牛津杯和打孔法抑菌试验
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究
不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究作者：潘晓倩等来源：《肉类研究》2014年第12期摘要：目的：比较5种抗菌肽活性测定方法。
方法：以金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为实验菌株，研究牛津杯法、打孔法、滤纸片法、酶标比浊法和活菌计数法对不同质量浓度的抗菌肽抑菌活性评价的比较。
结果：3 种琼脂扩散定性抑菌实验中，打孔法灵敏度高，抑菌圈清晰规则，效果最好；2 种定量抑菌实验中，活菌计数法结果判定更直观，灵敏度高，效果最好。
结论：抗菌肽抑菌活性研究过程中，选用打孔法定性与活菌计数法定量相结合的方法，能够更全面、准确地反应其抑菌活性。
关键词：抗菌肽；抑菌活性；测定方法Abstract： Objective： To comparatively evaluate the performance of several antimicrobial peptide activity assays. Methods： Using Staphylococcus aureus， Staphylococcus haemolyticus and Bacillus subtilis as experimental strains， the antimicrobial activity of the antimicrobial peptide nisin at different concentrations was determined by Oxford cup method， punching method， filter paper method， microtiter plate assay and viable count method， respectively. Results： Among three agar-diffusion methods， punching method was the most sensitive， which provided clear and regular inhibition rings. Our comparison of two quantitative activity assays indicated that viable count method， showing high sensitivity and intuitive results， was better than microtiter plate assay. Conclusion： Combined application of punching method and viable count method allows comprehensive and accurate measurement of antimicrobial peptide activity.Key words： antimicrobial peptide； antimicrobial activity； assay中图分类号：TS251 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2014）12-0017-04抗菌肽是生物体在抵御病原微生物的防御反应过程中产生的一类具有抗菌作用的小分子多肽，其特有的氨基酸组成与结构可以破坏细菌细胞膜结构，导致其死亡[1-2]。
305 牛津杯法抑菌试验
牛津杯法抑菌试验1. 原理将加有牛津杯的双层平板置于培养箱中培养，一方面试验菌（病原菌）开始生长繁殖，另一方面抑菌物质呈球面扩散，形成递减的梯度浓度。
牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈，抑菌圈的大小反映抑菌物质对指示菌的抑制程度。
2. 仪器、设备2.1 超净工作台2.2恒温培养箱：36±1℃。
2.3恒温水浴锅：50±1℃。
2.4高压灭菌锅。
2.5平皿：直径为9 cm。
2.6 移液器（20~200μL，100~1000μL，1~5mL）及配套无菌枪头。
2.7试管：15×150 mm。
2.8 酒精灯。
2.9试管架。
2.10涡旋混匀器。
2.11摇床：36±1℃。
2.12牛津杯。
3. 病原菌、培养基及其他3.1病原菌：大肠杆菌：ATCC25922、沙门氏菌: ATCC14028、金黄色葡萄糖球菌：ATCC6538。
3.2 抑菌物质：益生菌（乳酸菌、芽孢菌）、抗生素或其它抑菌物质。
3.3 培养基：（1）大肠埃希菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（2）金黄色葡萄球菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（3）沙门氏菌：营养肉汤、营养琼脂半固体（琼脂粉含量：1%）、营养琼脂（琼脂粉含量：2%）。
（4）乳酸菌：MRS肉汤。
（5）芽孢菌：营养肉汤。
3.4 其它：0.85%灭菌生理盐水，灭菌蒸馏水。
4 测定流程4.1病原菌扩培：在超净工作台内，挑取新鲜的斜面保藏病原菌1环，接种于100mL无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶置于摇床内固定，37℃，200rpm，培养16-20h。
将培养好的病原菌菌悬液用空白营养肉汤培养基稀释10倍，若OD600在0.30-0.36之间，则为有效病原菌菌悬液，此时病原菌菌悬液原液中病原菌含量约为109cfu /ml。
4.2 抑菌物质（抗生素或益生菌菌悬液）的制备：（1）抗生素：抗生素或其它药物用无菌水稀释至所需要的浓度。
抑菌试验——精选推荐
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
牛津杯法抑菌试验步骤
牛津杯法抑菌试验步骤
一、准备试剂和器材
试剂：待测试的抑菌剂、无菌水、培养基（如LB、麦芽糖等）。
器材：移液管、无菌棉签、牛津杯、试管、培养箱、天平等。
二、制备菌液
从保存的菌种中取适量菌种，接种于无菌培养基中。
将培养基放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养至菌种生长至对数期。
将培养好的菌液用无菌棉签轻轻涂布于无菌平板上，观察菌落的形态和大小。
用移液管取适量的菌液，制备成一定浓度的菌悬液。
三、准备牛津杯
取一块无菌滤纸片，将其放入牛津杯中，使其贴紧杯壁。
用移液管将适量的抑菌剂加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录抑菌剂的种类和浓度。
四、加样
取适量的测试样品放入无菌试管中。
用移液管将样品溶液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
记录样品溶液的种类和浓度。
五、加菌液
用移液管将制备好的菌悬液加入牛津杯中，使其高度达到滤纸片上端边缘。
轻轻摇晃牛津杯，使菌悬液和样品溶液充分混合。
六、培养
将牛津杯放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察培养结果，记录细菌的生长情况。
七、结果观察
取出生长至对数期的细菌，用无菌棉签涂布于无菌平板上。
将无菌平板放入培养箱中，在适宜的温度和湿度条件下培养一定时间（如24小时）。
观察细菌的生长情况，记录细菌的数目和形态。
打孔法抑菌试验操作流程
打孔法抑菌试验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!打孔法抑菌试验是一种用于评估抗菌药物对细菌生长抑制效果的实验方法。
抑菌试验预习方案
抑菌试验1 定义抑菌试验，用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验抑菌活性的研究实验方案。
实验方法1. 纸片法（抑菌圈法）将测定菌株接种到培养基中，置37度条件下培养6-24小时，取出备用。
再用无菌吸管吸取上述培养液0.1ml，再用三角刮刀将菌液涂匀。
待培养基表面稍干后，用无菌小镊子分别取出所需的药敏纸片均匀地贴在培养基的表面，轻轻压平，各纸片间应有一定距离，并分别做上标记。
将培养皿置37度恒温箱内培养18-24小时后，测量各种药敏纸片抑菌圈直径的大小。
2. 挖孔法（1）在平板上打孔，然后将药液滴入孔内，用经酒精灯灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式：用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2，依次划线，自至细菌均匀密布于平皿（将测定菌株接种到培养皿中，置37度条件下培养18-24小时，用灭菌的棉拭子将带将细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀）。
（2）以无菌操作将灭菌的不锈钢小管，（外径4mm，孔径与孔距均为3mm，管的两端要光滑，也可用玻璃管和瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（3）加样时，按不同药液加样，用无菌滴管将样品加至满而不溢为止。
3. 牛津杯法（1）双碟的制备方法：将灭菌培养基溶化后取15ml倒入灭菌平皿内。
吸取待测菌株的菌液1-5ml与100ml冷至45度的培养基混匀，然后分别每一平皿加入5ml。
并均匀摊布在具有底层培养基的平皿内。
（2）待培养基凝固后，在每碟中均匀立放小钢管（及牛津杯）4个，用陶瓦盖覆盖。
（3）将下列实验药液分别加入小钢管中，置37度培养18-24小时，量取抑菌圈大小，判定抗菌药物抑菌作用的强弱。
乳酸菌的抑菌实验1产抑菌活性物质乳酸菌的初筛采用纸片法。
将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌培养液 OD 600分别调整到 0.17、0.19、0.10，各取 100μL 接种于 LB 固体培养基，涂布均匀，固定1h。
抑菌试验方法总结
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
牛津杯法抑菌试验的测定流程
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抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度 呈负相关，即
抑菌圈愈大，MIC愈小。
二、实验材料
• 培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 • 菌种：
大肠杆us aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)
• 药品：阿莫西林、黄芪多糖、 • 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、移
液枪、 1mL、200uL 枪头、 恒温培养箱、 超净工作台、 接种环
牛津杯
• “牛津杯”是放被测抗生素的不锈钢小管，小管内径为
6mm，外径为8mm，高10mm的圆筒形管子，管子的重量 尽可能相等。
三、实验操作 1. 倒平板：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培
注意事项
• 在超净工作台中或酒精灯旁操作 • 平板倒好，一定要平 • 牛津杯立直，才能保证杯内抑菌物质均匀的向四周扩散 • 牛津杯均匀摆放于培养基上，位置安排适中，防止出现抑
制圈重叠，可在平皿中央摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
• 青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
药敏试验
• 抗菌药物敏感性试验，简称药敏试验，是指对敏感性不能
预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生 物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见 病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药
牛津杯法和打孔法抑菌试验
扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法。 由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数 实验室和基层单位所采用
• 稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含
不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度 （MIC）。
• 扩散法
一、实验原理
将培养基平板置培养箱中培养，一方面试验菌（指
养皿内，每皿约20ml，凝固。 2. 标记：菌种、牛津杯摆放位置、药物及其 浓度 3. 制备菌悬液：用生理盐水洗下试管内的菌苔并稀释。 4. 菌液涂布：吸取1mL 菌液入平板表面，用涂布器涂布将菌 液涂布均匀
5. 摆放牛津杯：在培养基表面垂直摆放牛津杯，轻轻加压， 使其与培养基接触无空隙。 6.加入待检药液：在杯中加入不同稀释度的药液或待检样品。 7. 孵育：加满后在37 ℃培养16~18 h。 8. 结果报告：用毫米尺量取抑菌圈直径，参考表的标准判读 结果，按敏感（S）、中介（I）、耐药（R）报
示菌）开始生长繁殖；另一方面抗生素呈球面扩散， 形成递减的梯度浓度，离杯越近，抗生素浓度越大， 离杯越远抗生素浓度越小。
在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，
形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度
（药敏实验）或药物对指示细菌的抑菌程度（抑菌 试验）。
一、实验原理
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。 在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌物质的浓度即为