第五章第二节

通过诱变处理，使调节基因发生突变，不产生有活性的阻遏蛋白，或者操纵基因发生 突变不再能与阻遏物相结合，都可达到此目的。组成型突变株在没有诱导物存在的情况 下就能正常地合成诱导酶。故可以利用一些易同化碳源或价廉易得的碳源为基质生产所 需的诱导酶类。 已设计出多种选育组成型突变株的方法， 其主要原则是创造一种利于组成型菌株生长 而不利于诱导型菌株生长的培养条件，造成对组成型的选择优势以及适当的识别两类菌 落的方法，从而把产生的组成型突变株选择出来。 筛选方法 1——限量诱导物恒化培养
在工业微生物育种中，可利用营养缺陷型来阻断代谢流或切断支路代谢。使代谢途径 朝着有益产物合成方向进行。如赖氨酸高产菌的选育。如下图所示，谷氨酸棒杆菌的代 谢调节和赖氨酸的生产：
一方面天冬氨酸除合成赖氨酸外，还合成苏氨酸和甲硫氨酸；另一方面赖氨酸和苏氨 酸对天冬氨酸激酶有协同反馈抑制作用； 因此正常的细胞内难以积累较高浓度的赖氨酸。 为了解除正常的调节以获得赖氨酸的高产菌株，可以选育谷氨酸棒杆菌的高丝氨酸缺陷 型作为赖氨酸的发酵菌种。该缺陷型不能合成高丝氨酸脱氢酶(HSDH)，不能合成高丝氨 酸，也不能合成苏氨酸和蛋氨酸。在补充适量高丝氨酸(或苏氨酸和蛋氨酸)条件下，菌株 能大量产生赖氨酸。
3、细胞膜透性突变株的选育 细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和 产物分泌。如果细胞膜通透性很强，则细胞内代谢物质容易往外分泌，降低胞内产物的 浓度，直到环境中该物质的浓度达到抑制程度，胞内合成才会停止，这样大大提高产物 的生成量。反之，细胞膜通透性较差，则胞内代谢产物难以分泌到胞外，使胞内终产物 浓度大量增加而引起反馈调节，影响终产物的积累。
第二节
微生物代谢产物的过量产生
工业发酵的目的就是大量地积累人们所需要的微生物代谢产物。 在正常生理条件下, 微 生物总是通过其代谢调节系统最经济地吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长 和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物。人为地打破微生物的代 谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行，这就是所谓代谢控制发酵。虽 然微生物代谢调节的理论目前还有很大的局限性，但它已在微生物育种和发酵工艺的优 化中发挥了重要的作用。随着代谢调节理论的不断充实和完善，代谢的人工控制将对发 酵工业发挥更加重要的作用。
如果结构类似物与调节酶相结合，所获得的便是抗反馈抑制的抗性菌株。筛选抗阻 遏和抗反馈的双重突变则更易于获得高产菌株。对一末端产物的生成途径了解的愈加清 楚，就能定向选育多重突变株，而得到过量生产。 对于生物合成途径已弄清的目的产物， 特别是氨基酸、 核苷酸来说， 当不能从野生型、 营养缺陷型得到生产菌株时，抗结构类似物突变株更为重要。现在许多氨基酸、嘌呤、 嘧啶和维生素的结构类似物已用于氨基酸、核苷、核苷酸和维生素高产菌株的育种工作。 如下表所示。
第一部分 提高初级代谢产物产量的方法 一、对诱导调节的控制 1.提供诱导——添加底物类似物 与糖类和蛋白质降解有关的水解酶类大都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就 会增加胞外酶的产量。如加入槐糖(1，2—β—D—葡二糖)诱导木霉菌的纤维素酶的生成， 木糖诱导半纤维素酶和葡萄糖异构酶的生成等。 底物类似物不易被所形成的酶分解，始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成， 获得较高浓度的酶。如用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导β-半乳糖苷酶的合成。 底物易被所形成的酶分解，使底物浓度逐渐下降，诱导强度也逐渐降低。 需要不断 补加底物（分批补料或流加补料） ，增加发酵工艺的复杂性。 底物能被迅速利用时，会发生酶合成的阻遏。底物能被迅速利用时，会发生酶合成的 阻遏，这在纤维二糖对纤维素酶的产生，木二糖对半纤维素酶产生中都己观察到，这也 是使用诱导物时应予注意的。 2.解除诱导/选育组成型突变株 在发酵工业中，要选择到一种廉价、高效的诱导物是不容易的，分批限量加入诱导物 在工艺上也多不便，更为有效的方法是改变菌株的遗传特性，除去对诱导物的需要，即 选育组成型突变株。 组成型突变株：操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也 能正常合成诱导酶的调节突变型，称为组成型突变株。
� 中间产物 C 不再转变成中间物 D 和末端产物 E � E 的营养缺陷型不能合成末端产物 E，所以就解除了 E 对 Ea 和 Eb 的反馈调节。 � 提供低浓度的、不足以引起反馈调节的物质 E，就能积累高浓度的中间产物 C。
（2）利用营养缺陷型积累分支代谢途径中间产物： 末端产物 L 和 N 对酶 a 有协同反馈调节;此外， L 抑制酶 J1，N 抑制酶 J2。 � 选用缺失酶 J1 的突变株，则 L 的合成受阻。L 和 N 对酶 a 的协同反馈被解除。 � 酶 J2 还受到末端产 N 的反馈调节，只有少量的 J 能转变成 N，于是中间产物 J 大 量积累。
（2）从营养缺陷型的回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株 营养缺陷型是通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能 力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。筛选营养缺陷 型的回复突变株也能获得抗反馈的突变菌株。机制如下：
反馈阻遏/抑制 Ea Eb Ec Ed
2、选育抗反馈调节的突变株 在以积累末端产物为目的的发酵生产中， 如果代谢途径无分支，营养缺陷型突变株 的应用并不普遍。因此提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。 抗反馈调节突变株指反 馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除的组成型菌株，能分泌大量的末 端代谢产物。 从遗传学角度来考虑，如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活；不能与末端分 解代谢产物结合，或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢 阻遏的突变株。前者为隐性突变，后者为显性突变，都能由此导致酶的过量产生。抗反 馈调节突变株的选育方法有两种：终产物结构类似物抗性突变株、营养缺陷型回复突变 株。 （1）终产物结构类似物抗性突变株的筛选 结构类似物也称代谢拮抗物，指那些在结构上和代谢终产物 (氨基酸、嘌呤、维生素 等)相似的物质。结构类似物和终产物结构相似，能够引起反馈阻遏 (抑制)；但不能正常 参与蛋白质的合成，或只能合成无活性的蛋白质。 终产物结构类似物抗性突变株的筛选机制： 正常情况下， 代谢末端产物氨基酸 A 是菌体蛋白的必需组成成分， 它能反馈阻遏或抑 制合成它的有关酶。它的结构类似物 A’在空间结构上与之相似，也能象 A 一样与原阻 遏物或调节酶的调节亚基结合，从而发生阻遏或抑制作用。但 A’不能正常参与蛋白质 的合成，或只能合成无活性的蛋白质。 但如果突变株解除了反馈控制，即末端产物氨基酸 A 无法与原阻遏物或调节亚基结 合，那么 A’也就无法起反馈调节作用，A’的毒害作用就表现不出来。我们说该菌株对 A’有抗性而得以生存下来。根据以上原理，只要选取结构类似物抗性突变株，就有可能 得到解除了反馈调节的突变株。
（3）渗漏缺陷型的利用 渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是 酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。
渗漏缺陷型由于酶活力下降，不产生过量的末端产物 可以避开反馈 调节。但能合成微 量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应 的物质，就能积累所需的产物。 渗漏缺陷型的获得方法： 把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而又很小的菌落。
1 2
将野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。 由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用，所以诱导型的野生 型菌株不能生长。
3
组成型突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长。
筛选方法 2——利用鉴别性培养基 在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产 生酶，加入适当的底物进行反应显示酶活加以识别。使用酶解后可以有颜色变化的底物， 便于迅速捡出组成型菌落。如甘油培养基平板中培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶， 组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻硝基苯半乳糖苷，组成型菌株的菌落 由于能水解它而呈现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化。另如羧甲基纤维素被内切纤 维素酶水解后，由于暴露出更多的还原性末端而能被刚果红所染色。可由此方便地检出 纤维素酶产生菌。
细胞膜透性突变株的选育原理是采取生理学或遗传学方法，提高细胞膜的通透性， 使 胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外，达到解除末端产物反馈调节作用的目的。通常有三 种方法： 1) 生物素缺陷型突变株 生物素是脂肪酸生物合成中乙酰 CoA 羧化酶的辅基，该酶催化乙酰 CoA 的羧化生成 丙二酸单酰 CoA，进而合成细胞膜磷脂的主要成分脂肪酸。因此，诱变筛选生物素缺陷 型菌株，保证细胞的生长，控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的 通透性，影响到代谢产物的分泌。 例如在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的积累有明显的影响，只有把生物 素的浓度控制在适量情况下，才能大量分泌谷氨酸，若过量供给生物素，菌体内虽有大 量谷氨酸积累，但不能分泌到体外。当生物素含量为 2.5mg/ml 时，谷氨酸的产量最高， 继续增加生物素，谷氨酸产量反而下降。 当生物素含量较高时，添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青霉 素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶活性，结果引起其结构中肽桥间无法交联，造 成细胞壁缺损，这有利于代谢产物渗漏到胞外。 2) 油酸缺陷型突变株 油酸缺陷型突变株切断了油酸的后期合成 (丧失脂肪酸合成酶)，丧失了自身合成油酸 的能力，即丧失脂肪酸合成能力，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的渗透性。 通过控制培养基中油酸的含量，使磷脂合成量减少到正常量的 1/2 左右，细胞变形， 形成渗漏型的细胞，使谷氨酸大量累积。 3) 甘油缺陷型的突变株 甘油缺陷型的遗传障碍是丧失α-磷酸甘油脱氢酶，不能合成α-磷酸甘油和磷脂，必 须由外界供给甘油才能生长。在限量供给甘油的条件下．也可获得渗透型的细胞，有利 于产物的累积。
三、选育抗生素抗性突变株 抗生素种类繁多，其抑制微生物代谢的机制各不相同，一些主要抗生素的作用机制已 比较清楚。筛选抗生素抗性突变体，也能取得由此而改变代谢调节，获得过量生产的结 果。
衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的 α—淀粉酶的产 量较亲株提高了 5 倍，因为衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成，从而改变了枯草杆菌的 分泌机制。抗利福平的蜡状芽抱杆菌的无芽孢突变株的β—淀粉酶产量提高了 7 倍，这是 由于芽孢形成的延迟利于β—淀粉酶的形成， 而抗利福平的突变株往往失去了形成芽抱的 能力。谷氨酸捧杆菌的抗青霉素突变株的谷氨酸产量亦会增加。
四. 生物化学方法 以上都是通过诱变筛选，改变菌株的遗传学背景得到高产菌种，在实际生产上，不通 过遗传学方法也能改变菌株的调节机制，称为生物化学法。主要有四种方法。 1.提供诱导（见前） 2.提供前体物质绕过反馈控制点 3.控制培养基的成分 4.发酵与产物分离的过程耦合
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C
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E
a.通过突变，使途径中对反馈敏感的酶缺失，得到 E 的营养缺陷型突变株； b.利用基本培养基筛选回复突变株；得到的回复突变株有两种情况，一种是缺失的酶 完全回复了活性和对反馈的敏感，即与野生型菌株完全相同；另一种情况是缺失的酶回 复了活性，但调节亚基的调节功能没有回复，对反馈调节依然不敏感，这即是我们想要 的抗反馈突变株，该营养缺陷型回复突变株解除了对途径中调节酶的反馈调节。这样的 回复突变株便能过量地积累末端产物。
二、解除反馈调节 1.降低末端产物浓度 /选育营养缺陷型突变株 营养缺陷型菌株中，由于合成途径中某一步骤发生缺陷，终产物不能积累，因此可以 解除终产物的反馈调节。直线式的合成途径中，选育末端产物营养缺陷型的突变株，只 能累积中间代谢物。分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使另一分支途径 的末端产物得到累积。 （1）利用营养缺陷型积累直链代谢途径中间产物： � 诱变获得 E 的营养缺陷型(诱变使 EC 失活)。