stratagene品牌的点突变试剂盒的Protocol
一管式点突变试剂盒使用说明
一管式点突变试剂盒使用说明One-Stop Point mutation Kit产品及特点基因的定点突变是重要的分子生物学技术，广泛用于载体构建、基因改造、蛋白质功能研究等领域。
但传统的方法需要使用单链DNA模板，而得到单链DNA模板又需要先将基因克隆到类似M13这种载体中，操作过程冗长。
为了克服这些缺点，本公司将突变位点设计到一对互补的引物中，用高保真扩增质粒模板，然后用Dpn I去除原始的甲基化模板，新合成的DNA通过互补形成带切口的双链质粒，直接用于转化感受态细菌。
本方法过程示意图如下：本产品具有下列特点：1.直接使用质粒DNA作为模板，免去了制备单链DNA的步骤。
2.基于高保真PCR，对模板DNA序列没特殊要求，可以用于突变任何序列。
同时对模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一个优化的缓冲体系中完成，非常简单。
4.使用Dpn I去除未突变模板，突变效率高达90%。
5.可用于制备点突变，缺失突变和插入突变。
6.本产品A型适用于8kb一下，B型适用于8-15kb。
规格及成分成份A型10次包装B型10次包装高保真酶A型10uL无高保真酶B型无10uL5×高保真酶Buffer A型100uL无5×高保真酶Buffer B型无100uLdNTP（2.5mM each）50uL50uLDpn I酶10uL10uL超纯水1mL1mL使用手册1份1份运输及保存低温运输、-20℃保存,有效期一年。
自备试剂质粒DNA、突变引物、细菌转化试剂使用方法一、引物设计及注意事项用于特定基因突变的引物必须用户单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计。
1.共需设计两条完全互补的一对引物，它们覆盖要扩增的突变区位点，突变位点最好放在引物的中心。
可以先集中设计一条，然后就可得互补的另一条引物。
2.引物的长度通常为25-45个碱基。
引物中突变位点任何一侧都必需满足Tm大于45的条件，Tm计算方式为Tm=4×(GC碱基数)＋2×(AT碱基数)。
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明
DNA定点突变实验具体步骤及详细说明定点突变是指通过聚合酶链式反应(PCR )等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化), 包括碱基的添加、删除、点突变等。
一、引物设计每条引物都要携带有所需的突变位点,弓I物一般长25~45 bp ,设计的突变位点需位于引物中部。
二、反应1.使用高保真的pyrobest DNA聚合酶，循环次数少，一般为12个循环。
2.反应体系：(1) 10x pyrobest Buffer: 5 ul(2 ) dNTP Mixture(10 mM) : 1 ul(3 )模板DNA(5~50 ng) : lul(4) primer 1 (125 ng) : 1 ul(5 ) primer 2 (125 ng) : 1 ul(6 ) pyrobest DNA polymerase ( TaKaRa ) (5 U/ul) : 0.25 ul(7 )加无菌蒸憎水至50ul.三.产物沉淀纯化1.加1/10体积的醋酸钠，1倍体积的异丙醇，混匀置冰上(或-20°C冰箱)5min ,离心弃上清。
2.70-75%乙醇洗盐两次，烘干后溶于无菌水中(此步可省略，直接用Dpnl 酶切)。
四、Dpnl酶切1.酶切体系(1) Buffer : 2 ul(2 ) BSA (100x ) : 0.2 ul(3 ) DNA : xul(4) Dpnl: 0.5 ul(5 )加无菌去离子水至20 ul。
2.3(TC酶切1~4 h。
3.65°C水浴15min终止反应。
五、转化将酶切产物转化大肠杆菌DH5a菌株,利用抗生素筛选突变子。
六、测序验证注意事项1.引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。
定点突变——精选推荐
定点突变基因定点突变⼀、定点突变的⽬的把⽬的基因上⾯的⼀个碱基换成另外⼀个碱基。
⼆、定点突变的原理通过设计引物，并利⽤PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就⾏了。
三、引物设计原则引物设计的⼀般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
⼀般都是以要突变的碱基为中⼼，加上两边的⼀段序列，两边长度⾄少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物⾄少要11-12个bp才能与模板搭上，⽽这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设⾄少12个bp，并且合成多⼀条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应⼤于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应⼤于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使⽤经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTA TTGCGG-3’（1）⾸先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带⼊Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
点突变试剂盒SMK-101操作流程详解
[３] 制品内容............................................................................................................... 3
[４] 注意事项............................................................................................................... 3
（１）相关培养基和试剂的组成 ............................................................................. 10 （２）相关产品 ......................................................................................................... 11
艾德人类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）
艾德⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）受理号：CSZ1700127体外诊断试剂产品注册技术审评报告产品中⽂名称：⼈类10基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终⽌测序法）产品管理类别：三类6840申请⼈名称：厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司国家⾷品药品监督管理总局医疗器械技术审评中⼼⽬录基本信息 (3)⼀、申请⼈名称 (3)⼆、申请⼈住所 (3)三、⽣产地址 (3)产品审评摘要 (4)⼀、产品概述 (4)⼆、临床前研究摘要 (7)三、临床评价摘要 (15)四、收益-风险评估 (24)综合评价意见 (28)基本信息⼀、申请⼈名称厦门艾德⽣物医药科技股份有限公司⼆、申请⼈住所厦门市海沧区⿍⼭路39号三、⽣产地址厦门市海沧区⿍⼭路39号产品审评摘要⼀、产品概述（⼀）产品主要组成成分表1 试剂盒主要组成成分试剂盒具体组成成分、配套试剂及软件见说明书。
（⼆）产品预期⽤途本试剂盒⽤于定性检测⾮⼩细胞肺癌（NSCLC）、结直肠癌（CRC）患者经中性福尔马林固定的⽯蜡包埋（FFPE）的组织样本中EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HE R2/MET基因变异。
其中，针对NSCLC，EGFR基因中：19号外显⼦缺失（19del）、L858R点突变⽤于吉⾮替尼⽚的伴随诊断检测，T790M点突变⽤于甲磺酸奥希替尼⽚的伴随诊断检测；AL K基因重排（融合）和ROS1基因重排（融合）⽤于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测；针对CRC，KRAS基因野⽣型⽤于西妥昔单抗注射液的伴随诊断检测；如表2所⽰。
表2 伴随诊断⽤途的基因变异类型及相应的靶向药物表3中为本试剂盒可以检出，但未经伴随诊断验证的基因变异类型。
表3 未经伴随诊断⽤途验证的基因变异类型其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯⼀依据。
临床医⽣应结合患者病情及其他实验室检测指标等因素对检测结果进⾏综合判断。
（三）产品包装规格24测试/盒（四）产品检验原理本试剂盒通过构建样本DNA测序⽂库，并使⽤特异探针对⽂库进⾏⽬标区域捕获富集，捕获后的⽂库通过⾼通量测序，可实现多个基因多个突变的⼀次性检测。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用摘要：本文综述了基因定点突变的三种方法，在此基础上的一些改进方法及其应用，并对这三种方法进行了比较。
关键词：定点突变；寡核苷酸引物；PCR；盒式突变Methods of Site-directed Mutagenesis and Their ApplicationAbstract: In the paper，methods of site-directed mutagenesis，some advanced methods on the basic methods and their application are present. At the same time，the comparison are made .Key words: site-directed mutagenesis；oligonucleotide；PCR；cassette mutagenesis定点突变技术可以随心所欲地在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段。
该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变牢高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病因和机理。
随着分子生物学研究的突飞猛进，基因定点突变技术成为一项重要的分子生物学实验技术手段，在生物和医学领域中的应用非常广泛。
目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变及盒式突变等[1]。
1常用定点突变方法1.1核苷酸引物介导的定点突变其原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。
主要的过程(见图1)：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA，④合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产牛闭环的异源双链的DNA分子；⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子。
q5点突变试剂盒原理
q5点突变试剂盒原理宝子们！今天咱们来唠唠这个超酷的Q5点突变试剂盒的原理呀。
你知道吗，这个Q5点突变试剂盒就像是一个基因编辑小能手。
它主要是在DNA这个超级神奇的分子上做文章呢。
DNA就像一个超级精密的密码本，里面的每个小片段都有着至关重要的信息。
那这个试剂盒怎么开始它的魔法之旅的呢？它呀，是针对DNA序列中的某个特定的点来搞事情的。
比如说，在DNA长长的链条里，有一个地方的碱基就像一个调皮的小捣蛋鬼出了错，或者我们想要让这个地方变得不一样，就像给一个原本很普通的小房子来个超级大变身。
Q5点突变试剂盒就可以上场啦。
这个试剂盒里有一些超级厉害的酶呢。
这些酶就像是一群超级小工匠，它们的任务就是找到那个我们想要改变的特定位置。
你可以想象这些酶就像有着超级灵敏鼻子的小侦探，在DNA这个大迷宫里，一下子就能嗅出目标地点。
一旦找到了那个特定的碱基位置，这些小工匠酶就开始动手啦。
它们会把原来的碱基给替换掉，就像把一个旧的零件从一个超级精密的机器里取出来，然后再换上一个新的零件。
这个过程可不像我们想象的那么简单粗暴哦。
它是非常精准的，就像在一个满是细沙的沙滩上，只挑出一粒沙子来换掉，还不会影响到周围的沙子。
而且呀，这个试剂盒还会提供一些特殊的“建筑材料”，也就是新的碱基。
这些新的碱基就像是专门定制的小零件，刚好能够完美地契合到被改造的位置上。
这个过程其实就像是一场超级微观世界里的魔法秀。
这个Q5点突变试剂盒的原理，其实就是利用生物化学的神奇力量，在微观的DNA 世界里进行一场精确的改造手术。
它让科学家们能够像魔法师一样，对基因进行微调。
这在很多方面都超级有用呢。
比如说在研究疾病的时候，如果发现某个基因里有一个小小的错误导致了疾病，就可以用这个试剂盒来模拟修复这个错误，看看能不能找到治疗疾病的新方法。
又或者是在研究生物进化的时候，可以通过改变某些基因的特定点，来看看生物会发生什么样有趣的变化。
这个试剂盒就像是打开微观基因世界大门的一把神奇钥匙，让我们能够在这个超级神秘又超级有趣的世界里自由探索，按照我们的想法去改变一些东西，就像玩一个超级微观的创意游戏一样。
赛百盛定点突变试剂盒
定点突变试剂盒定点突变试剂盒概述：定点突变试剂盒可以在克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。
理论上可以保证突变率达到100%。
整个实验过程简单快捷只需要两个步骤。
试剂盒不需要用到M13载体和甲基化步骤。
该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变、再突变成野生型、密码子突变、插入或者缺失等，因此可以用于功能基因组学和蛋白质组学的研究。
另外由于试剂盒能够诱导特异基因突变，又可以应用于蛋白质工程学研究领域。
定点突变试剂盒操作十分简单（根据我们提供的引物设计原则设计引物；用Muta-directTM酶进行15~18个循环的PCR扩增反应；MutazymeTM酶处理选择突变克隆；转化）。
理论上在LB平板上的克隆100%是突变克隆，通过对突变克隆的测序分析，正确的突变可以应用于后续实验。
目录号规格价格SDM-15 15次950元产品特点:4. 样品反应体系（50μl反应体系）10x reaction buffer 5μl Sample plasmid （10ng/μl，total 20ng）2μl Sample primer (F) （10pmol/μl)1μl Sample primer (R) （10pmol/μl)1μl dNTP mixture（each 2.5mM）2μl dH2O 38μl Muta-directTM Enzyme 38μl5. PCR反应条件[注]按如下参数设置PCR扩增条件。
6. PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。
注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。
[B] 突变质粒选择PCR反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
1. 准备PCR反应产物。
2. 加入1μl（10U/μl）MutazymeTM酶37℃温育 1小时。
[注]当质粒DNA用量过多时MutazymeTM酶可能发生与样品反应不完全的现象。
定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
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Hieff Clone TM One Step Pcr Cloning Kit一步法（快速/无缝）克隆试剂盒是一款简单、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点，可高效克隆50 bp～10 kp 片段。
将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列(15 bp～20 bp)。
将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。
克隆阳性率可达95%以上。
克隆载体酶切产物或PCR产物和插入片段PCR产物可以不进行DNA纯化直接用于重组克隆，极大的简化了实验步骤。
试剂盒中包含有重组反应所需缓冲液和重组酶Exnase，Exnase中添加了独特的重组增强因子，显著提高重组克隆效率，即便使用低效率感受态细胞 (107 cfu/μg)也可实现高效克隆 (100 cfu/ng Vector)，而且Exnase还兼容常规酶切、PCR反应体系。
一步法（快速/无缝）克隆试剂盒可用于快速克隆、高通量克隆、无缝克隆和DNA定点突变。
产品组分运输与保存方法冰袋（wet ice）运输。
产品-20 ºC保存。
实验流程实验流程概览1)线性化克隆载体制备；2)插入片段扩增引物设计；3)插入片段PCR扩增；4)进行重组反应；5)反应产物转化、涂板；6)克隆鉴定。
图一实验流程概览注：插入片段PCR扩增时，引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列 (图中以蓝色和橙色标记)，使得扩增产物5’和3’最末端序列分别和线性化克隆载体两末端序列完全一致。
1.制备线性化克隆载体选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。
推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。
当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。
线性化载体可通过限制性内切酶酶切（单酶切或双酶切）或反向PCR扩增获得。
A．酶切制备线性化克隆载体双酶切线性化：线性化完全，转化背景 (假阳性克隆) 低。
推荐使用。
单酶切线性化：线性化程度较差。
可适当延长酶切时间以降低转化背景。
注：1）Hieff Clone TM重组反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。
因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。
重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由未线性化环状载体转化而形成的。
如这种假阳性克隆比例较高，应重新制备线性化克隆载体。
2）Hieff Clone TM重组反应体系兼容几乎所有的酶切反应体系。
克隆载体酶切产物加热失活内切酶(参见内切酶使用说明书，例如Hind III，65℃孵育20 min完全失活)后可直接用于重组反应。
B．反向PCR扩增制备线性化克隆载体推荐您使用高保真聚合酶进行载体扩增 (Hieff TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以减少扩增突变的引入。
PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff Clone TM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。
因此，如扩增模板为预线性化质粒且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
克隆载体酶切产物或PCR 扩增产物DNA 纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。
因此，在进行较大片段(>5kb) 克隆时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对线性化克隆载体进行胶回收纯化，以提高DNA 纯度并去除一部分未线性化的环状载体 (其电泳位置不同于线性化克隆载体)。
不同方式制备的线性化克隆载体的使用方式可查阅表一。
表一：线性化克隆载体的使用方式注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）2.制备PCR产物2.1设计扩增引物Hieff Clone TM引物设计总的原则是：通过在引物5’端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。
正向扩增引物设计方式：5’——上游载体末端同源序列+基因特异性正向扩增序列——3’反向扩增引物设计方式：3’——基因特异性反向扩增序列+下游载体末端同源序列——5’基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；上游/下游载体末端同源序列为线性化克隆载体最末端序列（用于同源重组）。
以pUC18作为克隆载体为例，引物设计方案如图二所示。
图二重组引物设计方案注：如最终引物长度超过40bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。
计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。
2.2 插入片段PCR扩增插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A加尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。
我们推荐您使用高保真聚合酶进行扩增(Hieff TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以减少扩增突变的引入。
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。
Hieff Clone TM重组反应体系兼容常规PCR反应体系。
因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。
PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。
因此，在进行较大片段 (>5 kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。
插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
表二：扩增产物推荐使用方式注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4μl（重组反应总体积的1/5）*当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI对克隆载体的降解。
3.重组反应3.1 配制反应体系于冰水浴中配制如下反应体系。
如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。
ddH2O Up to 20 μl5×CE Buffer 4 μl线性化克隆载体50～200 ng插入片度扩增产物20～200 ngExnase 2 μlHieff Clone TM重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06 pmol。
这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)最适插入片段使用量 = [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)例如，将长度为2 kb的插入片段克隆至长度为5 kb的克隆载体时，克隆载体的最适使用量应为：0.02 × 5000 = 100 ng; 插入片段最适使用量应为：0.04 × 2000 = 80 ng。
注：1. 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体/克隆载体当做插入片段进行计算。
2. 线性化克隆载体的使用量应在50～200 ng之间；插入片段扩增产物的使用量应在20～200 ng之间。
当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。
例如，插入片段长度为100 bp，最适使用量计算值为 4 ng，实际反应体系内使用量应为插入片段扩增产物最少使用量 20 ng。
3. 线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4 μl。
4. 试剂盒中提供500 bp control insert (25 ng/μl) 和pUC19control vector, linearized (50 ng/μl) 各5 μl，需要时可进行阳性对照反应，每次反应各加1 μl。
3.2 重组反应1)体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀) 。
2)置于37℃反应30 min。
3)待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5 min。
4)反应产物可直接进行转化；也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
注：我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。
重组效率在反应30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
4.重组产物转化、涂板1)取20 μl冷却反应液，加入到200 μl感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
2)42℃热激45～90秒，冰水浴孵育2 min。
3)加入900 μl SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。
37℃摇菌45 min。
4)取100 μl菌液均匀涂布在含有适当抗生素的平板上。
将平板倒置，于37℃过夜培养。
注：我们推荐您使用转化效率>108 cfu/μg的感受态细胞。
如果感受态转化效率<108 cfu/μg(例如用CaCl2法新鲜制备的感受态转化效率通常在106-107 cfu/μg之间) ，请将培养菌液在5000 rpm离心3 min收集菌体，用100 μl LB培养基重悬后全部涂板。
5.克隆鉴定最方便快捷的方法是菌落PCR。
用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20～50 μl LB 培养基中混匀，直接取1 μl作为PCR模板。
我们推荐您至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。
将PCR阳性菌落的剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB培养基中培养过夜，提取质粒做后续的鉴定。
Hieff Clone TM Multi One Step Cloning Kit是一款简单、快速、高效的多片段DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任意载体的任意位点。
将载体在克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物5’端引入线性化克隆载体末端序列，使得插入片段PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (15 bp～20 bp)。
将这种两端带有载体末端序列的PCR产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在重组酶Exnase的催化下，仅需反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。