OMEGArna提取试剂盒中文说明
OMEGA小提试剂盒提取质粒步骤（中文翻译版）
质粒提取（小提，mini kit）1、将携带目的质粒的大肠杆菌接种于含10~15ul基础培养基/氨苄西林培养介质的50ml培养瓶中。
2、室温下5000×g离心10min。
3、弃去上清，剩余沉淀物中加入500ul的SolutionⅠ/RNase A，彻底混匀。
4、将混悬液移至新的2ml离心管中，加入500ul SolutionⅡ，轻柔彻底混匀，可得清亮的细菌裂解物，室温下孵育2min（混匀时用力过大，可破碎出染色体DNA，使目的质粒纯度下降）。
5、向4中液体加入250ul预冷的Buffer N3，轻柔、彻底混匀，直到出现白色絮状沉淀，4℃≥12000×g离心10min（可室温，最好4℃）（Buffer应彻底混匀，若混合物粘稠呈棕色或呈球状，应多混匀几次以中和溶液，溶液的彻底中和对于获得好的产出是必要的）。
6、小心吸取并将上清液转移进新的1.5ml离心管1：0.1的比例向上清液中加入ETR Solution 混匀溶液并于冰上孵育10min，孵育过程中颠倒几次以混匀（加入ETR Solution后，细菌裂解物将出现浑浊，但冰上孵育后将变澄清）（勿用2ml离心管收集上清，因为2ml离心管中有太多液体时，ETR Solution将悬浮于溶液中）。
7、将6中液体于42℃孵育5min，溶液将再次变浑。
室温下12000×g离心3min，ETR Solution将于离心管底部形成蓝色层。
8、将上层水相转移入新的2ml离心管中，按1：0.5的比例加入无水乙醇（室温，96~100％），轻柔混匀，室温下孵育1~2min。
9、将8中的溶液取700ul到柱子中，组装收集管，室温下1000×g 离心1min，弃去收集管中通过柱子的液体，柱子和收集管重复利用。
10、重复9中步骤，直到收集的细菌裂解物全部用完。
11、将500ul Buffer HB加入柱子中，室温下10000×g离心1min，弃去收集管中废液（目的：将残存的蛋白污染物除去，是获得高质量DNA所必需的）。
质粒中提中文版(Omega)
中提质粒步骤材料准备：灭菌250或500mL三角瓶，托盘天平，5mL移液枪及枪头，卫生纸，废液缸，记号笔，50mL 圆底离心管，15mL尖底离心管步骤：1.集菌将100mL菌液分批倒入50mL圆底离心管中，室温12000rpm离心1min，弃流出液体，打开盖倒置吸水纸上控干。
2.加入2.5mL solution I（提前加入RNase，4℃保存），重悬细菌沉淀（可使用5mL移液枪吹打）。
3.加入2.5mL solution II，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），以获得清亮的裂解物，室温静置3-5min。
（此步主要是碱裂解细菌，使其中的蛋白质和DNA变性，反应时间不能太长，否则容易使大肠杆菌的基因组DNA断裂成小片段，污染质粒DNA）4.加入1.25mL Buffer N3，轻柔混匀（颠倒离心管7-10次），直至形成白色沉淀，室温静置2-3min。
5.4℃12000rpm离心10min，使白色沉淀沉于底部。
6.取出一个Lysate Clearance Filter Syringe，抽出活塞，小心将5中液体全部转移至注射器中（注射器可不放活塞直接直立于4中的离心管中，液体不会出来），室温静置2min。
7.将6中注射器放置于一新的15mL离心管，轻推注射器活塞，使液体流入离心管中。
8.加入0.1倍体积的ETR（约600uL）至过滤后的液体中，混匀（颠倒离心管7-10次），冰浴20min，期间颠倒离心管几次。
（此期间准备一个Hind-Bind DNA midi Column加入2mL GPS Buffer，室温静置10min，4000rpm离心5min）9.42℃温浴5min，溶菌液变浑浊，室温4000rpm离心5min，则ETR沉入底部。
10.小心将上层液体转移至一新的15或10mL离心管中，加入0.5倍体积的EtOH（约2.5mL），轻柔混颠倒5-6次，室温静置2min。
11.将10中液体加入柱子中，室温4000rpm离心5min，弃液体，重新装好柱子，直至液体全部滤过。
omga质粒提取试剂盒_说明书_翻译
omgaE.Z.N.A.质粒试剂盒操作规程说明书（译版）1. 自新鲜划痕选择培养板中分离单菌落，接种含适当选择性抗生素的2-5ml的LB或YT培养基进行培养。
37℃强力摇动（~300rpm）孵育20-24h。
使用10-20ml培养管或容量至少4倍于培养容积的培养瓶。
强烈推荐使用endA阴性大肠杆菌菌株进行常规质粒分离。
此类菌株包括DH5α和JM109。
2. 将1.5-5.0ml细菌菌液室温13,000 g离心3min。
轻轻倒出或吸走培养基并丢弃。
3. 加入200μl 的溶液Buffer T 1/Rnase A重悬沉淀，涡旋或用移液器反复吹打。
充分重悬沉淀对于获得高质量的DNA非常重要。
4. 加入200μl溶液Buffer T 2，倒置、转动试管5-10次使之轻轻混匀，得到透明的裂解产物。
室温孵育5min。
不要用力混合，以免使染色体DNA断裂，减低质粒的纯度。
该步反应不要超过5min。
溶液II不用时要拧紧瓶盖，以免试剂被空气中的CO2酸化。
5. 加入200μl溶液Buffer T 3，立即倒置试管15-20次混匀，直至白色絮状沉淀物形成。
冰上孵育5min。
为避免形成局部沉淀，加入溶液III后应立即、充分混匀溶液。
6. 4℃13,000 g离心10分钟。
白色沉淀物形成，立即进行下一步操作。
7. 小心翼翼的吸取上清液，加入到新的1.5ml离心管（不是试剂盒提供的）中。
加入200ul 用异丙醇稀释的BAC 结合液（缓冲液），颠倒3-5次充分混匀。
BAC 结合液使用前必须用96%-100%的异丙醇稀释，详细的说明见瓶壁或第三页说明书8.加入样本DNA（HiBind DNA MicroElute）到提供的2ml收集管中。
9. 室温8000g离心30s，丢弃收集管，将离心柱放入新的收集管中。
10. 将收集柱放回收集管并加入750ul SPM buffer（用乙醇稀释），室温8000g离心30s，丢弃收集管，将离心柱放入新的收集管中。
Omega公司RNA提取试剂盒说明书
RNA-Solv Reagent®RNA Isolation SolventWARNING: This reagent is toxic if swallowed and in contact with skin. Causes burns. After contact with skin, wash immediately with copious amounts of mild detergent and water. If you feel sick, seek medical advice at once and Quote UN2821.Product No:R6830-00 (5 ml)R6830-01 (100 ml)R6830-02 (200 ml)Storage Conditions:RNA-Solv is stable for at least 24 months®when stored at 2°C-8°C and yields reproducible results.IntroductionRNA-Solv® Reagent is a reagent system for the isolation of total RNA from cells and tissues. The reagent, a single-phase solution consisting of phenol and guanidine isothiocyanate, is modification of the single-step RNA isolation method developed by Chomczynski and Sacchi (1).The sample is homogenized and lysed in RNA-Solv® Reagent which maintains the integrity of the RNA, while disrupting and denaturing endogenous RNases and other cellular components. Extraction of the lysate with chloroform further denatures proteins and separates the mixture into an organic and an aqueous phase. RNA remains exclusively in the aqueous phase, and is subsequently recovered by isopropanol.This method is suitable for small quantities of tissue (<100 mg) and cells (<5 X10), and large quantities of tissue ( up to1 g) and cells 6(<10 ), of human, animal, plant, or bacterial origin. The simplicity 8of the RNA-Solv® Reagent method allows simultaneous processing of a large number of samples. The entire procedure can be completed in one hour. Total RNA prepared in this manner can be used for Northern blot analysis, dot blot hybridization, poly(A) + selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. For use in amplification by thermal cycling, treatment of the isolated RNA with RNase-free DNase I is recommended when the two amplimers lie within a single exon.Supplied By User•Chloroform (no isoamyl alcohol added)•Isopropyl alcohol•80% Ethanol (in DEPC-treated water)•RNase-free water•Tabletop centrifuge capable of 12,000 x g at room temperatureGeneral Notes Regarding RNase ContaminationWhenever working with RNA :•Always wear disposable gloves and change gloves frequently.•Use sterile, disposable plasticware and automatic pipettes reserved for RNA work to prevent cross-contamination with RNases.•In the presence of RNA-Solv® Reagent, RNA is protected from RNase contamination. Downstream sample handling requires that nondisposable glassware or plasticware be RNase-free.•Use only DECP-treated buffers. Add DEPC to a final concentration of 0.1%, incubate at 37C for 2 hours, andoautoclave at 121C. Do not add DEPC to Tris buffers. Suchobuffers must be prepared by using DECP-water.PrecautionUse only disposable polypropylene tubes for small samples and glass Corex tubes for larger samples. All tubes must be able to withstand 12,000 x g . Polystyrene tubes may crack with chloroform Before StartingA.Small Samples :To isolate RNA from very small samples (<106 cells or <10 mg tissue) perform homogenization (or lysis) of samples in 0.8 mL of RNA-Solv®, and add 1 mg RNase-free glycogen or yeast tRNA as carrier. This will improve yields obtained with precipitation.B.Difficult Animal Samples: Specimens containing large amounts of proteins, fat, polysaccharides or extracellular material such as muscles, fat tissue, and sperm, will require the following modification. After lysis/homogenization in RNA-Solv® Reagent, centrifuge at 12,000 x g for 10 minutes at room temperature to remove insoluble debris. Often a precipitate forms at the bottom of the tube, but with fatty tissue, a lipid layer will also form above the aqueous phase. The supernatant will contain the RNA and must be carefully transferred to a fresh 1.5 ml microfuge tube before proceeding.C. Interruption the procedure:Following lysis in RNA-Solv®Reagent and before addition of chloroform, samples can be stored at -70C for up to 3 months. In addition, once the RNA is oprecipitated in isopropanol, the pellet may be stored at -20C or -o70C for up to 1 year.oRNA-Solv Protocol for Total RNA Isolation®CAUTION: When working with RNA-Solv® Reagent use gloves and eye protection (safety goggles) and avoid contact with skin or clothing. Work in a chemical fume hood to avoid inhaling vapor. Unless otherwise noted, all steps are to be carried out at room temperature (20C-25C).o o1. Homogenization and lysis of samples: follow either method belowa) Tissue SamplesHomogenize tissue samples in 1 mL of RNA-Solv® Reagent per 50-100 mg of tissue using an appropriate mechanical homogenizer. Alternatively one can pulverize tissue in liquid nitrogen with mortar and pestle and transfer the powder to a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. If ceramic mortar and pestle are not available, homogenize the sample in the microfuge tube using a disposable microtube pestle (Eppendorf, Cat No. 0030 120.973; VWR, Cat No. KT 749520-0000). The sample volume should not exceed 10% of the volume of RNA-Solv® Reagent used.b) Cells Grown in SuspensionPellet cells by centrifugation. Lyse cells in RNA-Solv® Reagent by repetitive pipetting. Use 1 mL of the reagent per 5-10 x 10of6 animal, plant or yeast cells, or per 1 x 10 bacterial cells. Washing8cells before addition of RNA-Solv® Reagent should be avoided as this increases the possibility of mRNA degradation and RNase contamination. For plant, fungal, and yeast cells mechanical or enzymatic homogenization may be required. Also, for plant, fungal, and yeast cells, we recommend the use of the E.Z.N.A.® Plant (R6627),Fungal (R6640), and Yeast (R6670) RNA Kits from Omega Bio-tek.c) Cells Grown in MonolayerLyse cells directly in a culture dish by adding 1 mL of RNA-Solv®Reagent to a 3.5 cm diameter dish, and passing the cell lysate several times through a blue pipette tip. The amount of RNA-Solv®Reagent added is based on the area of the culture dish (~1 mL per 10 cm ). An insufficient amount of RNA-Solv® Reagent may result2in contamination of the isolated RNA with DNA. Always use more RNA-Solv® Reagent if in the lysate is too viscous to aspirate with a pipette.2. Add 0.2 mL of chloroform per 1 mL of RNA-Solv® Reagent. Cap sample tubes securely and vortex vigorously for 15 seconds. Incubate on ice for 10 minutes. This step is critical - do not change it.3. Centrifuge the samples at no more than 12,000 x g for 15 minutes 4E C.The mixture separates into a lower phenol-chloroform phase, an interphase, and an upper aqueous phase. RNA remains entirely in the aqueous phase.4. Precipitation of RNA.Transfer no more than 80% of the aqueous phase to a fresh tube, and discard the lower organic phase. Precipitate the RNA from the aqueous phase by adding 500ìl of isopropyl alcohol per 1 mL of RNA-Solv® Reagent used for the initial homogenization. Incubate samples at room temperature 10 minutes and centrifuge at no more than 12,000 x g for 10 minutes also at room temperature.Carbohydrate-rich samples: Plant samples of high polysaccharide content or animal tissues rich in glycosaminoglycans (proteoglycans) require the following modified precipitation method for obtaining pure RNA. Prepare Buffer A ( 1.2 M sodium chloride, 800 mM sodium citrate). Following step 3, add to the aqueous phase 0.3 ml isopropanol followed by 0.3 ml Buffer A per 1 ml RNA Solv ® Reagent used in step 1. Vortex to mix and centrifuge at no more than 12,000 x g for 10 minutes at room temperature. This high salt precipitation will reduce co-purification of complex carbohydrates.5. Wash RNA pellet. Discard the supernatant and wash the RNA pellet once with 1 ml 80% ethanol. Mix the sample by vortexing and centrifuge at no more than 7,500 x g for 5 minutes at room temperature.6.Reconstitute RNA. Carefully aspirate and discard the ethanol and briefly AIR DRY the RNA pellet for 2-5 minutes at room temperature. Do not use centrifugal devices equipped with a vacuum source as over-drying will lead to difficulty in re-dissolving RNA in water. Dissolve RNA in RNase-free water - a 5 minute incubation at 60 °C may be required. RNA can also be reconstituted in 100% formamide (deionized) and stored at -70°C.RNA is now suitable for RNase protection, northern analysis and reverse transcriptase reactions. For isolation of poly(A)+ RNA an additional ethanol precipitation is required. Add 1/8 X volume of RNase-free 3M NaAc, pH 6.0 followed by 2.5 X volume absolute ethanol. Vortex to mix and incubate at room temperature for 5 minutes. Centrifuge at 12,000 x g for 10 min at room temperature and discard the supernatant. Wash the pellet as before and reconstitute in DECP-treated water.Determination of Yield and QualityUV spectrophotometric analysis of the purified RNA is required for obtaining yield. To do so, dilute the RNA in an appropriate volume of TE buffer, pH 8.0 (not water; RNA yields low Abs ratio values if dissolved in acidic buffers) and measure absorbance at 260 nm and at 280 nm. RNA Conc = 40 ìg/ml X Dilution factor X Abs 260 nmTypical Abs 260 nm/ 280 nm ratios of 1.7-1.9 are obtained with the protocol. Yields vary depending of type and amount of starting material, and on condition of storage prior to processing. For assessing the quality of RNA, we recommend you perform denaturing agarose gel electrophoresis to confirm the integrity of purified material. Invariably, the full spectrum of RNAs, including 4S and 5S species are purified with RNA-Solv® Reagent.Expected Yields per 1 mg tissue or 10 cells:6Liver and spleen, 5-10 ìgKidney, 2-5 ìgBrain, 1-2ìgEndothelial cells, 7-12 ìgFibroblasts, 6-8ìgTroubleshooting•Low RNA Yields: Incomplete lysis of samples in RNA Solv Reagent. RNA pellet not completelt dissolved in DEPC-water.pH of diluent used for spectrophotometric analysis is too low.•Degraded RNA: Tissues were not immediately processed or frozen. Inadequate storage of starting material prio to isolation. Inadequate storage of RNA (-5 to -20°C, instead of -60 to -70°C) Trypsin/EDTA was used in dislodging monolayer cells. Buffers or plasticwasre were not RNase-free.Formaldehyde used for denaturing agarose-gel electrophoresis had a pH below 3.0.•Low Abs260/Abs280 ratios: Sample was diluted in water rather than TE. Acidic pH lowers absorbance ratios. Use TE buffer as diluent for readings. Insufficient RNASolv Reagent was used for lysis of sample. Ice incubation in step 2 was not performed. The aqueous phase was contaminated with the phenolic phase.•DNA contamination of RNA: Too little RNASolv Reagent used for sample processing causing inadequate separation of DNA/nucleoprotein complexes from aqueous RNA. The aqueous phase was contaminated with the phenol phase.Technical Support:Omega Bio-tek, USA - call toll-free : 1 888 832 8896References:1. Chomczynski, P., and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1987).2. Chomczynski, P. Biotechniques 15, 532 (1993).For laboratory research use only.CAUTION: Not for diagnostic use. The safety and efficacy ofthis product indiagnostic or other clinical uses has not been established.May,1999 (C). All rights reserved by Omega Bio-tek, Inc.RNA-Solv is a registered mark of Omega Bio-tek, Inc.。
OMEGA Total RNA 提取试剂盒中文步骤
动物细胞总RNA提取步骤：注：所有的离心操作在室温中进行一般操作设备：1、完全乙醇（96~100%）2、无菌的移液枪头和1.5ml的离心管3、可选：14.3Mβ-mercaptoethanol (β-ME, 2-mercaptoethanol)4、14000Xg的微型离心机5、加入70%乙醇的DPEC水6、一次性手套二、样品破坏和均化设备1、omega均化柱2、注射器具3、研钵和碾槌4、转子定子均化器三、实验前准备：可选：每一毫升TRK Lysis Buffer加入20ul的2-mercaptoethanol)制成工作溶液。
混合液可在室温下保存一个星期。
1、hibind柱最大能收集100ug的RNA2、TRK Lysis Buffer能操作的最大细胞数为1X10^7Source Number of Cells RNA Yield (μg)IC21 1 x 106 12Hela 1 x 106 15293HEK 1 x 106 10HIN3T3 1 x 106 15四、收集细胞1、收集悬浮细胞:细胞数数，500g离心5分钟沉淀细胞，吸掉上清，继续下一步2，收集单层细胞（1）直接溶解细胞：细胞数数，吸掉全部的完全培养基，继续下一步（2）胰蛋白酶消化收集细胞细胞数数，吸掉培养基，PBS洗几遍。
用加了0.1~0.25%的胰蛋白酶的PBS消化细胞，当细胞从培养皿分离，加入培养基终止消化。
500g离心5分钟，吸掉上清，继续下一步。
五、用TPK Lysis Buffter 破坏细胞1对于细胞团，摇晃收集管使细胞团松散，按下表加入适量的TRK Lysis Buffer,振荡混匀。
2、对于在培养板上的单层细胞，按下表加入适量的TRK Lysis Buffer,，用rubber policeman 收集细胞并转移至1.5ml的离心管中，振荡或吹打混合。
六、按以下其中一种方法匀浆化和破坏组织1、Rotor-Stator 匀浆机：用匀浆机使样品完全均匀。
细菌RNA提取方法-OMEGA试剂盒法
1.取3mL菌体，6000g离心5min，4°C，弃上清，加入500μL 1×TE Buffer，用枪头吹吸
均匀，6000g离心5min，4°C，弃上清。
2.加入100μL 溶有溶菌酶的TE Buffer（20mg/mL），重悬菌体，涡旋震荡30s。
3.30°C水浴10min，每隔2min涡旋震荡20s。
4.加入350μL BRK buffer（第一次使用之前加入β-巯基乙醇，使其浓度为20mg/mL），加
入25-40mg玻璃粉，涡旋震荡5min，13000g离心5-10min。
5.转移400μL上清至新的EP管中，加入400μL 70%冰乙醇，用枪头轻轻混匀。
6.将液体（包括可能生成的沉淀）转移至柱子中，10000g离心1min，弃废液。
7.加入300μL Wash Buffer I，10000g离心1min，弃废液。
8.加入500μL Wash Buffer I，10000g离心1min，弃废液。
9.加入500μL Wash Buffer II，10000g离心1min，弃废液。
10.重复步骤9。
空转2min。
11.将柱子转移至新的EP管中，加入30-50μL DEPC水，10000g离心1min。
如需要可重复一
次。
DEPC水可提前70°C预热。
RNA提取-OMEGA
OMEGA E.Z.N.A. TM RNA 提取试剂盒操作步骤1.弃培养基，加入1ml RNA-Slov regent 裂解细胞，将裂解液转移到一干净的1.5ml EP管中，室温孵育2-3min。
2.每1ml RNA-Slov regent中加入200µl氯仿，涡旋混匀15s，冰上孵育10min。
3.12,000×g，4 ℃，离心15min。
4.吸取上层水相并加入1/3体积的无水乙醇，涡旋混匀15s。
5.将HiBind RNA Spin柱子套在2ml收集管中，该柱子一次性最多可以容纳700µl的溶液。
将上述溶液（包括沉淀）转移至柱子上，室温下，10,000×g离心1min，以完全滤过溶液。
如果还有溶液残留，请延长时间至溶液完全滤过柱子，去弃滤过液。
继续将剩余的裂解液转移至柱子，离心弃去滤出液。
Tip：如果在离心后，柱子发生堵塞，可延长离心时间或提高离心速率至裂解液完全流出柱子。
柱子发生堵塞的原因有以下几种原因：1.样品起始量太多；2.裂解不够充分；建议：1.减小样品量，提高匀浆效率；2.裂解完后，用匀浆柱过滤裂解液。
6.将柱子放入一个新的2ml收集管中，加入300µl Wash Buffer I至柱子上，室温下，10,000×g离心1min，去除滤过液；7.将柱子放置于2ml收集管中，加入400µl RNA Wash Buffer I，室温下，10,000×g离心1min，去除滤过液；8.将柱子套回离心管，加入500µl RNA Wash Buffer II(已用无水乙醇稀释)，室温下，10,000×g离心1min，弃去滤过液；9.将柱子套回离心管，加入500µl RNA Wash Buffer II，室温下，10,000×g离心1min，弃去滤过液。
10.将柱子套回空的收集管，室温下，14,000×g离心空柱2 min，以甩干柱子的基质。
OMG植物RNA提取试剂盒中文使用说明
OMG植物RNA提取试剂盒中文使用说明植物RNA提取试剂盒（Plant RNA Extraction Kit）是一种高效的试剂盒，用于从植物组织样品中提取RNA。
本文将详细介绍该试剂盒的使用说明，以帮助用户正确操作。
步骤一：样品的预处理1.1收集所需的植物组织样品，并将其快速冷冻在液氮中。
1.2在试验台上，用磨砂盘将样品研磨成粉末状。
使用过程中，要避免样品的过度加热以及溶液的损失。
1.3 从研磨后的样品中取出约100 mg的样品，放入2 mL离心管中。
步骤二：细胞破碎和裂解2.1向离心管中加入1mL细胞破碎液，然后快速颠倒数次，使样品均匀悬浮。
2.2将悬浮液在65摄氏度孵育30分钟，每隔5分钟振荡一次。
2.3孵育结束后，将管子在高速离心机中离心5分钟，以去除细胞残渣。
步骤三：RNA的沉淀3.1将上一步得到的上清液转移至新的2mL离心管中。
3.2加入1.5mL乙醇，轻轻颠倒数次，混合均匀。
3.3将混合液转移至RNA沉淀柱中，并在2mL收集管中储存过滤液。
3.4在6,000×g的离心机中离心柱子30秒，将上清液排除。
3.5在柱子上方放置一个新的2mL离心管，并将柱子放在上面。
3.6加入700µLRNA洗涤缓冲液，然后在6,000×g的离心机中离心柱子1分钟，将上清液排除。
3.7在同一个离心管中，再次加入700µLRNA洗涤缓冲液，然后在6,000×g的离心机中离心柱子1分钟，将上清液排除。
步骤四：RNA的洗涤和干燥4.1将柱子转移到新的2mL离心管中。
4.2加入600µL高盐洗涤缓冲液，然后在6,000×g的离心机中离心柱子1分钟，将上清液排除。
4.3在同一个离心管中，再次加入600µL高盐洗涤缓冲液，然后在6,000×g的离心机中离心柱子1分钟，将上清液排除。
4.4将柱子转移到新的1.5mL离心管中。
4.5 加入30 µL RNase-free水溶解RNA，然后在常温孵育5分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps)
步骤
A ． 真核细胞和组织
自己需要的材料：
β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC 水配置）、除RNase 的枪头和EP 管。
材料的最佳量
想得到最佳的产量和好的Hibind RNA 柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。
Hibind RNA 柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。
最大的结合能力是100ug 的RNA 。
TRK 裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg 的组织。
细胞的步骤
1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP 管或者用
枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。
a) 使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入20ul 的β－巯基乙醇。
b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器
里裂解细胞。
完全吸去培养基后直接加TRK 裂解缓冲液至细胞中。
加700ul 的TRK 到T35细颈瓶或10cm 的培养皿中，更小的培养器加500ul 的TRK 。
将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。
将裂解产物转移至1.5mlEP 管中。
c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or 400*g ）*5min ，弃上清，加入TRK
裂解液，漩涡振荡混匀。
2． 匀浆化裂解产物
“裂解和匀浆化样品”－第四页有详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min 。
不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA 的产量还容易造成柱子堵塞。
a) 用匀浆器30 s ，使样品匀浆化。
b) 用钝的针头的注射器（0.9mm 直径），至少吹打5次是样品匀浆化。
注射器要除
RNase 。
3． 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,4000*g, 3min,
室温。
将离心收集的流出液转移到新的EP 管中。
转到总RNA 分离中第4步。
组织的步骤：
1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤30mg ），使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入
20ul 的β－巯基乙醇。
500ulTRK 裂解液最大裂解能力30mg ，难破碎的组织大于20mg 就用700ul 的TRK 裂解液。
当组织量超出建议的最大量时，也不要超过40mg 。
组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用，除非是使用液氮， 2． 离心，≥1,5000*g, 5min, 室温。
3． 转移上清至，Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,3000*g, 3min,室温。
将离心收
集的流出液转移到新的EP 管中。
总RNA 分离：
4． 在裂解产物中加入50％体积（250ul －350ul ）的无水乙醇（96％－100％）混匀，漩涡振
荡20s 。
5． 样品转移到Hibind RNA Mini column 上，离心管的最大容量为750ul ，加完乙醇后可能
会形成沉淀。
所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。
室温离心，10,000*g,1min 。
弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）。
生物秀-专心做生物
w w w .b b i o o .c o m
6． 将柱子放在一个新的2ml 收集管中，加上300ul RNA wash buffer I 。
室温离心，10,000*g,
1min 。
同样弃掉流出液。
7． DNase I 消化（选择性）
在我的实验中没有做这一步。
8． 将柱子再放到一个新的2ml 收集管中，加入400ul RNA wash buffer I, 室温离心，10,000*g,
30s ，弃流出液。
9． 将柱子放到2ml 收集管中，加入500ul RNA wash buffer II （乙醇稀释过的），室温离心，
10,000*g, 30s ，弃流出液。
注意：使用前RNA wash buffer II 必须要用无水乙醇稀释，按照标签上的说明。
10． 用500ul RNA wash buffer II 洗涤一次柱子，同上一步骤一样。
室温离心，10,000*g,
30s ，弃流出液。
然后在空收集管中，以最大转速离心柱子，≥13,000*g, 2min, 室温，使的HiBind 基质完全干燥。
11． 转移柱子到一个新的1.5ml 的Ep 管中，（试剂盒中没有提供），加入50－100ul 的
DEPC 水洗脱柱子（试剂盒中提供）。
确保水直接加到了柱子的基质上。
13,000*, 1min, 室温。
如果RNA 的总量大于50ug ，可以进行二次洗脱。
注意：可以选择性地，用大一点的体积洗脱RNA 。
如果进行二次洗脱，总RNA 的量会增加，但是浓度会降低，因为80％以上的RNA 会在第一次时被回收。
提前将水加热到70℃并室温孵育柱子5min 会增加产量。
生物秀-专心做生物
w w w .b b i o o .c o m。