化：根据所选择固定相的类型使用相应的活化溶剂
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生物样品前处理-固相萃取法
▲固相萃取法简介
固相萃取技术（SPE）是从上世纪八十年代中期发展起
来的，广泛运用于医学、制药、环境、食品等领域。 固相萃取法（SPE）就是用固体物质作为萃取剂，采用 高效、高选择性的固定相，进行萃取的样品预处理技术。
▲固相萃取法原理
以吸附剂为固定相，当液体样品通过固定相时，保留其
▲ 沉淀蛋白法优点
操作简便易行
▲ 沉淀蛋白法缺点
此法仅除去了蛋白质，内源性杂质并没有除去。
运用此法处理后的样品浓度会被稀释，不利于检测。
。 此法所得样品不能用光谱法检测。
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生物样品前处理-液液萃取法
▲液液萃取法简介
多数药物是亲脂性的，在适当的有机溶剂中的溶解度大于在水 相中的溶解度，而生物样品中的大多数内源性杂质是强极性 的水溶性物质。因而用有机溶剂萃取一次即可除去大部分杂 质。
生物样品前处理
[5]胡小刚,李攻科.分子印迹技术在样品前处理中的应用[J].分析化学.2006,(34)7: 1035-1041
[6]张丽华，肖国平，宋游.微波技术在生物样品预处理中的应用[J].基础和应用基础研究与放射化学与核化学:133
2.对于在常温下需要长时间反应的样品，可将准备好的样品放置过夜，第2天再放进消解炉消解。
3.对于预处理时间长的难处理样品，也可采用放过夜的方法，第2天再进行消解处理。样品经过处理后，若溶液体积小于5ml时，则必须补加水或酸，使其体积不小于5ml，然后再进行微波消解。
总之,生物样品的预处理因其多样、复杂而成为整个检测过程中的关键环节。所述各种处理方法各有其特点,根据化合物的物理化学性质选择合适的前处理方法是取得满意检测结果的必要条件。
[1]周婷婷,范国荣,吴玉田.超临界流体萃取法在生物样品前处理中的应用[J].药学学报.2004 ,39(4) :317 – 320
[2]张颖.生物样品预处理技术及应用进展[J].天津药学,2006, 18(1):56-58
[3]李向阳，杨梅，彭宝珠.固相微萃取在生物药物分析中的应用[J].2002,23(4):69-71
目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中,印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列,以非共价键形成多重作用位点,这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有:氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等,其中以氢键应用最为广泛[5]。
分子印迹聚合物(molecularly imp rinted polymer, MIP)制备简单,能够反复使用,机械强度较高,稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物,以达到分离净化和富集的目的。
药物分析中的生物样品前处理方法研究
药物分析中的生物样品前处理方法研究近年来，随着生物医药领域的快速发展，药物分析在疾病的诊断和治疗中扮演着至关重要的角色。
为了获得准确可靠的分析结果，生物样品的前处理方法显得尤为重要。
本文将探讨药物分析中常用的生物样品前处理方法的研究进展。
一、血液样品的前处理方法研究血液样品作为一种常见的生物样品，在药物分析中扮演着重要的角色。
然而，血液样品中存在着各种成分的干扰，如蛋白质、血红蛋白等。
因此，研究人员提出了多种前处理方法来解决这些问题。
1. 血浆/血清的蛋白质沉淀方法血浆/血清中的蛋白质是最常见的干扰物之一。
为了降低蛋白质对分析结果的影响，研究人员开发了各种蛋白质沉淀方法。
例如，酸沉淀法可以通过改变pH值使蛋白质凝聚沉淀，从而去除蛋白质干扰。
此外，还有醇沉淀法、有机溶剂沉淀法等。
2. 血浆/血清的固相萃取方法固相萃取方法是血液样品前处理中常用的技术之一。
其原理是利用吸附剂对目标化合物进行特异性吸附，从而去除干扰物。
通过选择合适的吸附剂，可以实现对特定成分的富集。
例如，固相萃取柱常用于血浆/血清样品中药物的富集与净化。
二、尿液样品的前处理方法研究尿液样品常用于药物代谢和排泄的研究，但由于其复杂的成分和高度变异性，前处理方法显得尤为重要。
1. 尿液样品的前处理方法选择尿液样品前处理的关键是选择合适的方法。
常见的前处理方法包括尿液蛋白质去除、有机溶剂浓缩、尿液稀释等。
根据具体的分析需求和目标物质的特性，选择恰当的前处理方法可以显著提高分析结果的准确性和灵敏度。
2. 尿液样品的固相萃取方法研究固相萃取也是尿液样品前处理中常用的技术之一。
通过选择适当的吸附剂和前处理条件，可以有效地去除尿液中的杂质，提高目标物质的测量灵敏度。
例如，固相萃取柱结合气相色谱-质谱联用技术可以用于尿液样品中药物代谢产物的研究。
三、其他生物样品的前处理方法研究除了血液和尿液样品，还有其他生物样品在药物分析中的应用。
例如，头发样品被广泛用于毒品滥用的检测。
生物样本样品前处理
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常用液液提取溶剂
溶剂名称 二氯甲烷 乙酸乙酯 氯代正丁烷
乙醚 戊烷 环己烷 正己烷 甲苯 异丙醇* 四氢呋喃* 乙腈* 正丁醇* 水*
分子量 84.9 88.1 92.6 74.1 72.2 84.2 86.2 92.2 60.1 72.1 41.1 74.1 18.0
注：“*”表示与水互溶
沸点（℃） 40
5、固相萃取法：可实现自动化，基质效应降低，同时完成样品的富
集与净化；但成本较高
3
液液提取法
利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配 系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中。
➢两相的分离需借助两相的密度差来实现
➢原理：相似相溶
➢分配系数：kA=yA/xA yA和xA分别表示在萃取相和萃余相中的质量比率
常见表面活性剂：Triton-X-100，吐温等
Tips
1、表面活性剂需确立一个浓度范围而不是单一浓度。 2、样本已经采集，考虑将待测物从容器中解离出来。
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讨论和问题
Thank you!
15
0.08 0.36 1.66 1.63 3.92 1.50 1.84
5
固相提取法
◇HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的优点
△水可浸润 △反相保留 △PH1-14范围内稳定 △没有裸露硅羟基
6
固相提取法
7
固相提取法
8
固相提取法
改变化合物PH，酸性 保留，碱性洗脱
77.1 77
34.5 36.1 80.7
69 110.6 82.4
66 81.6 117 100
密度（g/mL) 1.33 0.90 0.89 0.71 0.63 0.78 0.66 0.87 0.79 0.89 0.78 1.00 1.00
透射电镜生物样品前处理步骤
电镜样品制备步骤1、取材：放入2.5%戊二醛溶液中固定2-4h(4℃可保存1-2周，冷冻可保存2年)注：不可用自来水冲洗，被钳、镊夹取造成机械损伤的组织不可部分可取较大面积，但厚度必须小于1mm（戊二醛固定能力小于0.5mm）2、漂洗：牙签取出样品至新的1.5ml离心管，用0.1M pH7.0磷酸缓冲液（PBS）漂洗样品三次（摇床），每次15min3、锇酸固定与再漂洗：1%锇酸溶液固定样品1-2h（临用前计算用量≤50ul/样，用0.1M PBS将2%锇酸稀释至1%，通风橱操作），吸出固定液，用0.1M pH7.0 PBS漂洗样品三次，每次15min注：漂洗以清除固定液，避免产生沉淀物干扰结构观察4、脱水剂梯度脱水：用梯度浓度（50%，70%，80%，90%和95%）乙醇溶液对样品进行脱水处理，每个浓度处理15min再用100%乙醇处理20min （乙醇细胞内抽提少，但与包埋剂相容性差）最后用纯丙酮处理20min（若包埋剂为Epon改用环氧乙烷置换）注：脱水以清除游离水以便包埋剂均匀渗透；脱水剂易吸收空气中水分，密封，置换时应该迅速由低到高逐级脱水而不能急剧脱水，更换溶液时应迅速，以免组织内外产生气泡。
5、包埋剂梯度渗透：①用包埋剂丙酮混合液（V/V=1/1）处理样品1h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)②用包埋剂丙酮混合液（V/V=3/1）处理样品3h：计算用量80ul/样再配制(参考样品大小)③纯包埋剂渗透样品过夜：将样品移至干燥的新离心管中，常温过夜(所用器具均应干燥)注：样品周围不能有气泡6、加热聚合：牙签取出经渗透处理的样品至0.5ml干燥离心管（预先装入约300ul包埋剂），加热聚合仪70℃加热过夜。
7、莱卡EM UC 7超薄切片仪修快、切片（50-70nm）8、正染色：塑料包埋模具（刀划几道缝隙），染色时温度低影响染色效果，冬天空调醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液100ul染色（15min-1h），双蒸水冲洗柠檬酸铅100ul染色15min（极易吸收空气中CO2产生PbCO3,染色时毋对着说话、呼吸，同时放置数块NaOH）9、日立H-7650透射电镜观察spurr包埋剂配制：ERL 2.5gNSA 5.2 g 混合均匀后再加入催化剂DMAE，搅拌30min；低温干燥保存DER 2.5 gDMAE 0.1g宜新鲜配制但由于使用期限长(3-4天)，混合物可在使用前一天制备。
生物材料样品预处理
了解有机物和无机物的区别： • 有机化合物一般是共价化合物,以C原子为骨架连接其他元素的原子,形成的化合物如 CH3CH2OH（乙醇）；无机化合物一般没有这些特征,即使含C元素,也不是有机物，如 CO、CO2 • 无机物是无机化合物的简称，通常指不含碳元素的化合物。少数含碳的化合物，如一 氧化碳、二氧化碳、碳酸盐、氰化物等也属于无机物。无机物大致可分为氧化物、酸、 碱、盐等 • 有机物一般难溶于水，易溶于有机溶剂，熔点较低。绝大多数有机物受热容易分解、
•
常见无机物：金属、盐类
一、无机元素分析的样品预处理
*预处理目的（掌握）P9
提取、净化和浓缩被测元素或破坏样品中的有机物，释放 出被测元素，以利于后续测定（测定前排除干扰组分， 对样品进行浓缩） *选择预处理方法时满足一下基本要求（了解）P10
1、避免待测元素损失及污染 2、尽可能减少化学试剂的用量 3、操作简便，省时 4、待测组分回收率达到分析要求 5、操作过程安全性高
容易燃烧。
• 无机物与有机物在性质及反应上的差别只是相对的、有条件的，不同的有机物有其特 殊的性质。例如，乙醇、乙酸、乙醛、丙酮能与水以任意比互溶；四氯化碳、二氟二
溴甲烷等有机物不但不能燃烧，反而可以用来灭火；乙酸及其金属盐能在水溶液中电
离 • 常见有机物：醋、油、酒、糖、蛋白质 、脂质 、核酸 、汽油
(三）矿物化法（掌握）
破坏生物样品中有机物 的方法
*1、干灰化 定义：在供给能量的前 提下直接利用氧来氧 化分解样品中有机物 的方法（掌握） 步骤：干燥、炭化、灰 化、溶解灰
*2、湿消化法
定义：利用氧化性酸和 氧化剂对有机物进行 氧化，以分解破坏有 机物（掌握） 常用的氧化性酸和氧化 剂：H2SO4 HNO3 HClO4 H2O2
生物实验样品预处理
样品预处理4.1.5.1准备工作若必要时将冷冻样在冰箱（-2-4C）中放置过夜，使部分解冻以便切片。
用合成洗涤剂清洗塑料刀、碟、镊子、塑料板及尺和称重塑料膜，用蒸馏水或清洁海水漂洗干净。
工作台用洗净的塑料膜罩上。
用合成洗涤剂(4.1.2-2)仔细地洗手，后用蒸馏水或漂洗干净。
PF一胸鳍；DF一脊鳍，虚线表示刀切位置图3鱼体简图中小型鱼样制备4.1.5.4.1单个体样品：测量鱼的叉长，并于聚乙烯称样膜上称重。
记下叉长和体重。
用蒸馏水或清洁表层海水（4.1.2.1)洗涤鱼样，将它放在工作台上，用塑料刀切除胸鳍并切开背鳍附近自头至尾部的鱼皮（图3),在鳃附近和尾部，横过鱼体各切一刀；在腹部，鳃和尾部两侧各切一刀。
四刀只切在鱼体一侧，且不得切太深，以免切开内脏，沾污肉片。
最好在切片时，由另一人帮助按住鱼的头尾。
用镊子将鱼皮与肉片分离，谨防外表皮沾污肉片。
用另一把塑料刀将肌肉与脊椎分离，并用镊子取下肌肉。
将组织盛于塑料容器中，称重并记录重量。
若一侧的肌肉量不能满足分析用量，取另一侧肌肉补充。
盖紧容器，贴上标签或记号，记录各所有数据，于低温冰箱中保存。
鉴定性腺性别。
4.1.5.4.2多个体试样：制备方法如下。
仔细记下各个体体长、鲜重、肌肉重。
鉴定性别。
个体数不应少于6个，且性别应相同，大小相近。
用匀浆器匀化鱼组织，将匀浆转入已知重量的塑料容器中，盖紧，贴上标签并称重，记下匀浆重和其他数据。
置于低温冰箱中存放。
干样制备将部分新鲜试样按4.1.6.1或4.1.6.2步骤烘干，计算干／湿比，以校正水分含量。
干燥后的样品用玛脑研钵磨碎，全部筛过80-100目（尼龙筛），供痕量元素分析用。
4.1．6干重测定41.6.1烘干半开称量瓶的磨口盖，放入105℃烘箱中。
2h后，取出称量瓶，置于干燥器中冷却30min. 盖好瓶盖，用分析天平称重，记下重量。
取5^10g生物制备样（4.1.5)于称量瓶中，盖好瓶盖，再称重（士0.5mg）并记下重量。
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溶解度、沸点低、无 毒、与水不溶：乙酸 乙酯、乙醚（1.2%水）
有机溶剂 (1、2)
碱； 亲脂性的
碱性药物于碱性； 酸性药物于酸性。
药物
内源性杂质
酸性； 水溶性
生物样品（水溶）(1)
乳化现象：加固体NaCl；离心；低温冰箱中快速冻凝 对于极性大的药物：离子对提取法；提取烷基化法
2、固相萃取法 (solid phase extraction, SPE)
离心分离，取上清液作为样品。注意采用 超速离心 （12000rpm）分离1～2min
2、加入中性盐
原理：中性盐使蛋白质脱水而沉淀 常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐 及枸 橼酸盐等 试剂用量：饱和硫酸铵与血清比例为2︰1 操作：样品与中性盐按一定比例混合后超速离心 （10000rpm）分离1～2min，取上清液作为样品。上清液 pH 7.0～7.7。
1. 柱预处理 2. 进样 3. 净化 4. 洗脱
泵
SPE技术—填料颗粒基质
硅胶基质—键合各种官能团 如，{C18, C8, NH2, QMA ...} 不规则填料 小柱(Cartridges)： 40 - 80 m Disks：8 -10m
活性碳(AC2) 表面衍生剂涂层 (DNPH) 聚合物基质 (最新技术) — Oasis
样品前处理原则
①制备过程中避免组分发生化学变化； ②要防止和避免欲测定组分的沾污； ③尽可能减少无关化合物引入制备过程； ④尽可能简单易行。
动物细胞的破碎
机械法：挤压或剪切；研磨；高压匀浆 法；超声波破碎法等
非机械法：酶消化法；化学渗透法；冻 融法；干燥法等
使用某些试剂，改变细 胞膜通透性，使药物释 放出来
为何需要样品前处理?
Collection Analysis
6%
6%
Data Management
27%
样品前处理所消耗时间
Sample Processing
61%
60%以上的工作和费用花费在样品前处理上 三个目的:
➢ 除去样品基质中的干扰物 ➢ 富集组分 ➢ 增强仪器的性能
对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器, 适当的样品前处理对于减少基 质干扰和富集组分至关重要！
球形填料 30/60m
SPE填料的类型
正相填料 溶剂：正己烷 填料：硅胶（ Silica ）氧化铝, Florisil®, 氨基, 二醇基…
反相填料 溶剂：MeOH/水 填料：C18/C8/Oasis HLB
离子交换填料 溶剂：缓冲液/盐流动相 填料：Accell CM/Accell QMA/Oasis MCX/MAX/WAX/WCX
原理：不同填料作固定相的微型小柱，当含有药物的生物样 品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和 力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂 质后，再用适当溶剂洗脱药物。
亲脂型—大孔吸附树脂，亲脂型键和硅胶 规格 亲水型—硅胶，硅藻土，棉纤维
离子交换型
固相萃取法 SPE
固相提取步骤示意图：
4、 酶水解法
测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物 枯草菌溶素：使组织溶解，使药物析出。
β-葡萄糖醛酸苷酶; 蛋白酶
一种细菌性碱性蛋白分解酶，可在较宽的pH活圈 （pH7.0～11.0）内使蛋白质的肽键降解，在50～60℃具有最大 活力。
优点：可避兔某些药物在酸及高温下降解，对与蛋白质结合牢 的药物（如保泰松、苯妥英纳），可显著改善回收率；可用有 机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象。
不适用于在碱性下易水解的药物。
缀合物的水解
葡萄
糖醛
硫
酸
酸
由于缀合物较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取， 所以：
酸水解可加入适量的盐酸液。 酶水解对于遇酸及受热不稳定的药物，常用
葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶或两者的混合酶
三、分离、纯化和浓缩
1、液-液萃取法 Liquid liquid extraction,LLE
表面活性剂：对某些组分有增溶作用，有助于细
胞破碎。
EDTA螯合剂：与生物膜中Ca2+、Mg2+ 结合，
破坏原有结构。
有机溶剂：高级醇、氯仿、苯等，与和平利用膜
类脂质相溶，破坏生物膜。
变性剂：与水中氢键作用减弱水的极性，使疏水
性化合物溶于水。
组织捣碎机
二、前处理方法－－去蛋白
1.去除蛋白质
生物样品前处理方法
content
生物样品前处理目的 生物样品前处理方法 纯化、富集方法 分析方法的限度要求
一、样品前处理的重要性
由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂, 碳水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析 目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的 麻烦,因此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分 析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。
3、加入强酸
原理：强酸与蛋白质形成不溶性盐而沉淀。 常用：10％三氯醋酸、6％高氯酸、5％偏磷酸等。 操作：样品与强酸的比例为1：0.6混合，离心（10000rpm）1～ 2min，即可。 上清液 pH 0～4，不适于酸性下分解的药物。 过量酸的排除：过量三氯醋酸可通过煮沸或乙醚提取除去；高 氯酸、偏磷酸等可用碳酸钾、醋酸钾或氢氧化钠等中和后加乙 醇使产生高氯酸钾（钠）沉淀被除去。
为何需要样品前处理?
Cablibration 9%
Instrument 8%
Integration 6%
Chromatography 7%
Sample Introduction
6%
Contamination 4%
Columns 11%
Sample Processing
30%
色谱分析的误 差来源
Operator 19%
2.缀合物水解
3.提取、富集 3.衍生化
4.衍生化
内源 性酸
蛋白质
药
加入中
蛋白质 药 性盐
蛋白质 药
溶剂解
加入强
法
药
加热
内源 酸
性酸
内源
加入性酸 重金 属盐
法
蛋白质
酶水解
药
超滤 法
法
1、溶剂解法
原理：使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变 化而使蛋白质凝聚 。
常用有机溶剂：乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃 试剂用量：溶剂体积与血样比为1～3︰ 1 操作：有机溶剂与血浆或血清按一定比例混合后
SPE各种填料
固定相
C18
反相
tC18 C8 tC2 Porapak R DX
Aminopropyl
Cyanopropyl