皮肤细胞培养影响因素的探究
老化皮肤成纤维细胞的研究进展
白ＡＰ一１，调节帅一１，３基因的表达，从而调控删Ｐｓ的表达，
降解胶原【１９】。研究人员进一步证实，自然老化皮肤的胶原降 低是由于成纤维细胞合成胶原减少，分泌的ＭＭＰ一１，２增加， 而光老化皮肤的胶原减少主要是成纤维细胞分泌Ｍ肝增加， 而胶原合成下降不明显嘲。Ｍ肝活性增强，降解胶原纤维、弹 性纤维和基质增多，导致皮肤松弛，出现较深皱纹。 真皮组织结构的维持除了与ｌｄｌｄＰｓ活性有关之外，还与 其组织抑制剂ＴＩＭＰ关系密切。近年来相关研究表明［２１１，ＭＭＰｓ 分泌增加，或者ＴＩＭＰ分泌减少均使胶原分子细胞内降解增 加。例如局部应用脱氢表雄酮可以诱导成纤维细胞表达转化 生长因子一１３和结缔组织生长因子，抑制ⅦＶｌＰ－１合成，促进 ＴＩＭＰ一１分泌，使胶原合成增ｊ］ｇｔ２ｚｊ。
ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ，２００１，３８９（１）：１－６．
［１６］Ｂｅｍｅｂｕｒｇ Ｍ，Ｐｌｅｔｔｃｎｂｅｒｇ Ｈ，Ｋｒｕｔｍａｌｍ Ｊ．Ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ ｏｆｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ 硼．ＰｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌＰｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｌ Ｐｈｏｔｏｍｅｄ，２０００，１６（６）：２３９—２４４． 【１７］Ｋｏｎｄｏ Ｓ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆｅｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｐｈｏｔｏａｇｉｎｇ【刀．Ｊ Ｄｃｒｍａｔｏｌ Ｓｃ皮肤科杂志，２００３，３２（Ｄ：４２４－４２６． 【１５］Ｂｉｅｓａｌｓｋｉ ＩｌＫ，Ｏｂｅｒｍｕｅｌｌｅｒ－Ｊｅｖｉｃ ＵＣ．ＵＶ ｌｉｇｈｔ，ｂｅｔａ－ｃａｒｏｔｅｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ－ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｈａｒｍｆｕｌ ｅｆｆｅｃｔｓ【Ｊ】．Ａｒｃｈ
凋亡［７】。
星状。细胞核较大，扁卵徊形，着色浅，核仁明显Ⅲ。细胞质较 丰富，呈弱嗜碱性。胞质内有较多的核糖核酸，碱性磷酸酶的 活性很强。电镜下，细胞表面有一些微绒毛和粗短的突起，胞 质内富含粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。 成纤维细胞的超微结构表明，细胞合成蛋白质功能旺 盛。成纤维细胞既合成和分泌胶原蛋白，弹性蛋白，生成胶原 纤维、网状纤维和弹性纤维，也合成和分泌糖胺多糖和糖蛋 白等基质成分“】。在婴儿和青年人皮肤中，Ｉ犁胶原蛋白的含 量约占７０％，ＩＩＩ型胶原蛋白占３０％。在衰老过程中，成纤维 细胞合成Ｉｌｌ型胶原蛋白增加，Ｉ型胶原蛋白减少。成纤维细 胞受损，还町以产生大量异常弹性蛋白，导致皮肤弹性下降， 皱纹增多，且难以平复。
重组人表皮细胞生长因子对人皮肤细胞增殖作用的研究
・
Ｉｌ ｎ 重组人表 皮细胞 生长因子 处理后细胞增 殖明显 ， Ｓ和 ／ 期 细胞 数明显增加 。结论 ： Ｍ 重组人表 皮细胞 生长 因子 可促进 细
液， 继续培养 ４ ， ８ｈ结束前 ４ｈ加 １ １ Ｔ ， ， Ｏ Ｔ 常规终 止实验 ， Ｍ 与酶联免疫检测仪 上测各孔 吸光值 ， 波长 ４０ Ｉ。按下列公式 ９ ｎ ｎ 计算相对增殖率 （ ｅ ｔ ｅｇｏ ｈｒｔ，Ｒ Ｒ）Ｒ Ｒ ｌ ｉ ｒｗｔ ａｅ Ｇ ： ＧＲ一 给药孑 ａｖ Ｌ 吸光 度值 ／ 对照孔吸光度值 ×１０ 。 ０ １ ２ ３ 流式 细胞仪检测细胞周期 以及 蛋 白的表 达 接 种 ２ ． ． × １ Ｏ个细胞 于 ７ ｍ 培养 瓶 中， 细胞 贴壁 后加 入 不同 浓度 的 ５ｉ 待 ｒＥ Ｆ作用 于细胞 ４ ｈＧ ８小时 ， 收集细胞 ， 流式细胞仪检测 细胞 的
床应用价 值。在制 备过程 中不 同的提取 以及 纯化 方法对多肽 的活性影 响较 大 ， 文就 应用 细菌发 酵法 获得 的 ｒＥ Ｆ对人 本 ｈＧ
表皮细胞的增 殖作用进行研究 。
２ 结 果
２ １ 细胞形态学观察 ． 光学显微镜下 ， 正常生长的细胞大多呈椭 圆形 ， 胞体较 大 ， 界 限清楚（ １ 。 图 ）
数， 并用台盼兰染色 ， 了解 细胞 存活率 。将 上述细 胞悬液 按一 定细胞密度接种于培养皿 中， ３ 置 ７℃， Ｃ ２ ５ Ｏ 孵箱 中； 天～３ ２ ２ ２ 重组人表皮细胞 生长 因子对表皮细胞增殖率 的影 响 ． 通过 ＭＴ Ｔ法测定 细胞 的增殖 ，ｈ ＧＦ在 浓 度为 ５ １０ ｒＥ ～ ０ ｎ Ⅱｌ ｇ・ １ 均可 以促进 人表皮细 胞的生 长 ， １ ｇ・ｍ１ 时促 在 Ｏｎ － １ 取 对数 生长期 细胞 １ ５ ． × 进细胞的生长作用最为明显 。
胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响
17卷1期2002年1月生 物 工 程 学 报Chinese J ournal o f Biotechnology Vol.18 No.1January 2002收稿日期:2001 07 09,修回日期:2001 10 17。
基金项目:部分得到国家高技术研究发展计划课题(No.102 09 05 04)和国家重点基础研究发展规划 组织工程的基本科学问题 项目的资助(No.G1999054309)。
*通讯作者。
Tel:86 21 64250948;Fax:86 21 64253904;E mail:wstan@ecus .c n胰酶对皮肤角质细胞分离和传代的影响欧阳安力 周 燕 华 平 谭文松*(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237)摘 要 考察不同的胰酶浓度及其作用时间对角质细胞分离和传代的影响。
实验发现在胰酶浓度0 25%时作用5min 可获得的总活细胞量和有克隆形成能力的细胞量均优于其它培养条件;而在胰酶浓度0 05%时作用5min 可获得最大的原代角质细胞贴壁率。
随着胰酶浓度的提高,传代角质细胞的贴壁率和贴壁速率常数以及克隆形成率均随之增加,因此在传代培养时使用0 25%胰酶浓度进行消化较为适宜。
关键词 角质细胞,胰酶,贴壁率,克隆形成率中图分类号 R739 6 文献标识码 A 文章编号1000 3061(2002)01 0059 04大面积烧伤病人及皮肤病患者的临床治疗对皮肤组织的需求一直很大,但临床上能够获得的供体皮肤组织十分有限。
1975年Green 等人首先培养成功人工皮肤组织[1],并成功地用于皮肤缺损患者的治疗[2~3],成为烧伤治疗领域里的一个里程碑。
现在已有公司开发出了商品化的皮肤[4],这些皮肤都是由皮肤细胞和不同的基质材料构成,构成皮肤组织时需要大量的成纤维细胞和角质细胞等种子细胞,所以皮肤种子细胞的培养是当前皮肤组织工程中一个十分重要的研究课题。
皮肤下的探索者——生物科学实验
皮肤下的探索者——生物科学实验人类对于自身身体的了解一直是一个长期以来的课题。
而在这个追求知识的道路上，生物科学实验作为一种重要的工具，为我们带来了许多关于人体的发现和认识。
其中，对皮肤的研究更是引起了广泛关注。
本文将介绍一些关于皮肤下的探索者——生物科学实验，展示这些实验对我们对皮肤的认识和研究所做出的贡献。
第一部分：皮肤的结构在了解皮肤科学实验前，我们首先需要了解皮肤的结构。
皮肤是人体最大的器官之一，由表皮、真皮和皮下组织三层构成。
表皮是皮肤最外层的一层，由多层角质细胞组成，起到保护作用。
真皮则是位于表皮下的一层，包含有血管、神经、毛囊等重要组织。
皮下组织位于真皮下方，主要由脂肪组织构成，提供绝缘和保暖功能。
第二部分：生物科学实验解密皮肤1. 皮肤荧光成像皮肤荧光成像是一种非侵入性的实验技术，通过观察皮肤上的荧光信号来了解皮肤的生理功能和代谢状态。
这项技术可以帮助科学家们观察到皮肤微细结构的变化，发现病变区域并进行早期干预。
例如，皮肤癌在早期通常并不容易被察觉，但通过皮肤荧光成像技术，科学家们可以发现癌细胞的荧光信号的异常，并及时进行诊断和治疗。
2. 皮肤细胞培养通过皮肤细胞培养，科学家们可以获得大量的皮肤细胞，进行各种实验研究。
皮肤细胞培养技术可以被应用于很多方面，比如研究皮肤细胞的生长和分化机制、发现新的药物和治疗方法等。
同时，通过培养和研究皮肤细胞，科学家们也能够更好地了解皮肤疾病的发展过程，从而找到更有效的治疗方法。
3. 皮肤生物材料研究皮肤生物材料研究是一种将生物材料应用于皮肤修复和再生的实验方法。
通过生物材料的应用，可以促进皮肤创面的愈合，并提高修复效果。
这项技术不仅可以用于治疗创伤性皮肤损伤，还可以用于改善皮肤老化等问题。
科学家们在不断研究和改进生物材料，并不断寻找新的应用领域，以实现对皮肤的更好保护和修复。
第三部分：生物科学实验的意义和前景生物科学实验在皮肤研究中的应用无疑是非常重要的。
【课题申报】烧伤后皮肤再生的生长因子研究
烧伤后皮肤再生的生长因子研究课题申报书烧伤后皮肤再生的生长因子研究一、研究背景与目的烧伤是一种严重的创伤，会造成皮肤的广泛破坏和严重功能障碍。
皮肤再生与愈合是烧伤患者恢复功能和外貌的关键过程。
生长因子在皮肤再生中起到重要作用，通过调控细胞增殖、分化和迁移等机制，促进皮肤愈合。
然而，当前尚不清楚在烧伤后皮肤再生过程中，生长因子的具体作用机制以及其在治疗中的应用价值。
因此，本课题旨在探索烧伤后皮肤再生的生长因子的作用机制和疗效，为烧伤患者恢复功能和外貌提供新的治疗策略。
二、研究内容与方法1. 研究内容（1）研究不同类型烧伤对生长因子表达的影响：通过动物实验模型，模拟不同类型的烧伤，检测在烧伤后皮肤组织中生长因子的表达情况，并定量分析不同类型烧伤对生长因子表达的影响。
（2）研究生长因子在烧伤后皮肤再生中的作用机制：通过细胞培养实验，观察生长因子对烧伤后皮肤细胞增殖、分化和迁移等生物学行为的影响，探索生长因子促进皮肤再生的分子机制。
（3）研究生长因子在烧伤治疗中的应用价值：运用生长因子治疗不同程度烧伤的实验模型，观察生长因子的疗效，并分析其在烧伤治疗中的应用潜力。
2. 研究方法（1）动物实验模型：使用实验动物制造不同类型的烧伤模型，如热烧伤、化学烧伤等，观察皮肤组织中生长因子的表达情况。
（2）细胞培养实验：培养皮肤细胞，如角质形成细胞、表皮细胞等，利用细胞生物学技术观察生长因子对皮肤细胞生物学行为的影响。
（3）生长因子治疗实验：将生长因子应用于不同程度的烧伤模型治疗，观察其治疗效果并记录生物学变化。
三、研究意义与创新点1. 研究意义（1）深入探究烧伤后皮肤再生的生长因子作用机制，揭示烧伤后皮肤再生的分子机制，为烧伤治疗提供新的思路和策略。
（2）拓宽对生长因子在皮肤再生中的应用价值的认识，为烧伤患者选择恰当的治疗方法提供科学依据。
2. 创新点（1）系统调查不同类型烧伤对生长因子表达的影响，为进一步研究生长因子在皮肤再生中的作用机制打下基础。
人皮肤细胞传代培养技术及应用
人皮肤细胞传代培养技术及应用人类皮肤细胞是身体最外层的组织之一，它在保护机体免受环境伤害和疾病方面扮演着至关重要的角色。
传统上，研究皮肤细胞是通过实验动物的皮肤来获得，然而动物及其皮肤在某些方面与人类存在较大差异，因此我们需要一种新的皮肤细胞研究方法。
传代培养技术是这一问题的解决方案。
传代培养是指将原始细胞从体内分离出来，并在培养皿中使其不断分裂增殖，形成连续的细胞群体，这些群体称为“传代细胞株”。
通过传代细胞培养，可以快速得到较大数量的皮肤细胞，并对细胞行可靠的试验和观察。
一般来说，传代培养要求以下三个化学物质：一种营养液，一种切断细胞连接物的酶以及一种供给能量的物质（例如葡萄糖）。
当营养液加入到细胞上时，细胞将停滞在表面，此时添加酶，用于切断与周围细胞的连接。
一旦细胞之间的联系被切断，细胞就会开始分离，这时候加入葡萄糖便可让细胞保持生存并继续增殖。
传代细胞株与原始细胞有一些区别。
首先，传代细胞株一般来说失去了原始细胞的基础状态，它们的形态、生长特性、信号传导和分化潜能可能都发生了变化。
因此，在使用传代细胞进行研究时，需要特别注意这些差异，并尽可能地在研究中掌握它们的影响。
其次，传代细胞株通常已遭受了较为严重的遗传变异。
为了更好地维护细胞的稳定遗传基础，研究者可以采用不同代数（可达到40代）的细胞株进行研究，并逐步比较它们的遗传学和表型学差异。
传代细胞培养技术在研究干细胞、抗衰老、癌症、脂质代谢等领域中发挥了重要的作用。
例如在肝脏再生和移植研究中，肝细胞移植的现有技术不仅很难育出数量足够的细胞，还存在很高的死亡率。
而通过针对不同化学物质的覆盖和排除，传代培养技术既可提高细胞存活率，又能增加细胞的增殖能力和特定表型的维持，这进一步推动了肝脏器官重新生长的研究。
此外，传代培养技术在研究衰老机理和神经退行性疾病的发展中也具有重要作用。
在这些研究中，研究者可以采用传代细胞株模拟和跟踪人类自然衰老过程中的变化和影响，这使得我们能够更好地理解衰老和疾病的发生机理及治疗方案。
皮肤鳞癌实验报告
一、实验背景皮肤鳞癌是一种常见的皮肤恶性肿瘤，其发生与多种因素有关，包括遗传、环境、免疫状态等。
为了研究皮肤鳞癌的发生发展机制，本实验通过体外细胞培养和分子生物学技术，对皮肤鳞癌细胞进行了一系列的实验研究。
二、实验材料与方法1. 细胞培养- 细胞来源：取自皮肤鳞癌患者手术切除的肿瘤组织，经过组织块培养和细胞传代，获得皮肤鳞癌细胞系。
- 培养条件：细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。
2. 分子生物学技术- 实验试剂：PCR试剂盒、引物、DNA提取试剂盒、限制性内切酶、T4连接酶、DNA marker等。
- 实验方法：- DNA提取：采用DNA提取试剂盒提取细胞总DNA。
- PCR扩增：根据目的基因设计特异性引物，进行PCR扩增。
- 限制性内切酶消化：对PCR产物进行限制性内切酶消化。
- DNA连接：将酶切后的目的基因片段与载体连接。
- 转化与筛选：将连接产物转化大肠杆菌，进行菌落筛选。
- 阳性克隆鉴定：通过PCR和测序对阳性克隆进行鉴定。
3. 细胞功能检测- 细胞增殖：采用CCK-8法检测细胞增殖能力。
- 细胞迁移与侵袭：采用Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力。
- 细胞凋亡：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。
三、实验结果1. DNA提取与PCR扩增- 成功提取皮肤鳞癌细胞总DNA。
- 通过PCR扩增，获得目的基因片段。
2. 限制性内切酶消化与DNA连接- 对PCR产物进行限制性内切酶消化，获得酶切位点。
- 将酶切后的目的基因片段与载体连接。
3. 转化与筛选- 将连接产物转化大肠杆菌，进行菌落筛选。
- 通过PCR和测序对阳性克隆进行鉴定，成功获得目的基因克隆。
4. 细胞功能检测- 细胞增殖：与正常细胞相比，皮肤鳞癌细胞增殖能力明显增强。
- 细胞迁移与侵袭：与正常细胞相比，皮肤鳞癌细胞迁移和侵袭能力明显增强。
- 细胞凋亡：与正常细胞相比，皮肤鳞癌细胞凋亡率明显降低。
皮肤科科研方法与案例研究
皮肤科科研方法与案例研究在皮肤科领域，科研方法和案例研究是推动医学进步和改善患者生活质量的重要手段。
本文将介绍皮肤科科研的一些常用方法，并举例说明其在实际案例中的应用。
一、实验研究方法1. 细胞培养实验细胞培养实验是皮肤科研究中常用的基础实验方法之一。
研究人员可以通过培养人体皮肤细胞，在体外模拟皮肤生理和病理过程，进一步探究相关机制。
例如，利用细胞培养实验可以研究皮肤细胞对特定刺激的反应，如细胞的增殖、分化和表达特定蛋白等。
2. 动物模型实验动物模型实验在皮肤科研究中具有重要价值。
通过建立与人类皮肤相关的动物模型，研究人员可以模拟人类皮肤疾病的发生、发展和治疗过程。
例如，在研究皮肤癌方面，可以利用小鼠模型观察肿瘤的形成和治疗效果。
3. 临床试验临床试验是将科研成果应用到实际临床治疗中的重要环节。
通过对患者进行临床观察和对比，研究人员可以评估新的治疗方法、药物或治疗方案的疗效和安全性。
临床试验需要严格控制实验条件和样本数目，保证研究结果的可信性。
二、基因研究方法1. 基因测序基因测序是皮肤科研究中常用的技术手段之一。
通过对疾病相关基因进行测序，研究人员可以了解与皮肤疾病相关的遗传变异。
这有助于揭示不同基因对皮肤病发生发展的影响，以及潜在的治疗靶点。
2. 基因编辑技术基因编辑技术如CRISPR/Cas9的应用，在皮肤科研究中具有革命性的意义。
通过编辑特定基因，研究人员可以模拟某些皮肤疾病的发生机制，探寻潜在的治疗途径。
例如，利用基因编辑技术可以研究皮肤白癜风等疾病的发生机制和潜在治疗方法。
三、案例研究1. 皮肤损伤案例研究皮肤损伤是临床皮肤科中的常见问题之一。
通过对不同类型的皮肤损伤案例进行研究，可以了解不同损伤类型的特点和治疗手段。
例如，对于烫伤患者，可以通过研究不同烫伤程度的治疗结果，提出更有效的治疗策略。
2. 皮肤疾病治疗案例研究皮肤科研究中的另一个重要方向是不同皮肤疾病的治疗研究。
通过对患者的病例进行观察和分析，可以评估不同治疗方法的疗效和副作用。
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皮肤细胞培养影响因素的探究陕西师范大学朱影，张瑞，李晓，张晓，张秀秀（1.朱影陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；2.张瑞张晓张秀秀李晓陕西师范大学理工科基础教学部陕西省西安市 710062；）指导老师：吴民耀副教授【摘要】：近年来,随着成体干细胞研究的不断深入,人们己能在体外分离纯化、鉴别,扩增和培养多种组织干细胞,其中包括从皮肤表皮基底层分离的表皮干细胞、以及从毛囊隆突处分离的毛囊干细胞等皮肤类干细胞。
皮肤类干细胞具慢周期、聚集性的特点,能维持和修复皮肤组织损伤的功能。
然而影响干细胞培养的因素很多，本实验分别从不同消毒处理对细胞培养的影响、不同培养基对细胞培养的影响、不同血清浓度对细胞培养的影响等方面对影响干细胞培养的多个因素进行了探究。
【关键词】：大鲵干细胞培养1.皮肤类干细胞的来源目前,上皮干细胞、表皮干细胞,角质化细胞,角阮干细胞,皮肤类干细胞,皮肤类干细胞,毛囊干细胞(英文名称主要有Epidermal stem cell、Keratinize stem cell、Skin Stem cell及Hair follicle stem cell)等虽然名称不一,但都源于皮肤组织,所以我们将其统称为皮肤类干细胞。
对于皮肤类干细胞的来源,科学家们从各自的实验证据提出了不同的观点:一种认为毛囊处存在可供毛囊再发生的干细胞,在很长一段时间内,毛球部区域被认为是毛囊干细胞存在的部位,但近年来又有人提出“隆突激活假说”,认为毛囊上皮干细胞位于毛囊外根鞘部的隆突部。
Taylor等认为毛囊是角阮干细胞(keratinize stem cell)主要来源,毛囊干细胞不仅能形成毛发,而且可以形成表皮。
Oshima等指出,存在于小鼠触须毛囊外根鞘部的多能干细胞能分化产生构建表皮、皮脂腺和毛囊等所需的各种类型的细胞。
另一种观点认为,哺乳动物及人的表皮基底层细胞具有干细胞特性。
20世纪70年代末提出的“表皮增殖单位”学说认为,构成表皮细胞柱基底层有8~10个有分裂能力的细胞,其中央有一个原始干细胞,由这个干细胞产生这个柱的所有细胞。
Bickenbach(1981)首次利用3H一TdR标记了鼠皮肤中的这种细胞,证明这种细胞是一种细胞标记滞留细胞,在体内表现为慢周期性,这一传统的标记方法一直被研究毛囊干细胞和表皮干细胞的学者应用。
Slacken以为成年哺乳动物及人类上皮组织中均有多能干细胞存在。
关于毛囊千细胞与表皮干细胞是否同源是近年来科学家们所关注的焦点。
Laver等指出,毛囊和表皮两种结构中只有一种根本的表皮干细胞,它具有形成皮肤和毛发的功能。
因没有系统的鉴定方法,还不能明确指出这类干细胞的确切来源。
2.皮肤类干细胞的生物学特性目前研究较为深入的皮肤类干细胞是表皮干细胞。
根据细胞的不同分裂增殖能力.表皮干细胞存在三种状态:干细胞(keratinocyte stem cell KSC)、短暂扩增细胞(transit ampilifying cell T A细胞)和分化细胞(postmitotic differentiating cell PMD细胞)。
干细胞属于不对称分裂细胞,具有无限增殖分化能力;短暂扩增细胞是干细胞的子细胞,经过几代分裂后便形成分化细胞;分化细胞属成熟细胞。
正常情况下,每肴、表皮千细胞进行不对称分裂,产生干细胞和短暂扩增细胞,维持皮肤的正常功能。
于细胞、短暂扩增细胞和终末分化细胞分布于表皮不同的空间结构中,形成一定的空间结构,称为表皮增殖单位(Epidermal proliferation unit EPU)并呈现出一定的梯度变化,即表皮干细胞一T A细胞一终末分化细胞。
在表皮组织受损伤时,干细胞则可对称分裂,分裂一次可产生两个干细胞或两个祖细胞,从而可大量增加干细胞以及分化细胞的数量,更好地适应机体的需要。
表皮干细胞具有两个明显的特征:慢周期性和高度的增殖潜能。
慢周期性体现在进行体内细胞周期标记试验时表现为标记物保留细胞LRCS,增殖潜性能则体现为体外培养时呈克隆性生长。
在显微镜下,表皮干细胞形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,用流式细胞仪分析,体内的表皮干细胞多处于G0\G1期,其分裂增殖活动相对静止。
在活体内注射H3标记的脱氧胸普或澳化脱氧尿普后,其标记可在表皮干细胞中长期保持不变,而其他如T A细胞等随着细胞的不断分裂增殖其标记很快被稀释并逐渐消失。
表皮干细胞的另外一个特点是对基底膜具有茹附性。
在体内,表皮下细胞在整合素、连接素等表面茹附因子的介导下通过半桥粒茹附在基底膜上,离体只,大多数表皮干细胞在10min之内即勃附到胶原等细胞外基质上,而大多数T A细胞的勃附则发生在20一60min,所以可以根据干细胞的豁附性来进行鉴定。
表皮干细胞相对数量很少,Kolodka等研究表明,人和鼠的皮肤中,约有10%的基底层细胞为表皮干细胞。
但最近的研究表明将能快速粘附到Ⅳ型胶原上的10%的基底细胞仅仅有40%的细胞可以形成大克隆,表明基底细胞中仅有4%为表皮干细胞。
表皮干细胞属于全克隆细胞,在组织损伤或体外培养等条件下表现出持久的增殖能力和强大的克隆形成能力,一个干细胞形成的克隆细胞数可达5000以上,而T A细胞则为部分克隆细胞,多数T A细胞克隆数少于32个细胞。
表皮干细胞形成的克隆明显大于短暂扩增细胞的克隆。
在体内呈慢周期性,体外培养呈克隆性生长是分离鉴定皮肤类干细胞的最经典的方法,一直沿用至今。
3、不同消毒处理对细胞培养的影响皮肤直接与外界接触,一般在野外进行采样,易污染;加之一般是活体采样,对象多为育种价值高或珍贵稀有的动物,为了减少采样造成的应激、降低对其健康状况和应用价值的影响,所取的组织块都很小;所以为了提高培养的成功率,一般采用组织块法进行原代培养。
本试验以小鼠尾尖皮肤组织为研究对象作为预实验，比较不同消毒处理及培养方法的优缺点,选择合适的消毒处理及培养方法。
以免消毒处理不当，对珍贵的大鲵皮肤实验材料造成浪费。
3.1试剂OEME(高糖);新生牛血清(NCS);0.25%胰蛋白酶;0.1%胶原酶;1%新洁尔灭;1‰新洁尔灭;75%乙醇;70%乙醇;乙醚;双抗:青霉素8×104IU•ml -1链霉素1×105 IU•ml -13.2试验方法①采样前的消毒处理:用乙醚将小鼠进行麻醉后,用清水擦洗尾部并刮毛后,采用75%乙醇或l%新洁尔灭溶液擦洗多次,然后进行碘酒消毒、75%乙醇脱碘。
②采样用无菌剪刀剪断鼠尾,置无菌培养皿中,转移至无菌操作台上。
③采样后的消毒处理在无菌操作台上,进行消毒处理,主要方法有:A.70%乙醉浸泡30s;B.70%乙醇浸泡5min;C 1‰.新洁尔灭浸泡5min;D.双抗浸泡10min。
④接种培养消毒处理后,用PBS洗涤4~5次,将皮肤与软骨分离开,将皮肤组织剪成约1mm3的小块,自然沉降洗涤2次,然后进行组织块培养,观察消毒效果。
表1不同消毒效果的无菌效果比较Comparison of asepsis effect of different disinfectant methods组别Group消毒处理Disinfectant methods 消毒效果Effect of disinfection洗涤W ashing浸泡Marinate浸泡时间Time ofmarinate感染Infection无菌Disfection细胞生长情况Grouth ofcell1 75%乙醇75%乙醇30s5min 5111无细胞长出无细胞长出2 75%乙醇1%新洁尔灭5min3 无细胞长出3 75%乙醇双抗10min 2 有细胞长出但生长不良4 1%新洁尔灭1%新洁尔灭5min 4 生长良好5 1%新洁尔灭双抗10min 7 生长良好3.3不同消毒处理的效果从表可见联合使用乙醇与碘酒、双抗的消毒效果不理想,消毒不彻底或细胞生长不良;新洁尔灭与碘酒、双抗联合使用的消毒效果比较好,消毒彻底,且细胞生长良好,对时间要求不严格,操作简单方便。
要配制不同抗生素含量的PBS,在洗涤皮肤组织块时也需要不停更换PBS,操作比较繁琐。
本试验结果表明,采用高浓度双抗浸泡10而n或1%o新洁尔灭浸泡5min,均能达到较好的消毒效果,且对细胞的损伤较小,细胞生长良好。
该消毒方法能克服乙醇浸泡对时间要求的紧迫性,简化了操作步骤,又可省去配制和使用含不同抗生素浓度的PBS 的繁琐,值得推广和应用。
4四种不同培养基对细胞的影响用四种不同的基本培养液培养细胞,在培养的第6天消化收集细胞进行计数,,①培养液准备根据试验用四蒸水配制以下培养液I:TCM199+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;11:DMEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两霉素;111:DMEM/F12+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素;IV:Fl2+100IU/青霉素+100IU/ml链霉素+100IU/ml两性霉素。
取第四代长成单层的细胞用消化液消化后,将细胞悬液分为相同的I、Ⅱ、Ⅲ、IV四个部分,分别离心10min,弃去上清液。
四部分分别用基本培养液I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ调整浓度为4x104cells·ml-1。
接种24孔培养板,每孔1mL,共接三孔,37℃，5％CO，饱和湿度下静置培养,24h后分别换与原接种培养液相同的培养液一次,以后每两天换液一次,于培养的第六天收集细胞进行计数。
表2基础培养液TCM199 DMEM DMEM/F12 F12计数器1 17.08 19.5 17.10 16.05计数器2 16.95 19.85 16.80 15.90计数器3 17.20 19.29 16.75 15.98接种细胞数(D0) 2.45 2.45 2.45 2.45群体倍增值（X） 2.857 2.997 2.785 2.7065.血清浓度对细胞生长的影响在添加5mM Hepes的DMEM基本培养液中,分别添加10％、15％、20％的胎鼠血清,分组培养纯化皮肤成纤维细胞。
培养的第六天,用台盼蓝染色,在血球计数板上进行细胞计数,以各组细胞的平均值评估其作用。
以低糖DMEM为基本培养液,在添加血清、Hepes的同时添加不同剂量的EGF、IGF一l,分组培养,在培养的第六天各取三瓶进行计数,以细胞生长倍增值为准,评估生物活性因子对皮肤成纤维细胞生长的影响。
以DMEM为基础培养液,分别添加不同浓度的血清,培养皮肤成纤维细胞,培养后第6天进行细胞计数,结果表明,添加10%,15%,20%FCS对细胞生长的影响是,随着血清浓度升高细胞生长呈渐增趋势,但无显著差别(P＞0.05)。