实验十薄层色谱和柱色谱教学教材
有机化学实验十柱色谱
实验十柱色谱一．实验目的：1. 学习柱色谱的原理及方法。
二．实验重点和难点：1.学习柱色谱的原理及方法。
实验类型：基础性实验学时：4学时三．实验装置和药品：主要实验仪器：色谱柱(或25mL碱式滴定管) 25mL锥形瓶普通漏斗玻璃棉或脱脂棉量筒试管电子天平烧杯主要化学试剂：石油醚（600C—900C）丙酮中性氧化铝(100--200目) 500g菠菜色素95%乙醇四．实验装置图：五．实验原理：图 1 柱色谱装置柱色谱法是色谱方法之一。
色谱法是分离、纯化和鉴定有机化合物的重要方法之一。
(一)色谱法的基本原理：是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能(即分配) 的不同，或其它亲和作用的性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
(二)色谱法的分类：1.根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附善谱、分配色谱、离子交换色谱、排阻色谱等。
2.根据操作条件的不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
(三)柱色谱原理：柱色谱是化合物在液相和固相之间的分配，属于固--液吸附层析。
图1就是一般柱色谱装置。
柱内装有”活性”固体(固定相) 如氧化铝或硅胶等。
液体样品从柱顶加入流经吸附柱时，即被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱溶剂冲洗。
由于固定相对各组分吸附能力不同，以不同速度沿柱下移，形成若干色带。
再用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分随溶剂首先流出，分别收集各组分，再逐个鉴定。
1.吸附剂：常用的吸附剂有：氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等。
吸附剂一般要经过纯化和活性处理。
选择吸附剂的首要条件是与被吸附物及展开剂均无化学作用。
吸附能力与颗粒大小有关。
颗粒太粗，流速快分离效果不好。
颗粒小，表面积大，吸附能力就高，但流速慢，因此应根据实际分离需要而定。
色谱用的氧化铝可分酸性、中性和碱性三种。
2.溶质的结构与吸附能力的关系：化合物的吸附能力与分子极性有关。
薄层色谱和柱色谱
制备色谱和分析色谱的比较
制备色谱 分离目的 色谱模型 仪器设备 分析色谱
单位时间内获得符合 获得混合物中各组分的信 纯度的物质量 息（定性定量） 非线性色谱 线性色谱 制备柱、高流量、大 高压稳流、高精度进样、 进样、低检测（高通 高灵敏检测（高重现性） 量）
2.制备薄层色谱
2.1制备薄层色谱法概述 2.2常规制备薄层色谱（PTLC）
点样工具：微量注射器；玻璃毛细管。 点样方法：液体直接点样法；固体添埋法。
样点式样：点型；线型；条型。
点样应注意的问题：
点样斑点的大小：一般点样斑点直径不大于 2mm；点样带应尽可能狭窄，以获 得更好的分离效果。如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方 2cm处 进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。 点样量：适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样量 过少，不易检出。0.25mm薄层，一般点样量为几微克～几百微克作定性分析； 2mm层厚，点样量可达几十毫克～几百毫克作制备。 点样位置：距底边约1~2cm的起始线上，点与点之间的距离一般为1~1.5cm。
单一溶剂的极性顺序为（从小到大）： 石油醚→环己烷→四氯化碳→三氯乙烯→苯→甲苯→二氯甲 烷→氯仿→乙醚→乙酸乙酯→乙酸甲酯→丙酮→正丙醇→甲 醇→吡啶→乙酸 混合溶剂的极性顺序（从小到大）： 苯∶氯仿（1+1）→ 环己烷∶乙酸乙酯（8+2）→氯仿∶丙 酮（ 95+5 ） → 苯∶丙酮（ 9+1 ） → 苯∶乙酸乙酯（ 8+2 ） → 氯仿∶乙醚（9+1）→苯∶甲醇（95+5） →苯∶乙醚（6+4） →环己烷∶乙酸乙酯（1+1）→氯仿∶乙醚（8+2）→氯仿∶ 甲醇（99+1）→苯∶甲醇（9+1）→氯仿∶丙酮（85+15）→ 苯∶ 乙 醚（ 4+6 ） → 苯∶ 乙酸乙酯 （ 1+1 ） → 氯仿∶ 甲醇 （ 95+5 ） → 氯仿∶丙酮（ 7+3 ） → 苯∶乙酸乙酯（ 3+7 ） → 苯∶乙醚（1+9） →乙醚∶甲醇（99+1） →乙酸乙酯∶甲醇 （99+1）→苯∶丙酮（1+1）→氯仿∶甲醇（9+1）
柱色谱和薄层色谱
3、显色
凡可用于纸色谱的显色剂都可用于薄层色谱。薄层色谱还可使用腐蚀性的显色剂如浓硫酸、
浓盐酸和浓磷酸等。对于含有荧光剂（硫化锌镉、硅酸锌、荧光黄）的薄层板在紫外光下观
察，展开后的有机化合物在亮的荧光背景上呈有色斑点。也可用卤素斑点试验法来使薄层色
3
谱斑点显色。本实验样品本身具有颜色，不必在荧光灯下观察。
3、鉴定化合物 在条件完全一致的情况，纯碎的化合物在薄层色谱或纸色谱中都呈现一定
的移
学 动距离，称比移值（Rf 值），所以利用色谱法可以鉴定化合物的纯度或确定两种性
大 质相似的化合物是否为同一物质。但影响比移值的因素很多，如薄层的厚度，吸附剂颗粒的
大小，酸碱性，活性等级，外界温度和展开剂纯度、组成、挥发性等。所以，要获得重现的
化 洗脱液。待蓝色色带分离出来后，最后用冰醋酸洗脱，分离出黄色的色带。 学 六、实验关键及注意事项：
1、点样时，各样点间距 1—1.5cm，样点直径应不超过 2mm，
大 2、柱层析时，柱子要致密紧实，无气泡。 昌 七、实验结果
偶氮苯的 Rf 值＝4.3cm/5.4cm＝0.796
南 苏丹Ⅲ的 Rf 值＝2.2cm/5.4cm＝0.407
薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一
滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其高度不超过 1cm。将点好的薄层板小心放入层
析缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，
尽快在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位置，计算 Rf 值。
实验名称:柱色谱、薄层色谱
一、实验目的
1、了解色谱法分离提纯有机化合物的基本原理和应用。 2、掌握柱层析、薄层层析的操作技术。
实验十-薄层色谱和柱色谱
实验十薄层色谱和柱色谱1.实验目的①了解薄层色谱和柱色谱的基本原理；②学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术2.实验原理①色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。
其基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
②薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品(几到几十微克，甚至0.01µg的分离。
此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
其可分为吸附色谱和分配色谱。
由于不同组分被固定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而形成了互相分离的斑点R f=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。
薄层色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂；硅胶G含煅石膏做粘合剂；硅胶HF-254含荧光物质，可在波长254nm紫外光下观察荧光；硅胶GF-254含有煅石膏和荧光剂。
薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。
薄层板的制备：简易平铺法，如称取约3g硅胶G，加入到67mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成均匀的糊状物(可铺78张载玻片)。
这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。
PTLC和柱色谱课件
作用是做粘合剂。其他粘合剂：煅石膏、淀粉等。
3.铺板
适宜的薄层吸附剂的厚度为0.5-2mm， 板的尺寸一般为20cm×20cm大约需要硅胶 的量为30克（经验值），所以PTLC常用来 分离毫克级的样品。
一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡， 使柱子变花， 可以利用加压过柱法在装柱时就可以有效 地解决这个问题， 而且可以使柱子很快装实。
随着科技的发展， 色谱法的技术也日 新月异， 但薄层色谱和柱色谱实验技术还 是比较简单和实用的， 每个科研工作者在 使用薄层色谱和柱色谱时， 可以根据自己 的实际情况来不断地摸索，不断地总结和 提高薄层色谱和柱色谱的实验技术。
甲醇可溶解硅胶及其中含有的一些杂质，因此，并不 适合用来洗脱，较合适的溶剂是丙酮、乙醇或氯仿。
四、常见问题及注意事项
1.板子裂口可能的原因：
（1）硅胶的比例太大 （2）板子未自然干透，就在烘箱中活化
（可用低温大约40度左右烘30分钟左右 再用进行活化） （3）CMC-Na中有絮状沉淀所致。
2.活化问题：
吸附色般情况下极性较大 的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不 易被硅胶吸附， 整个过程即是吸附、 解吸、 再吸附、 再解吸过程。
第一部分（硅胶）制备型薄层色谱(PTLC) 一、制板操作 二、点样操作 三、回收分离组分 四、常见问题及注意事项
10%硫酸乙醇溶液使大多数有机化合物产生有色斑点， 例如棕色，甚至于出现荧光。
0.05%荧光黄甲醇溶液是芳香族与杂环化合物的通用 显色剂。
• 专属性显色剂
第二部分（硅胶）柱色谱的操作问题
一、 装柱
柱色谱用的硅胶一般是200-300目， 称量硅胶时一般 称 30~70 倍于上样量， 如果极难分， 也可以用 100 倍量 以上的硅胶。
薄层色谱和柱层析ppt课件
氧化铝呈碱性，适用于碱性和中性物质的分离。
硅胶和氧化铝1：1量掺和使用，得中性吸附剂，或在制板 时加入稀酸或稀碱使其变性，或用酸性或碱性展开剂展开， 以改变硅胶或氧化铝原来的性质。
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（Ⅲ）样品的极性
物质的极性愈大，氧化铝和硅胶吸附愈牢，物质极性大小 如下：
饱和烃 < 不饱和烃 < 醚 < 酯 < 醛 < 酮 < 胺< 羟基化合物 < 酸和碱
性炭因吸附性太强和黑色，使应用受到限制。
（2）分配色谱对载体的要求
（Ⅰ）表面积大
（Ⅱ）在展开剂中不溶，与展开剂和样品组分不起化学反应或 分解作用
（Ⅲ）对样品组分无吸附性或吸附性弱
（Ⅳ）对固定液是惰性的
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常用的有纤维素和硅藻土。
实际工作中，吸附剂、载体等的选择，首先决定于样品成
（c）酸碱薄层板和pH缓冲薄层板：有些化合物在普通板上分 离不好时，可通过改变原来吸附剂的酸碱性，改善分离效果。 如在铺层时用稀酸（一般用1～4%的盐酸或0.1～0.25mol/L草 酸溶液）代替水制成酸性板，使生物碱形成离子对而分离。
（d）混合薄层板：两种不同吸附剂按一定比例混合，制板， 也可分段铺板，前段预处理，以吸附杂质，后段分离。
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（e）径向薄层板：径向板铺法与一般板不同，点样前按下法 处理：
刮去
刮去
用此板展开，可使Rf值相近的化合物得到较好的分离，且 灵敏度高。 （f）梯度薄层板：梯度是指由一种性质到另一种性质的变化。 梯度薄层与常规薄层不同，它显示出具有渐变的分离性能，如
柱色谱和薄层色谱实验
3、展开与显谱：
先将以环己烷：乙酸乙酯=6：1为展开 剂倒入方形染色缸中，加盖饱和5min，使 缸内充满展开剂蒸气。
然后迅速将薄板点样一端浸入展开剂 中，但样品点不可浸入，封盖。
约跑30min后，展开剂的前沿跑到薄板 的3/4时，将薄板取出，并用铅笔划出前沿， 晾干。确定斑点中心，测量，计算三个Rf 值。
由于吸附剂对不同组分有不同的 吸附能力，流动相也有不同的解吸能 力，因此，在流动相向前移动的过程 中，不同的组分移动不同的距离而形 成了互相分离的斑点。
三、实验步骤及注意事项：
（观看录像）
1、铺பைடு நூலகம்：
2、点样：
在离薄板底边约1cm处，用铅笔轻轻 地划一条线，并划上A，B两点，用毛细 管蘸取样品点于点上（A为苏丹Ⅲ溶液，B 为苏丹Ⅲ-偶氮苯混合液），风干，样点扩 散直径不得超过2~3mm。
实验十八 薄层色谱
一、目的与要求： 1、了解薄层色谱的基本原理及其一 般的操作技术。 2、学习用吸附薄层色谱法分离染料 混合物。
二、基本原理
薄层色谱可分为分配色谱和吸附色谱 本实验采用（固－液）吸附色谱。
固体吸附剂是在玻璃板上铺成均匀的 薄层，用毛细管将样品点在板的一端，把 板放在合适的流动相（展开剂）里，流动 相带着混合物组分以不同的速率沿板移动， 即组分被吸附剂不断地吸附，又被流动相 不断地解吸而向前移动。
薄层色谱 计算三个Rf值
注意事项：
1、因比色管中溶液为易挥发的苯，在点 完样后需把盖子盖上。点完样后，毛细 管应放回原试管中，不可放错。 2、点样时不可留下较深的洞穴。 3、一个方形染色缸中只可放入一块薄板。
实验 柱色谱
一、目的与要求：
1、了解柱色谱的基本原理及其一般 的操作技术。
实验十薄层色谱和柱色谱
实验十薄层色谱和柱色谱1.实验目的①了解薄层色谱和柱色谱的基本原理；②学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术2.实验原理①色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。
其基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
②薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品(几到几十微克，甚至µg的分离。
此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
其可分为吸附色谱和分配色谱。
由于不同组分被固定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而形成了互相分离的斑点R f=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。
薄层色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂；硅胶G含煅石膏做粘合剂；硅胶HF-254含荧光物质，可在波长254nm紫外光下观察荧光；硅胶GF-254含有煅石膏和荧光剂。
薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。
薄层板的制备：简易平铺法，如称取约3g硅胶G，加入到67mL %的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成均匀的糊状物(可铺78张载玻片)。
这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。
薄层色谱与柱色谱实验报告
薄层色谱与柱色谱实验报告薄层色谱与柱色谱实验报告引言：薄层色谱和柱色谱是常见的分离和分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
本实验旨在通过对两种色谱技术的实验比较，探讨它们的原理、优缺点以及适用范围。
一、薄层色谱实验1. 实验原理：薄层色谱是一种基于分子在固定相和流动相之间的分配行为进行分离的技术。
在薄层色谱实验中，我们将待分离的混合物在薄层平面上涂抹，并将其浸入流动相中，通过分子在固定相和流动相之间的分配行为，实现混合物的分离。
2. 实验步骤：首先，我们准备好薄层色谱板和待分离的混合物溶液。
然后，将薄层色谱板放入色谱槽中，使其与流动相接触。
接下来，将混合物溶液涂抹在薄层色谱板上，然后将其放入色谱槽中，使其与流动相接触。
最后，观察薄层色谱板上的色斑，并进行分析和比较。
3. 实验结果与讨论：通过观察薄层色谱板上的色斑，我们可以得到不同成分的迁移距离，并计算出它们的Rf值。
Rf值是指某一组分的迁移距离与流动相前进距离之比，是判断组分相对亲疏水性的重要指标。
通过比较不同组分的Rf值，我们可以得出它们的相对亲疏水性，从而实现混合物的分离和鉴定。
二、柱色谱实验1. 实验原理：柱色谱是一种基于分子在固定相和流动相之间的分配行为进行分离的技术。
在柱色谱实验中，我们将待分离的混合物通过柱装填有固定相的柱子，通过分子在固定相和流动相之间的分配行为，实现混合物的分离。
2. 实验步骤：首先，我们准备好柱子和待分离的混合物溶液。
然后，将混合物溶液注入柱子中，使其与固定相接触。
接下来，通过流动相的加入，使混合物在柱子中进行分离。
最后，观察柱子中的色斑，并进行分析和比较。
3. 实验结果与讨论：通过观察柱子中的色斑，我们可以得到不同成分的保留时间，并计算出它们的保留因子。
保留因子是指某一组分在固定相和流动相之间分配的程度，是判断组分在柱子中停留时间的重要指标。
通过比较不同组分的保留因子，我们可以得出它们的相对亲疏水性，从而实现混合物的分离和鉴定。
薄层色谱和柱色谱分离法
薄层色谱示意图
三、 仪器及试剂
硅胶薄板、展开缸、苏丹红乙醇溶液、间 硝基苯胺乙醇溶液、苏丹红间硝基苯胺混 合溶液、乙酸乙酯：石油醚（5:95）
四、薄层色谱实验步骤及说明
１．铺板 本实验直接使用购买的薄层硅胶板，每人一块 ２．点样 用毛细管点样，样点距玻璃板１cm，样点直径不超过２
点样及展开注意事项
1.一根点样管只能点一种样品，否则有交叉污 染。
2.样品点直径应不超过2 mm，距离薄层板底 部约1 cm，样品点之间间距约1~1.5 cm，展 开时薄层板底部浸入展开剂的高度约0.5 cm。 注意样品点决不能浸到展开剂中。
3.展开剂离薄层板上缘约1 cm时应停止走板， 取出晾干。不可使展开剂走到板的尽头。板取 出后要及时标记展开剂前沿，否则展开剂挥发 后难以确定。
柱色谱分离示意图
本次柱色谱实验
样品：苏丹红和间硝基苯胺混合溶液混 合物 10 滴
洗脱剂（流动相）：石油醚 : 乙酸乙酯 =95: 5（体积比）
湿法装柱
取色谱柱一根, 垂直装置，用锥形瓶作接收瓶。 关闭活塞，向柱中慢慢倒入洗脱剂和吸附剂，
打开活塞，用吸耳球轻轻敲打柱身下部，使其 填装紧密，控制流速约1滴/s，装至3/4时停止 加吸附剂。 待洗脱剂将干时，轻轻将滤纸放到吸附剂的上 方。
4.跟踪一些化学反应进程：可以利用薄层色谱 或纸色谱观察原料色点的逐步消失，以证明反 应完成与否。
常用洗脱剂的极性顺序
乙酸>吡啶>水>醇类（甲醇>乙醇>正丙醇） >丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯仿>二氯甲烷> 甲苯>环己烷>正己烷>石油醚
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实验十薄层色谱和柱色谱1.实验目的①了解薄层色谱和柱色谱的基本原理；②学习用薄层色谱和柱色谱分离、纯化有机化合物的技术2.实验原理①色谱法是分离、提纯和鉴定有机化合物的重要方法之一。
其基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该物质时进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。
流动的混合物溶液称为流动相；固定的物质称为固定相(可以是固体或液体)。
根据组分在固定相中的作用原理不同，可分为吸附色谱、分配色谱等。
吸附色谱常用氧化铝和硅胶作固定相；分配色谱中以硅胶、硅藻土和纤维素作为支持剂，以吸收较大量的液体作固定相，而支持剂本身不起分离作用。
根据操作条件不同，可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱、气相色谱及高效液相色谱等类型。
②薄层色谱：薄层色谱属于固-液吸附色谱，是一种微量的分离分析方法，具有设备简单、速度快、分离效果好、灵敏度高以及能使用腐蚀性显色剂等优点。
适用于小量样品(几到几十微克，甚至0.01µg的分离。
此法特别适用于挥发性较小或者在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
其可分为吸附色谱和分配色谱。
由于不同组分被固定相吸附程度不同，在流动相中溶解程度不同，因此，不同组分移动的距离不同，因而形成了互相分离的斑点R f=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层色谱常用的吸附剂或支持剂是硅胶或氧化铝。
薄层色谱用的硅胶分为硅胶H不含粘合剂；硅胶G含煅石膏做粘合剂；硅胶HF-254含荧光物质，可在波长254nm紫外光下观察荧光；硅胶GF-254含有煅石膏和荧光剂。
薄层色谱用的氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。
薄层板的制备：简易平铺法，如称取约3g硅胶G，加入到67mL 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液中，调成均匀的糊状物(可铺78张载玻片)。
这一步一定要将吸附剂逐渐加入到溶剂中，边加边搅拌；如果把溶剂加到吸附剂中，容易产生结块。
然后采用和倾斜法将糊状物涂布在干净的载玻片上，制成薄层板。
薄层板的活化：涂好的薄层板室温水平放置晾干后，放入烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。
硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105110℃活化30min。
氧化铝板在200220℃烘4h可得活性Ⅱ级的薄板。
150160℃烘4h 可得活性ⅢⅣ级的薄板。
薄层板的活性与含水量有关，其活性随含水量的增加而下降。
注意硅胶板活化时温度不能过高，否则硅醇基会相互脱水而失活。
活化后的薄层应放在干燥器内保存。
点样：将样品溶于低沸点溶剂(丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳)配成1%的溶液，用内径小于1mm管口平整的毛细管点样：用毛细管取样品溶液，在薄层板一端约1.0cm处，垂直地轻轻地接触到薄层上的吸附剂，样品溶液就可靠到薄层上。
在薄层色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。
样品太少，斑点不清楚，难以观察；样品量太多，往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，样点直径一般以24mm为宜。
同一薄层上的样点直径应一致。
另外点样要轻，不可刺破薄层。
展开：倾斜上升法：先将一定量展开剂放在色谱缸中，盖上缸盖，再将点好试样的薄层板样点一端朝下放入缸内，盖好缸盖，展开剂因毛细管效应而沿薄层上升，样品中组分随展开剂在薄层中以不同的速度自下而上移动而导致分离。
当展开剂前沿上升到样点上方810cm时取出薄层板，放平，铅笔标明溶剂前沿位置，冷风吹干溶剂。
显色：展开的薄层板上化合物斑点本身有颜色时，可直接观察。
若化合物本身无色，可在紫外灯下观察荧光斑点，也可用显色剂显色。
简单常用的显色剂是碘蒸气，广口瓶中放置少量碘晶体，使用时将薄层板放入，盖上瓶盖，密封瓶内的碘蒸气即可使大部分有机化合物显色(饱和烃与卤代烃除外)。
③柱色谱：原理与薄层色谱类似，常用的有吸附色谱和分配色谱两类。
吸附柱色谱通常在玻璃管中填入表面积很大的多孔性或粉状固体吸附剂。
当待分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。
当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂的亲和力大小分别形成若干色带。
再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或将柱吸干，挤出后按色带分割开，再用溶剂将各色带中的溶质萃取出来。
吸附剂：实验室常用氧化铝、硅胶作吸附剂。
吸附剂的选择一般要根据待分离的化合物类型而定。
例如硅胶的性能比较温和，属无定形多孔物质，略具酸性，适合于极性较大的物质分离；同时硅胶极性相对较小，适合于分离极性较大的化合物，如羧酸、醇、酯、酮、胺等。
而氧化铝极性较强，对于弱极性物质具有较强的吸附作用，适合于分离极性较弱的化合物。
酸性氧化铝适合于分离羧酸或氨基酸等酸性化合物；碱性氧化铝适合于分离胺；中性氧化铝则可用于分离中性化合物。
大多数吸附剂都能强烈地吸水，且水分易被其它化合物置换，因此吸附剂的活性降低。
因此吸附剂使用前一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。
对于吸附剂而言，粒度愈小表面积愈大，吸附能力就愈高，但颗粒愈小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。
溶质结构与吸附能力的关系：化合物的吸附性与它们的极性成正比，化合物分子中含有极性较大的基团时，吸附性也较强，各种化合物对氧化铝的吸附性按以下次序递减：酸和碱＞醇、胺、硫醇＞酯、醛、酮＞芳香族化合物＞卤代物、醚＞烯＞饱和烃溶剂：柱色谱分离中，洗脱剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各化合物的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。
但是必须注意，选择的洗脱剂极性不能大于样品中各组分的极性。
否则样品组分在柱色谱中移动过快，不能建立吸附-洗脱平衡，影响分离效果。
实际操作时，一般采用薄层色谱反复对比、选择柱色谱的洗脱剂。
能在薄层色谱上将样品中各组分完全分开，即可作柱色谱洗脱剂。
在有多种洗脱剂可选择时，一般选择目标组分Rf 值较大的洗脱剂。
一般来说，洗脱剂都需要采用混合溶剂，利用强极性和弱极性溶剂复配而成。
：硅胶和氧化铝作吸附剂的柱色谱，洗脱剂的洗脱能力有如下顺序：己烷和石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜三氯乙烯＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。
3.实验药品和仪器偶氮苯的苯溶液，苏丹II的苯溶液，苏丹III的苯溶液，乙醇，石油醚，亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液薄层板，色谱柱，漏斗，毛细管4.实验步骤①点样：在薄层板距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线，取毛细管插入样品溶液中，在一块板起点线上点偶氮苯、苏丹II、混合液三个样本点，在第二块板起点线上点偶氮苯、苏丹III、混合液，第三块板上点偶氮苯、未知样、混合液。
②在缸内配置乙醇和石油醚4:1的混合溶液作为展开剂，待样点干燥后，将薄层板放入展开。
观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm处取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，比较二者Rf值的大小。
③在色谱柱内依次加入0.5cm厚的石英砂、到柱高3/4处的氧化铝、0.5cm厚的石英砂，填装紧密。
将烧杯置于色谱柱下端，将乙醇加入色谱柱至没过表面。
当液面下降至氧化铝上端表面时，加入亚甲基蓝和荧光黄的混合溶液。
用乙醇淋洗保持湿润，直至观察到色层带的形成和分离，改用乙醇与水的混合溶液淋洗，分层明显后再换用水淋洗。
当亚甲基蓝带到达柱底时，立即换另一接收器，收集全部此色层带，然后换另一接收器收集荧光黄色层带。
5.实验注意事项①色谱柱填装的紧密与否，对分离效果很有影响。
若柱中气泡或各部分松紧不均时，会影响渗透速率和显色均匀。
但如果过分敲击，又会因为太紧密二流速太慢。
②为了保持色谱柱的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的。
否则当柱中溶剂或溶液流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显色的均一性。
6.实验数据记录与处理7.实验思考与讨论①在一定操作条件下为什么可利用Rf值来鉴定化合物？答：在特定的展开剂中，Rf值几乎可以认为是物质的特性之一。
取标准品和样品，如果在两个以上的展开剂系统中，样品都有和标准品相同Rf的点，基本可以确定样品中含有标准品。
如果样品在多种展开剂中，都显示只有一个点，而这个点的Rf和标准品（或者报道的标准品的）Rf总是相同，那么此样品就是标准品所含物质。
TLC用于鉴定，是最简便而又常用的方法之一。
②在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？答：薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品的极性，溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。
凡溶剂的极性越大，则对化合物的洗脱力也越大，也就是说Rf值也（如果样品在溶剂中有一定溶解度）。
因为根据溶剂的极性，化合物的极性及Rf值，越大，可知各组分在薄层板上的位置。
③展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？答：这样所点试样将被溶剂所洗脱，薄层色谱无法展开。
④柱色谱中为什么极性大的组分要用极性较大的溶剂洗脱？答：根据相似相溶原理，极性大的组分在极性大的溶剂中溶解度较大，易于洗脱。
⑤柱中若留有空气或填装不均，对分离效果有何影响？如何避免？答：造成洗脱剂流动不规则而形成沟流，引起色谱带变形，影响分离效果。
向柱子中倒入溶剂约为柱高3/4处，打开活塞，然后慢慢加入吸附剂，用木棒或带橡皮管的玻棒轻轻敲打柱身下部，使填装紧密。