人肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒
肿瘤坏死因子a在妊娠期高血压疾病患者母血及脐血血清中的表达及意义
肿瘤坏死因子a在妊娠期高血压疾病患者母血及脐血血清中的表达及意义焦璐璐;马丽蓉;毛建英【摘要】目的探讨肿瘤坏死因子a(TNF-a)与妊娠期高血压疾病的关系,从而更好的评估妊娠期高血压疾病患者疾病的严重程度,为预防和治疗提供依据和研究基础.方法选择妊娠期高血压疾病患者66例作为实验组(根据相关实验室检查指标分为轻度子痫前期32例和重度子痫前期34例),同时收集41例正常妊娠孕妇作为对照组.抽取母血及脐血,并通过ELISA法分别测定母血及脐血血清中TNF-a的含量.结果妊娠期高血压疾病患者母血及脐血血清中TNF-a水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),且随着病情加重,TNF-a水平也随之升高.结论 TNF-a在妊娠期高血压疾病的发病机制中具有重要作用,患病时TNF-a可通过脐血进入胎儿体内并对胎儿造成伤害.【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2016(048)002【总页数】3页(P135-137)【关键词】妊娠期高血压疾病;TNF-a;母血;脐静脉血【作者】焦璐璐;马丽蓉;毛建英【作者单位】内蒙古医科大学,内蒙古呼和浩特010110;内蒙古自治区人民医院妇产科,内蒙古呼和浩特010017;内蒙古自治区人民医院妇产科,内蒙古呼和浩特010017【正文语种】中文【中图分类】R714.246妊娠期高血压疾病是妊娠期一组特有疾病，根据流行病学调查该疾病发生率约在5%～12%之间。
该疾病以高血压、蛋白尿、水肿为临床特点并可伴发多脏器功能损害，严重威胁母婴健康，是孕产妇和围产儿病死率升高的主要原因之一[1]。
因其病因和发病机制尚未明确，所以该病一直是病理产科研究的热点。
1989年Roberts等学者首次提出内皮细胞功能紊乱与障碍为妊娠期高血压疾病的病理生理变化的核心，并已广泛为众多学者证实和接受，内皮细胞功能紊乱与障碍的发生可能与细胞因子的异常相关。
肿瘤坏死因子-a是一个具有多种生物学效应的炎症因子，在全身各种炎症反应中均明显升高，且与血管内皮细胞功能密切相关。
TNF-a说明书
人(human)肿瘤坏死因子a(TNF-a)说明书本试剂盒仅供研究使用标本：血清或者血浆一、试剂组成精密度微孔板96孔 (Microtitration Strips) 1块 2～8℃干燥保存酶标偶合液 (Conjugate ) 1瓶 12.0毫升 2～8℃冷藏保存标准品 (Standard) 5瓶各1.0毫升 2～8℃冷藏保存呈色剂A (Substrate A) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存呈色剂B (Substrate B) 1瓶 6.0毫升 2～8℃避光冷藏保存终止液 (Stopping Solution) 1瓶 6.0毫升室温保存20倍浓缩洗涤液 (Rinsing Buffer x 20) 1瓶 60.0毫升 2～8℃冷藏保存5倍浓缩样品稀释液 (Diluent x 5) 1瓶 15.0ml 2～8℃冷藏保存英文说明书，中文说明书各一份室温保存二、注意事项1. 此试剂为体外检测试剂，效期内使用，试剂应视为传染物，不同总批号的试剂不能混用。
2．使用前应将盒内各试剂取出。
室温放置至少30分钟，3．浓缩洗涤液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟。
4．浓缩样品稀释液出现结晶后，请于37℃孵育15分钟5．若24小时内进行实验，标本可存放于2～8℃。
不需及时实验，标本-20℃保存，避免反复冻融。
6．在反复清洗微孔板，并扣干微孔中的残余液体，否则将降低精确度，造成吸光度偏离的假像。
7．加样完毕后，应注意轻微摇动微孔反应条，以便使孔中的液体充分混匀。
8．试剂盒保存于2～8℃，请勿冷冻，有效期请见盒内标示。
三、实验前准备1．使用前应将盒内各试剂取出，室温放置至少30分钟。
2．准备各种实验仪器及材料，如微量移液器，吸头，医用蒸馏水等3．浓缩洗液与医用蒸馏水1︰19倍稀释后成为应用洗涤液4．浓缩样品稀释液与医用蒸馏水1︰4倍稀释成应用样品稀释液5．用应用样品稀释液来稀释样品，按照1：100的体积比来稀释样品如10μl的样品加入到1ml的应用样品稀释液中，充分混匀待用。
肿瘤坏死因子TNFα
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
碧云天Mouse TNF-α ELISA Kit (小鼠TNF-α酶联免疫吸附检测试剂盒)说明书
Mouse TNF-α ELISA Kit产品编号 产品名称包装 PT512Mouse TNF-α ELISA Kit96次产品简介：碧云天的Mouse TNF-α ELISA Kit (Mouse Tumor Necrosis Factor-α Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测小鼠血清、血浆、细胞或组织裂解液、或细胞培养上清液中的TNF-α的试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。
多次重复检测结果表明，最小检出量为30.8pg/ml ，与人TNF-α、sTNF RIs 、TNF RII 等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
TNF-α，即TNF 、TNF α或TNFalpha ，也称cachectin 、cachexin 或TNFSF1A 。
TNF-α由巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞在细菌感染、内毒素刺激、病毒或寄生虫感染时产生。
肿瘤坏死因子超家族(Tumor necrosis factor superfamily)共约19个成员，包含由巨噬细胞等产生的TNF-α和T 淋巴细胞产生的TNF-β(也称Lymphotoxin-alpha)，以及FASL 、TRAIL 、CD40L 、CD27L 、CD30L 等。
TNF-α与TNF-β在结构上有一定的相似性，并且在氨基酸水平有28%的同源性，它们拥有共同的受体TNFR1和TNFR2。
由于TNF-α的生物学活性占TNF 总活性的70%~95%，因此目前常说的TNF 多指TNF-α。
TNF (Tumor Necrosis Factor)因为能诱导细胞死亡而得名，实际上其很多时候诱导的细胞死亡为细胞凋亡。
人TNF-α有两种形式，一种是由233个氨基酸组成的跨膜蛋白同源三聚体(homotrimers)，另外一种是该跨膜蛋白在TNF-α转化酶TACE(TNF-α converting enzyme)的作用下切除信号肽，形成成熟的157个氨基酸的可溶性TNF-α单体(分子量为17KDa)的同源三聚体。
大鼠(Rat)肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA检测试剂盒说明书
大鼠（Rat）肿瘤坏死因子α（TNF—α）ELISA检测试剂盒说明书大鼠（Rat）肿瘤坏死因子α（TNFα）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被肿瘤坏死因子α（TNFα）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子α（TNFα）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)生物学活性测定
响。因为 TNF-β 细胞毒生物学作用等很多生物学效应均与 TNF-α 相似。
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核-吞噬细胞产生的单核因子，不仅具有选择性 地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节作用。其检测方法主要包括生物学活性测定和免 疫学检测方法。其中细胞毒生物学检测方法敏感性较高，最为常用；免疫学检测方法包括酶 联免疫吸附试验(ELISA)和放射免疫测定法。
(一) 原理: TNF-α 受体广泛地分布于多种肿瘤细胞和血细胞，根据 TNF-α 与相应靶细胞结合后引 起不同的生物学效应，建立了多种检测 TNF-α 生物学活性方法。某些肿瘤细胞膜表面的 TNF-α 受体与 TNF-α 结合后，可导致这些肿瘤细胞的死亡，可通过检测对肿瘤细胞的杀伤 能力，来反映 TNF-α 的生物学活性。若这种肿瘤细胞先用 3H-TdR 标记，则被杀伤后３H-TdR 释放至细胞外，牽 I 通过测定肿瘤细胞释放３H-TdR 的量来反映 TNF-α 的杀伤活性。 (二) 操作步骤:
用 DYQ-Ⅱ型多头细胞收集器收集样品于 "9999"型玻璃纤维滤纸上
↓ 烤干后，进行 β 计数
结果判定:
1. TNF-α 作用 24h 后，在倒置显微镜下判定 50％L929 细胞杀伤的稀释度即为１个
TNF-α 活性单位。
2. 根据测得的 cpm 值按下列公式计数活性单位:
TNF-α 活性单位(U／ml)
对照组 cpm 值。
3. 胰蛋白酶和 DNA 酶浓度和消化时间要严格控制，犆?批酶均要摸索最适浓度和时间。
否则，消化时间过长或过短者会影响实验结果。
4. 为了增强检测系统的敏感性，在测定系统中加入放线菌素 D，但浓度不宜过大，一
般最终浓度为 0.5～1μg／ml。
四正柏生物 人类TNF-α ELISA试剂盒说明书
REV20190712仅供研究，不用于临床诊断。
客服热线: 400-7060-959﹡技术支持邮箱: **************公司官网: 目录简介 ......................................................................................................................................................................... - 3 -检测原理 ................................................................................................................................................................. - 3 -试剂盒组分 ............................................................................................................................................................. - 4 -储存条件 ................................................................................................................................................................. - 5 -其他实验材料 ......................................................................................................................................................... - 5 -注意事项 ................................................................................................................................................................. - 5 -样本收集处理及保存方法 ..................................................................................................................................... - 6 -试剂准备 ................................................................................................................................................................. - 6 -操作步骤 ................................................................................................................................................................. - 7 -操作流程图 ............................................................................................................................................................. - 8 -操作要点提示 ......................................................................................................................................................... - 8 -结果判断 ................................................................................................................................................................. - 9 -结果重复性 ........................................................................................................................................................... - 10 -灵敏度 ................................................................................................................................................................... - 10 -特异性 ................................................................................................................................................................... - 10 -参考文献 ............................................................................................................................................................... - 10 -该产品由北京四正柏生物科技有限公司研制。
人肿瘤坏死因子α(TNF-α)说明书
人肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，细胞上清及相关液体样本中肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平。
用纯化的人肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子α，再与HRP标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子α呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人肿瘤坏死因子α（TNF-α）浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：450pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
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人肿瘤坏死因子-αELISA试剂盒产品编号：SEKH0047适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本仅供研究，不用于临床诊断目录背景介绍 (01)检测原理 (01)注意事项 (02)安全提示 (02)试剂盒组成及储存 (03)自备实验器材 (03)样品收集及储存 (03)试剂准备 (04)检测步骤 (06)结果判断 (06)参数表征 (07)参考文献 (09)常见问题分析及解决办法 (10)背景介绍：TNF-α是一种主要由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子。
人的TNF-α约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。
人TNF-α分子量为17kDa。
在氨基酸水平上，人与鼠的TNF-α有79％同源性，TNF-α的生物学作用无明显的种属特异性。
人类多种细胞均可表达TNF-α，包括B细胞，结肠柱状上皮细胞，NK细胞，巨噬细胞，单核细胞，肥大细胞，中性粒细胞等。
TNF-α的生物学活性非常复杂，包括对造血、免疫和炎症的调节；对血管和凝血的影响和对多种器官（肝、心脏、骨、软骨、肌肉和其它组织）的作用。
检测原理：本ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。
将抗人TNF-α单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人TNF-α会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入生物素化抗人TNF-α抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人TNF-α发生特异性结合；洗板后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素，生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人TNF-α，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人TNF-α浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人TNF-α的浓度。
原理图：注意事项：1.试剂盒应在有效期内使用，请不要使用过期的试剂。
2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱，已复溶但未用完的标准品，请丢弃。
3.试剂盒使用前请在室温恢复30min，且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测，且加入试剂的顺序应保持一致。
5.为避免交叉污染，请在试验中使用1次性试管，枪头，封板膜（※）及洁净塑料容器。
.6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少，在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶盖上，使用前请离心处理（5-10S即可），使管壁上的液体集中在管底部，取用时，请用移液器小心吹打几次。
7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外，请不要使用其他来源试剂盒内含的试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
8.为保证结果准确，每次检测均需做标准曲线。
安全提示：试剂盒中的终止液为酸性溶液，操作人员在使用时请带上手套并注意防护；在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛，如果不慎接触，请用大量清水清洗；检测血液样本及其它体液样本时，请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。
试剂盒组成及储存：试剂盒组成规格（96T）规格（48T）保存条件抗体预包被酶标板8*128*62-8℃标准品2支1支-20℃SR1标准品/样本稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩生物素化抗体120ul(100X)60ul(100X)2-8℃SR2生物素化抗体稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩酶结合物（避光）120ul(100X)60ul(100X)2-8℃SR3酶结合物稀释液16ml/瓶8ml/瓶2-8℃浓缩洗涤液（20×）30ml/瓶15ml/瓶2-8℃显色底物（避光）12ml/瓶6ml/瓶2-8℃终止液12ml/瓶6ml/瓶2-8℃封板胶纸4张2张说明书1份1份自备实验器材（不提供，可代购）1．酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）2．高精度移液器及一次性吸头：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl3．洗板机或洗瓶4．37℃孵育箱5．双蒸水，去离子水，量筒等6．稀释用聚丙烯试管样本收集及储存：1.细胞培养上清：将细胞培养基移至无菌离心管，在4℃条件下1000×g离心10min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。
2.血清样本：室温血液自然凝固20min后，在4℃条件下1000×g离心10min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），保存过程中如有沉淀，请再次离心，避免反复冻融。
3.血浆样本：将全血收集到含抗血凝剂的管中，根据标本的实际要求选择EDTA，柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合20min，在4℃条件下1000×g离心10min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存（24小时内检测可放入2-8℃储存），避免反复冻融。
※注意：血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本，以免影响检测结果；如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值，请将样品做适当倍数稀释后检测，建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。
试剂准备：1.试剂回温：首先在实验前30min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
2.配制洗涤液：预先计算好稀释后的洗涤液使用体积，然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液，未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
3.标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液（SR1）1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为2000pg/ml)，然后在其余七管中各加入500 L标准品/样本稀释液（SR1），按照以下浓度进行2倍稀释：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62pg/ml进行稀释。
1000pg/ml为标准曲线最高点浓度，标准品/样本稀释液（SR1）作为标准曲线的零点（0pg/ml）。
复溶过的标准品原液（2000pg/ml）未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装，并将其贮存在-20～-80℃冰箱，具体如下图。
4.生物素化抗体工作液：预先计算好试验所需用量，用检测稀释液（SR2）将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液（稀释前充分混匀），请在30分钟内加入到反应孔中。
生物素化抗体工作液具体稀释方法如下：板条浓缩生物素化抗体（1:100）：μL检测稀释液（SR2）：μL220198044039606605940880792010100990012120118805.酶结合物工作液：按每次试验所需用量配制，用酶结合物稀释液（SR3）将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液（稀释前离心），请在30分钟内使用。
酶结合物工作液具体稀释方法如下：板条浓缩酶结合物（1:100）：μL检测稀释液（SR3）：μL220198044039606605940880792010100990012120118806.洗涤方法：●自动洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，注入洗涤液为300ul/孔,注与吸出间隔为30秒，洗板5次。
●手工洗板：甩尽酶标板孔中液体，在厚迭吸水纸上拍干，用洗瓶加入洗涤液300ul/孔，静止30秒后甩净酶标板孔中液体，在厚迭的吸水纸上拍干，洗板5次。
检测步骤：实验前30min,拿出试剂盒，恢复至室温，加入标准品/样本前，请洗板3次并甩干加入100μl标准品及检测样本至反应孔中,封板后于37℃孵箱孵育90min拍板&洗板4次加入100μl生物素化抗体工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育60min拍板&洗板4次加入100μl酶结合物工作液至反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育30min拍板&洗板5次加入100μl显色底物至反应孔中，封板后于37℃避光显色15min加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量OD值（5分钟内）结果判断：1.用酶标仪450nm波长测定OD值。
选择双波长检测，参考波长为630nm。
如不能进行双波长检测，请用450nm的OD测定值减去630nm的OD测定值。
2.计算标准品、样品的平均OD值：每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值3.以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，样品中TNF-α含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后重新检测，计算浓度时再乘以稀释倍数。
参数表征：标准品浓度(pg/ml)OD值1OD值2平均值矫正值00.0220.0360.029-------15.620.0710.0710.0710.04231.250.0990.1070.1030.07462.50.1630.1630.1630.1341250.3290.3140.3210.292 2500.6210.6220.6210.592 500 1.200 1.166 1.183 1.154 1000 2.227 2.275 2.251 2.2221.数据及标准曲线本图仅供参考，应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算人TNF-α的样本含量2.灵敏度：最低可检测人TNF-α浓度达8pg/ml，20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度。
3.特异性：不与人TNF-β，GM-CSF，s TNF RI，s TNF RII反应，小鼠TNF-α，s TNF RI等反应。
4.重复性：板内，板间变异系数<10%。
5.回收率：在选取的健康人血浆、细胞培养上清中加入3个不同浓度水平的人TNF-α，计算回收率。
样本类型平均回收率（%）范围（%）血浆9186-97细胞培养上清9891-1056.线性稀释：分别在选取的4份健康人血浆和细胞培养上清中加入高浓度人TNF-α，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。
稀释比例回收率(%)血浆细胞培养上清1:2平均回收率（%）8994范围(%)86-9389-1001:4平均回收率（%）9498范围(%)88-10191-105参考文献：1.Pennica,D.et al.(1984)Nature312:724.2.Wang,A.M.et al.(1985)Science228:149.3.Kriegler,M.et al.(1988)Cell53:45.4.Jacobsen,F.W.et al.(1994)A91:10695.5.Moss,M.L.et al.(1997)Nature385:733.6.Kwon,B.et al.(1999)Curr.Opin.Immunol.11:340.7.Wang,C.Y.et al.(1998)Science281:1680.8.Ishisaka,R.et al.(1999)J.Biochem.126:413.9.Idriss,H.T.and J.H.Naismith(2000)Microsc.Res.Tech.50:184.10.Wellmer,A.et al.(2001)Infect.Immun.69:6881.常见问题及解决方法：问题可能原因解决方法高背景或阴性对照值偏高洗板不充分将洗涤液注入反应孔充分洗涤，彻底拍干孔中液体酶结合物过量检查酶稀释度，按说明书标识的稀释度稀释底物污染加底物前检查底物是否为透明无色，请勿用变蓝的底物，重新用新的底物试验阴性对照孔被阳性对照污染注意洗涤时不要把洗液溢出孔外，不使阴阳对照孔液体涟接一起不同批次试剂混用检查试剂批号，请勿用不同批次试剂显色信号弱试剂过期检查试剂盒有效期，请勿用过期试剂孵育时间过短按说明书中规定的时间孵育试剂污染检查试剂是否污染，请勿用污染的试剂酶标仪滤光片不匹配检查酶标仪设置及滤光片是否匹配试剂盒平衡不充分确保试剂盒试验前平衡至室温显色时间不够增加底物显色时间无显色信号检测抗体、酶、或显色剂漏加检查试验操作流程，重复试验酶被叠氮钠污染请使用重新配制的试剂试剂添加顺序有误检查复核试验添加顺序、流程，重复试验标曲佳但样品孔无信号样品中靶标物含量低或样品中无靶标物设置阳性对照，重复实验样品基质效应影响检测重新稀释样品后复测标曲佳但样品信号偏高样品中待检物含量超过标准曲线范围重新稀释样品后复测边缘效应孵育温度不均衡孵育时每步均使用新的封板胶纸，避免在环境温度变化大的地方孵育，勿叠放反应板。