β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测 2
植物β-葡萄糖苷酶的研究进展
生物资源 2021,43(2 ):101〜109Biotic ResourcesDOI ： 10. 14188/j. ajsh. 2021. 02. 001植物，葡萄糖苷酶的研究进展王晨，李家儒(武汉大学生命科学学院杂交水稻国家重点实验室，湖北武汉430072)摘要：广葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶，广泛存在于动物、植物和微生物中。
f 葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基， 在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。
/?-葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH 1、0只3、0145、0只7、0只9、0只12、0只35、0扣16等8个家族；但是，目前仅对(^1和0只3有较深人的研究，其他家族的功能依旧不清楚。
综述了近年来植物中&葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等 方面的研究进展，总结了植物中/?_葡萄糖苷酶研究中存在的问题，并指出今后的研究方向。
关键词：泽葡萄糖苷酶；基因家族；活性位点；异源表达中图分类号：Q946.5文献标志码：A文章编号：2096-3491(2021)02-0101-09Research progress of plant j?-glucosidaseWANG Chen，LI Jiaru(Sate Key Laboratory of Hybrid Rice, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072,Hubei,China)Abstract ： /?-glucosidase is a glycoside hydrolase, widely found in animals, plants and microorganisms, ^-glucosi-dase can hydrolyze non-reducing terminal glucosides in plants, and thus it plays an important role in plant cell wall metabolism, phytohormone activation and defense response. /?-glucosidase can be divided into G H 1, GH 3, GH5, GH 7, G H9, GH12, GH35, GH116 based on amino acid sequence. However, only GH1 and GH3 have been studied deeply, and the functions of other families are still unclear. The research progress on the structure, physicochemical properties, substrate specificity, catalytic mechanism and the function of /?-glucosidase in plants in recent years are reviewed in this paper. Problems in the research are summarized and the future research direction is pointed out.Key words ： /?-glucosidase ； gene family ； active site ； heterologous expression〇引言丨葡萄糖昔酶（/?-glucosidase,EC 3.2. 1.21)，也 称为葡萄糖糖苷水解酶，是一类纤维素酶，能够 从含糖化合物中催化水解末端的非还原性/?-〇-糖苷 键，释放出^-D -葡萄糖及相应的单糖、寡糖或复合 糖。
β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase, β-GC)试剂盒说明书
货号：QS2613 规格：50管/24样β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）试剂盒说明书可见分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定测定意义：β-GC（EC 3.2.1.21）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化β-糖苷键水解，具有多方面生理作用：在纤维素的糖化作用中，β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖；β-GC水解萜烯类香气前驱体，使糖苷键合态变成游离态。
从而产生香味；β-GC能够水解植物体内野黑樱苷，释放HCN，从而防止昆虫取食。
测定原理：β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。
试剂一：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入10mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。
试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。
试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。
粗酶液提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、培养液、血清（浆）等液体样本：直接检测。
测定步骤：1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。
土壤β-葡萄糖苷酶 微板法
土壤β-葡萄糖苷酶微板法土壤β-葡萄糖苷酶（soil β-glucosidase）是一种重要的土壤酶类，它在土壤有机碳循环和营养元素循环中扮演着重要角色。
本文将介绍土壤β-葡萄糖苷酶的微板法测定方法及其在土壤生态学研究中的应用。
β-葡萄糖苷酶是一类能水解葡萄糖苷键的酶，可将β-D-葡萄糖苷水解成葡萄糖和对应的配基。
它在生物体内广泛存在，包括植物、动物和微生物。
在土壤中，β-葡萄糖苷酶主要由微生物产生，参与碳、氮和磷等元素的循环过程。
微板法是目前常用的测定土壤β-葡萄糖苷酶活性的方法之一。
它通过利用培养基中的显色剂，如对氨基苯酚和氯化铵，与酶反应产生颜色变化，从而测定酶的活性。
这种方法具有操作简便、灵敏度高、准确度好等优点，被广泛应用于土壤生态学研究中。
微板法的步骤如下：1. 样品制备：收集土壤样品后，将其通过筛网过滤，去除大颗粒杂质。
然后将土壤样品加入适量的缓冲液中，使土壤与缓冲液充分混合。
2. 培养基制备：制备含有显色剂的培养基。
常用的培养基配方为：对氨基苯酚、氯化铵和磷酸盐缓冲液。
3. 混合反应：将土壤样品和培养基混合，使其充分接触。
然后将混合物均匀地分配到微孔板的孔中。
4. 孵育：将装有混合物的微孔板放入恒温培养箱中，以适当温度孵育一定时间。
常用的孵育温度为30摄氏度，孵育时间为24小时。
5. 颜色测定：孵育结束后，使用光谱分光光度计测定微孔板中孔的吸光度。
根据吸光度的变化，可以推算出土壤样品中β-葡萄糖苷酶的活性。
土壤β-葡萄糖苷酶的活性可以反映土壤中有机质的分解能力和微生物的活跃程度。
在土壤生态学研究中，通过测定土壤β-葡萄糖苷酶活性，可以评估土壤的健康状况、有机质分解速率和养分循环能力。
此外，β-葡萄糖苷酶活性还与土壤的物理化学性质、植被类型和管理方式等因素密切相关，因此可以用于土壤质量评价、土壤肥力改良和生态系统管理等方面。
土壤β-葡萄糖苷酶微板法是一种常用的测定土壤酶活性的方法，其操作简便、准确度高，在土壤生态学研究中具有重要应用价值。
β-葡萄糖苷酶的研究进展
化工能源化 工 设 计 通 讯Chemical EnergyChemical Engineering Design Communications·144·第47卷第2期2021年2月β-葡萄糖苷酶也称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，其可以水解释放出β-D-葡萄糖及相关配基。
1837年研究人员在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，随后研究调查得出β-葡萄糖苷酶在植物和昆虫及细菌体内广泛存在，β-葡萄糖苷酶参与了生物体内的糖代谢过程，对维持生物正常的生理功能有重要作用。
β-葡萄糖苷酶参与EMP 糖酵解的途径属于参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系。
哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷（LPH ）水解酶也包含着芳基-β-葡萄糖苷酶，乳糖酶/根皮苷由于涉及成人型乳糖酶缺乏病得到广泛实验研究，同时β-葡萄糖苷酶可以使得水果和蔬菜及茶叶中的风味前体物质水解为有浓郁天然风味的香气物质，可以协助纤维素酶降解纤维素[1]。
1 β-葡萄糖苷酶简介β-葡萄糖苷酶分布比较广泛，普遍存在于植物的种子和微生物中，动物中也存在着大量的β-葡萄糖苷酶，根据酶对底物水解所具有的专一性特点，β-葡萄糖苷酶主要有芳香基-β-葡萄糖苷酶和烃基-β-葡萄糖苷酶及多底物特异性β-葡萄糖苷酶三种类型。
根据酶的结构和催化结构域的氨基酸序列等特点对其分类时，糖苷水解酶的GH1和GH3家族中所包含着的β-葡萄糖苷酶最多[2]。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶当中不可缺少的重要方面，随着时代的进步发展，像目前我国的医疗、食品乃至其他行业领域内，都有β-葡萄糖苷酶的应用身影。
最为关键的是，在我国经济等方面迅速发展的基础上，所带来了环境污染问题，鉴于严重的环境能源危机下，社会各界人士对β-葡萄糖苷酶提出了极高的关注程度。
通过实际调查发现，在对β-葡萄糖苷酶实施水解过程中，还存在的很大的困难就是纤维素彻底降解为单糖。
站在基因工程与蛋白质工程视角下进行分析，已经获取到了良好的β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶机理
β-葡萄糖苷酶是一种酶类蛋白质，它能够催化β-葡萄糖苷类化合物的水解反应。
其机理如下：
1.底物结合：β-葡萄糖苷酶首先与底物结合，形成酶-底物复合物。
酶的活性中心通常包含一个酸性残基和一个碱性残基，它们能够与底物中的葡萄糖分子中的糖苷键形成氢键和范德华力。
2.催化反应：在酸性条件下，β-葡萄糖苷酶的酸性残基能够使底物中的糖苷键断裂，产生葡萄糖和糖基。
3.产物释放：产物从酶分子上解离，并被释放出来。
需要注意的是，β-葡萄糖苷酶的催化机理是通过酸催化实现的。
因此，在不同的pH条件下，酶的催化效率和特异性可能会发生变化。
此外，β-葡萄糖苷酶还具有底物选择性，只能催化特定类型的糖苷键水解反应。
β-葡萄糖苷酶研究资料
β-葡萄糖苷酶的研究1837年，Liebig和Wohler首次在苦杏仁汁中发现了β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)的英文名是β-glucosidase，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。
它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。
β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。
β-葡萄糖苷酶的植物来源有人参、大豆等；微生物来源的报道较多，如原核微生物来源的有脑膜脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsonae)等，真核生物来源的有清酒酵母(Candida peltata)、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）等；β-葡萄糖苷酶的动物来源有蜜蜂、猪肝和猪小肠等。
鉴于β-葡萄糖苷酶的研究广泛，本文对其一些研究进展进行讨论。
1 β-葡萄糖苷酶的分类β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为3类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。
2 β-葡萄糖苷酶的提取、纯化及酶活测定方法2.1 β-葡萄糖苷酶的提取方法不同来源的β-葡萄糖苷酶，其提取方法也有所不同。
动植物体及大型真菌中的糖苷酶一般需要对酶源进行组织捣碎，然后用缓冲液浸提。
常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等。
pH值一般选用酶的稳定pH值；提取温度适于低温，一般为4 ℃。
利用微生物发酵法生产β-葡萄糖苷酶是β-葡萄糖苷酶的另一来源，一般微生物发酵都采用液态发酵。
黑曲霉胞外耐高糖β-葡萄糖苷酶的分离纯化及部分特性研究
Ｓｐ ａｒｌ － ０ ｅｈｃｙ Ｓ ２０凝胶过 滤层析 等步骤 ， 黑曲霉的发酵 液 中获得 了凝胶 电泳均一 的 两种 一 从 葡萄糖
苷酶 。其 中一种为耐 高糖 的口 葡萄糖苷 酶 ， 萄糖 抑制 系数 （ ｉ 为 ４ ． １ ｍｏ Ｌ 纯 化倍数 和得 一 葡 Ｋ） １０ ｌ ， ｍ ／
部 分 特 性 研 究
赵林 果 ， 游丽金 ， 鹏 ， 孟 余世 袁
（ 南京林业 大学 化学Ｘ 程 学院，江苏 南京 ２ ０ ３ ） － １０ ７ 盯 林
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摘
要 ： 采 用硫 酸铵 盐析 、ｈ ｎｌ ｅｈｒｓ Ｌ ４ Ｐ ｅｙ Ｓｐ ａｏｅＣ 一 Ｂ疏水层 析 、 Ｅ Ｅ Ｓｐ ａｏｅ阴离子交换层析 、 Ｄ Ａ － ｅｈｒｓ
维普资讯
第２ ７卷第 ６期 ２０ ０ ７年 １ ２月
与 工 业
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Ｖｏ ． ． １ ２７ Ｎபைடு நூலகம் ６ Ｄｅｃ ２ ０７ ． ０
黑 曲霉 胞 外 耐 高 糖 一 萄 糖 苷 酶 的分 离纯 化 及 葡
中 图分 类 号 ：Ｑ ２ Ｑ ５ Ｔ ９ ； ８ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：２ ３—２ １ （ ０ ７ ０ ０ ４ ０ ０５ ４ ７ ２ ０ ）６— ０ １— ６
Ｓ ｕ ｙ ｏ ｕ ｉ ｃ ｔ ｎ ａ ｄ Ｓ ｍｅ Ｐ ｏ ｅ ｔ ｓ ｏ Ｈｉ ｈ ｙ Ｇｌ ｃ ｓ —ｏ ｅ ａ ｔ ｔ ｄ ｎ Ｐ ｒｆ ａｉ ｎ ｏ ｒ ｐ ｒｉ ｆＡ ｇ ｌ ｕ ｏ ｅ ｔ ｌｒ ｎ ｉ ｏ ｅ
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_葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展
第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26 N o.2M ar. 2007 文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华, 高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘 要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。
关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua , GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。
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β-葡萄糖苷酶的活性分离及其检测
一、实验目的
理解与掌握使用活性分离法分离β-葡萄糖苷酶。
二、实验原理
在分离培养基中添加底物七叶苷和亚铁离子。
如果存在β-葡萄糖苷酶，七叶苷会被细菌的β-葡萄糖苷酶分解生成七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。
培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。
三、实验仪器与试剂
仪器
超净工作台、隔水式恒温箱、微波炉、摇床、10uL 移液枪、200uL 移液枪等
试剂
β-葡萄糖苷酶液体分离培养基、β-葡萄糖苷酶固体分离培养基、IPTG溶液、Amp溶液
四、实验步骤
1、利用微波炉融解β-葡萄糖苷酶固体分离培养基，
冷却培养基至50℃左右，在无菌操净台上加入50uLAmp 抗生素至终浓度为100μg/ml，加入50uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml，小心混匀，避免气泡的产生；制备两块活性分离平板；每块分离平板20ml~25ml；
2用灭菌的牙签，将重组菌
Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G转移至一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；将对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2也转移至另外一块分离平板上；在不同的平板位置点样3次；
大致位置如下图所示
3、37℃恒温培养箱倒置培养24h左右; 观察结果；
4、在操净台中两瓶液体分离培养基中，分别加入
5uLAmp抗生素，至终浓度为100μg/ml，加入5uL诱导剂IPTG，至终浓度为50μg/ml；
5、利用牙签，在一瓶液体分离培养基中，加入重组菌Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G；在另外一瓶中加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2； 37℃恒温摇床10h，观察结果。
五、实验结果与分析
实验结果：
液体培养基加入重组Rosetta(DE3)plysS/pGXAG108G 的培养基颜色变深，不透光。
加入对照菌株大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS/pETBlue-2的培养基颜色不变，仍透光。
固体培养基对于点了对照菌株的6个位置均无变化，对于点了重组菌株的6个位置，其中4个正常变黑，1个未变化，1个黑色扩大有流出扩散现象，将周围一片均染黑。
分析：重组菌株未变黑位置可能是点样时未点上菌，也可能是接种上的菌转导失败，未形成重组菌。
重组菌株黑色扩大有流出扩散现象无法解释......
六、思考题
1、结合目前的纤维素酶的研究进展，请大概描述β-葡萄糖苷酶在水解纤维素过程中的作用机理。
答：β-葡萄糖苷酶在催化水解糖苷键反应时都遵循双取代反应机制（Double Displacement Mechanism）。
其反应方程式如下：
在催化反应中，需要两个重要的氨基酸残基作为质子供体（Proton donor）和亲核基团（Nucleophile）。
水解反应的基本过程可以分为3步：第一步是酶与底物键合形成米氏复合物ES；第二步是酶的亲核基团在酸碱催化（提供一个质子）帮助下，去攻击底物的糖苷键O原子，形成共价的糖基酶中间体E-S，在这个过程中，β-葡萄糖苷酶的活性中心可以根据不同类型的底物而相应发生一定程度的结构变化，使β-葡萄糖苷酶可以和多种糖类底
物结合，这一步决定了β-葡萄糖苷酶具有的底物专一性；第三步是酶底物过渡态的水解，酸或碱基团催化一个水分子攻击中间体E-S，与之反应，以切断糖苷键，释放β-糖基产物，并使酶恢复其初始的质子化态。
2、请查阅资料，若分离筛选其他2类纤维素酶或者及其编码的酶基因，可以采用什么方法?请简述至少2种不同的分离方法及其原理。
答：（1）葡聚糖凝胶层析：纤维素酶组分大多数为糖蛋白,在纯化中多采用柱层析法,C1酶和Cx酶多用SephadexG-75、SephadexG-100(或150)来纯化。
葡聚糖凝胶SephadexG-100；SephadexG-75；, 充分溶胀, 抽气, 分别装柱(50cm×2.6cm), 用0.05ｍｏｌ/ ＬｐＨ6.0 磷酸缓冲液充分平衡后上样, 选择合适的流速、检验器灵敏度，测定出现吸收峰各管的纤维素酶活及蛋白含量。
根据不同凝胶的层析图谱判定最适的一种。
原理：凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。
凝胶层析的机理是分子筛效应。
在洗脱过程中,大分子不能进人
凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外,而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构,流速缓慢.以致最后流出柱外,从而使样品中分子大小不同的物质得到分离
（2） SDS-SPGE ：采用垂直板式不连续系统电泳, 分离胶浓度12%, 浓缩胶浓度4%, 用0.25%( Ｗ/ Ｖ) 考马斯亮蓝Ｒ-250 酸性乙醇水染色。
原理： 浓缩效应样品在电泳开始时，通过浓缩胶被浓缩成高浓度的样品薄层(一般能浓缩几百倍)，然后再被分离。
当通电后，在样品胶和浓缩胶中，解离度最大的Cl—有效迁移率最大，被称为快离子，解离度次之的蛋白质则尾随其后，解离度最小的甘氨酸离子(PI=6．0)泳动速度最慢，被称为慢离子。
由于快离子的迅速移动，在其后边形成了低离子浓度区域，即低电导区。
电导与电势梯度成反比，因而可产生较高的电势梯度。
这种高电势梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
因而在高电势梯度和低电势梯度之间形成一个迅速移动的界面，由于样品中蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离
子之间，所以，也就聚集在这个移动的界面附近，逐渐被浓缩，在到达小孔径的分离胶时，已形成一薄层。
②．电荷效应当各种离子进入pH8．9的小孔径分离胶后，甘氨酸离子的电泳迁移率很快超过蛋白质，高电势梯度也随之消失，在均一电势梯度和pH的分离胶中，由于各种蛋白质的等电点不同，所带电荷量不同，在电场中所受引力亦不同，经过一定时间电泳，各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带。
③分子筛效应由于分离胶的孔径较小，分子量大小或分子形状不同的蛋白质通过分离胶时，所受阻滞的程度不同，因而；迁移率不同而被分离。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，受阻滞的程度不同，小分子走在前面，大分子走在后面，各种蛋白质按分子大小顺序排列成相应的区带。